CN110583625A - 一种脐带储存液 - Google Patents

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黄杰勇
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes

Abstract

本发明公开了一种脐带储存液，其包括CaCl2、MgCl2、葡萄糖以及PBS缓冲液。本发明利用PBS缓冲液、氯化钙、氯化镁以及葡萄糖这几种简单而细胞必需的成分组成一种能与DMEM媲美的低价的脐带储存液，本发明的脐带储存液可使脐带组织样品保持较长时间的活性，且该脐带储存液造价低廉，可以用于大规模地生产。

Description

一种脐带储存液
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脐带储存液。
背景技术
干细胞在生命科学、新药试验和疾病研究领域中具有巨大研究和应用价值。组织干细胞是在组织内具有自我更新能力及能分化产生一种或一种以上特化细胞的细胞类型。组织干细胞可以补充损伤的细胞和组织，起到机体修复功能，因此被广泛应用于再生替代治疗和药物筛选等领域。在不同组织干细胞类型中，具有广泛生物医学意义的包括骨髓干细胞和间充质干细胞，其中，间充质干细胞主要来源于骨髓、脐带、胎盘或脂肪。
目前在基础研究和临床研究领域，脐带组织样本的储存液主要为生理盐水(0.9％NaCl或PBS)或者DMEM培养基。然而，生理盐水在营养物质方面比较缺乏，使得脐带组织样本储存时间受限；而DMED培养基虽然含有多种适合细胞生长的成分，但是其价格昂贵，用于储存脐带组织样本相对浪费。因此，一种低价高效的脐带储存液，对于间充质干细胞的基础和应用研究，都至关重要。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种价格低廉且可较长时间储存脐带组织样本的脐带储存液。
本发明的技术方案如下：
一种脐带储存液，其中，包括CaCl2、MgCl2、葡萄糖以及PBS缓冲液。
所述的脐带储存液，其中，所述CaCl2的浓度为100-500mg/L。
所述的脐带储存液，其中，所述MgCl2的浓度为80-200mg/L。
所述的脐带储存液，其中，所述葡萄糖的浓度为800-4500mg/L。
有益效果：本发明利用PBS缓冲液、氯化钙、氯化镁以及葡萄糖这几种简单而细胞必需的成分组成一种能与DMEM媲美的低价的脐带储存液，本发明的脐带储存液可使脐带组织样品保持较长时间的活性，且该脐带储存液造价低廉，可以用于大规模地生产。
附图说明
图1为从本发明脐带储存液(CMGL)与培养基(DMEM)储存的脐带分离出的间充质干细胞的细胞数目统计图。
图2为从脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞的形态图(放大倍数100倍)。
图3为从DMED培养基储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞的形态图(放大倍数100倍)。
图4a为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达CD73-FITC分子标记的结果示意图。
图4b为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达CD90-FITC分子标记的结果示意图。
图4c为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达CD105-FITC分子标记的结果示意图。
图4d为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达CD45-FITC分子标记的结果示意图。
图4e为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达CD34-FITC分子标记的结果示意图。
图4f为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达CD19-FITC分子标记的结果示意图。
图4g为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达CD11b-FITC分子标记的结果示意图。
图4h为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后表达HLADR-FITC分子标记的结果示意图。
图5a为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后定向分化为脂肪细胞的形态示意图(放大倍数100倍)。
图5b为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后定向分化为成骨细胞的形态示意图(放大倍数100倍)。
图5c为从本实施例1脐带储存液(CMGL)储存的脐带组织中分离出的间充质干细胞，在培养5代后定向分化为软骨细胞的形态示意图(放大倍数100倍)。
具体实施方式
本发明提供一种脐带储存液，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
DMEM是一类含有氨基酸、维生素、丙酮酸、葡萄糖以及铁、钙等多种金属离子的培养基，其被广泛应用于疫苗生产、单一细胞以及各种初代病毒宿主细胞的细胞培养。显然DMED培养基含有多种适合细胞生长的成分，其显然也适用于储存脐带组织样本，然而DMED培养基的价格昂贵，用于储存脐带组织样本相对浪费。因此，一种低价高效的脐带储存液，对于间充质干细胞的基础和应用研究，都至关重要。
本实施例提供一种脐带储存液，其包括CaCl2、MgCl2、葡萄糖以及PBS缓冲液。本实施例提供的脐带储存液成分简单、造价低廉、易于大规模制备，所述脐带储存液可用于脐带组织样本的长途运输储存，并保持脐带组织细胞的较高活性，可供基础再生生物学研究以及临床再生医学研究使用。
具体来讲，在临床实践中，脐带样本一般都需要多过程和长时间地运输，胎儿出生后，其脐带组织样本脱离了人体和血液营养供应，若不提供营养液，所述脐带组织样本中的细胞将死亡。因此，脐带组织在脱离人体后需要放入储存液中，所述脐带组织间充质干细胞需通过渗透作用从储存液中获取营养。本实施例提供的脐带储存液包括CaCl2、MgCl2、葡萄糖以及PBS缓冲液，所述钙离子、镁离子以及葡萄糖是保持脐带间充质干细胞活性的关键要素。其中，葡萄糖是脐带组织间充质干细胞存活和生长的主要能量来源，所述钙离子和镁离子是脐带组织间充质干细胞内多种酶的激活剂，可以保持细胞核和细胞外多种酶的活力，从而使脐带组织样本在长时间内保持活性。本实施例利用磷酸缓冲液和氯化钙、氯化镁、葡萄糖这几种简单而细胞必需的成分造出一种能与DMEM媲美的低价的脐带储存液，该储存液造价低廉，可以用于大规模地制备。
在一些具体的实施方式中，所述钙离子和镁离子可激活促使脐带组织间充质干细胞迁移的基质金属蛋白酶。
在一些实施方式中，所述脐带储存液中CaCl2的浓度为100-500mg/L。所述钙离子在该浓度范围内，可使脐带储存液长时间储存脐带组织样品并保持活性。
在一些实施方式中，所述脐带储存液中MgCl2的浓度为80-200mg/L，所述镁离子在该浓度范围内，可使脐带储存液长时间储存脐带组织样品并保持活性。
在一些实施方式中，所述脐带储存液中葡萄糖的浓度为800-4500mg/L，所述葡萄糖在该浓度范围内，可使脐带储存液的能量充足，从而长时间储存脐带组织样品并保持活性。
在一些实施方式中，所述PBS缓冲液包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠以及氯化钠。在一些具体的实施方式中，所述脐带储存液中磷酸二氢钾的浓度为210mg/L，所述磷酸氢二钠的浓度为385mg/L，所述氯化钠的浓度为9000mg/L，本实施例提供的PBS缓冲液可使脐带储存液保持一定的渗透压力，促使脐带组织样品能够有效吸收储存液中的营养成分。
下面通过具体实施例对本发明一种脐带储存液做进一步的解释说明：
实施例1
一种脐带储存液(CMGL)，其包括浓度为200mg/L的氯化钙、100mg/L的氯化镁、2000mg/L的葡萄糖、210mg/L的磷酸二氢钾、385mg/L的磷酸氢二钠以及9000mg/L的氯化钠。
实施例2
一种脐带储存液(CMGL)，其包括浓度为100mg/L的氯化钙、200mg/L的氯化镁、800mg/L的葡萄糖、210mg/L的磷酸二氢钾、385mg/L的磷酸氢二钠以及9000mg/L的氯化钠。
实施例3
一种脐带储存液(CMGL)，其包括浓度为400mg/L的氯化钙、100mg/L的氯化镁、4000mg/L的葡萄糖、210mg/L的磷酸二氢钾、385mg/L的磷酸氢二钠以及9000mg/L的氯化钠。
将实施例1提供的脐带储存液(CMGL)与传统DMEM培养基同时储存脐带组织样本，分别在培养0小时，6小时和24小时时分离脐带组织中的间充质干细胞，并计算每克脐带组织中分离出的间充质干细胞数量，结果如图1所示，N.S.表示无显著性差异；从图1中可以看出，脐带储存液(CMGL)与传统DMEM培养基同时储存脐带组织样本时，两者在培养若干时间后的脐带组织中的间充质干细胞数量相差不大，即两者培养效果相仿。
将实施例1提供的脐带储存液(CMGL)与传统DMEM培养基同时储存脐带组织样本，在培养72h后从各自脐带组织中分离间充质干细胞，并观察其形态，结果如图2和图3所示，从图中可以看出，两者在培养72h后，脐带组织中的间充质干细胞在形态上无明显差异。
将实施例1提供的脐带储存液(CMG)储存脐带组织样本，将脐带组织在CMGL中储存分离获得MSC细胞培养5代后，用TrypLE(Gibco公司)消化为单细胞，用CD73-FITC,CD90-FITC,CD105-FITC,HLADR-FITC,CD45-FITC,CD34-FITC,CD19-FITC,CD11b-FITC和IgG-FITC冰浴标记30分钟后，用流式细胞仪检测MSC细胞表达分子标记的情况，结果如图4a-4h所示，从图中可以看出，利用本实施例CMGL储存的脐带组织，可以高效分离出间充质干细胞，其细胞表面标记符合间充质干细胞的国际定义。
将实施例提供的脐带储存液(CMG)储存脐带组织样本，在培养72h后从各自脐带组织中分离间充质干细胞，将所述间充质干细胞在培养5代后，分别用于脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的定向分化，其中，分化步骤和鉴定步骤按照通用试剂盒和标准程序进行，所用试剂盒为Adipogenesis Differentiation Kit(Gibco),Osteogenesis Differentiation Kit(Gibco),ChondrogenesisDifferentiation Kit(Gibco),和Human Mesenchymal Stem Cell FunctionalIdentifcation Kit(R&D Systems)，结果分别如图5a-5c所示，从图中可以看出，从本实施例提供的脐带储存液(CMG)储存的脐带组织分离出的间充质干细胞，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。
综上所述，发明利用PBS缓冲液、氯化钙、氯化镁以及葡萄糖这几种简单而细胞必需的成分组成一种能与DMEM媲美的低价的脐带储存液，本发明的脐带储存液可使脐带组织样品保持较长时间的活性，且该脐带储存液造价低廉，可以用于大规模地生产。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种脐带储存液，其特征在于，包括CaCl2、MgCl2、葡萄糖以及PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的脐带储存液，其特征在于，所述CaCl2的浓度为100-500mg/L。
3.根据权利要求1所述的脐带储存液，其特征在于，所述MgCl2的浓度为80-200mg/L。
4.根据权利要求1所述的脐带储存液，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为800-4500mg/L。
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