CN104928244A - 细胞培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞培养基及其制备方法和应用，所述细胞培养基含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。该细胞培养基未含有动物源成分，并且该培养基能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，同时该细胞培养基的制备方法步骤简单、原料易得；另外，该细胞培养基能够有效地将血管内皮细胞祖细胞诱导分化为血管内皮细胞。

Description

细胞培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及培养基，具体地，涉及一种细胞培养基及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞指的是能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的一种细胞。从干细胞在发育中所处的阶段来看，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell)。胚胎干细胞是一种多能干细胞(pluripotent stem cell)，可以无限增殖并分化成人体两百多种类型细胞、形成机体的组织和器官，即能分化成多种细胞和组织的潜能的干细胞。1981年Evans和Kaufman从小鼠内细胞团(inner cell mass，ICM)分离胚胎干细胞以来，ES细胞研究成为各国科学家研究的热点，近年来围绕干细胞定向分化成其它类型细胞的研究如雨后春笋般出现(1981；Nature292(5819):154-6)。1998年Thomson成功分离、培养人类胚胎干细胞，为干细胞的人类医学应用提供了可能(1998；Science 282(5391)：1145-7)。2006年日本京都大学的山中伸弥等率先报道了iPS细胞的研究(2006；Cell126(4):663-76)，他们通过向终端分化的小鼠表皮成纤维细胞中导入四种转录因子OSKM(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc),可以诱导终端分化的细胞成干细胞状态，即iPS细胞(induced pluripotent stem cell)，此后出现了各种制造iPS细胞的技术路径。人工诱导的多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的分化能力、表观遗传修饰和细胞形态等其他特征，为干细胞的研究提供了新的思路。

干细胞具有多种分化潜能，可以在体外长期保存，具有自我更新和无限增殖潜力。干细胞的这些特点为科学研究和医学应用提供了很好的细胞来源。目前干细胞主要研究与应用方向主要包括：1)细胞治疗，已有报道可以将干细胞定向分化成肝细胞(公告号为CN102666853A的专利)和心肌细胞(公告号为CN103602633A和CN104293730A的专利)等其他类型的细胞，为细胞治疗提供了大量的有生理功能的细胞来源；2)再生医学领域，传统再生医学如器官移植是通过供体者器官移植到受体体内，这种移植手段会产生很多问题，如免疫排斥反应和感染等。通过体外人工诱导病人自己的干细胞定向分化成成熟的具有生理功能的器官可以有效地解决这些负面效应，为再生医学提供新方法。3)药物开发，体外诱导干细胞定向分化成特定类型细胞后加入各种药物，研究药物对特定组织或细胞的毒性，节省大量研究成本，为临床应用提供大量数据。

血管是体内负责运输血液、氧气和营养物质等的重要通道，血管出现问题，可能造成组织和器官衰竭甚至坏死而危及生命，如血管内皮细胞损伤可以诱导高血压和冠心病等血管疾病的发生。心血管疾病是威胁人类健康的常见疾病，位于我国疾病发病率的首位。同时，科学研究也需要大量血管，为药物对血管组织损伤实验提供材料。另外，体外人造组织器官需要血管运输营养物质为器官生长提供养分。此外，临床和再生医学领域也迫切需要各种血管组织细胞。鉴于上述情况，如何在体外得到大量的血管组织细胞显得极为重要。多能干细胞能够为我们提供大量的种子细胞，可以定向分化成血管内皮细胞(endothelial cell)和祖细胞(endothelial progenitor cell)，从而能够为修复治疗提供大量细胞、为体外构建组织模型提供血管细胞来源，也能够为药物筛选和药物毒性研究提供很好的材料。

目前，多能干细胞的培养过程中使用的培养基中往往含有动物源成分，尤其是细胞内皮细胞祖细胞的培养基，如使用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞，Mouse Embryonic Fibroblast)滋养层细胞和培养基中的动物血清。虽然上述培养基可以保证干细胞及其诱导分化的细胞具有优异的自我更新能力，但是由于培养基中引入大量动物源性物质，给干细胞及其诱导分化的细胞自我更新及分化过程带来了不确定因素，增加了误差；同时可能引入动物源性污染，如支原体污染等；另外，在细胞治疗的过程中还会诱发免疫反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞培养基及其制备方法和应用，该细胞培养基未含有动物源成分，并且该培养基能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，同时该细胞培养基的制备方法步骤简单、原料易得；另外，该细胞培养基能够有效地将血管内皮细胞祖细胞诱导分化为血管内皮细胞。

为了实现上述目的，本发明提供了本发明提供了一种细胞培养基，含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。

本发明还提供了一种细胞培养基的制备方法，包括：

a、将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子混合得到混合物W1；

b、将混合物W1进行pH的调节制得混合物W2；

c、将混合物W2进行灭菌处理制得细胞培养基。

本发明进一步提供了上述的细胞培养基或者根据上述的方法制备而成的细胞培养基在将血管内皮细胞祖细胞诱导分化为血管内皮细胞中的应用。

通过上述技术方案，本发明提供的培养基通过DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子的协同作用以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境使得培养细胞具有优异的自我更新能力，同时该培养基中未使用动物源成分进而有效地规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。另外，该细胞培养基的制备方法步骤简单、原料易得。在上述内容的基础上，本发明提供的细胞培养基能够有效地将血管内皮细胞祖细胞诱导分化为血管内皮细胞，进而使得血管内皮细胞能够实现大规模的工业应用。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是人类多能干细胞的形态特征图；

图2是检测例1中基于CD31+CD34+表征细胞D1的形态特征图；

图3是检测例1中基于CD31+CD34-表征细胞E1的形态特征图；

图4是人类多能干细胞的细胞系图；

图5是检测例1中人类多能干细胞诱导分化后5天CD31和CD34的表达检测结果图；

图6是人类脐带血管内皮细胞系图(作为阳性对照)；

图7是检测例2中细胞D1的类血管网络生成结果图；

图8是检测例2中细胞E1的类血管网络生成结果图；

图9是检测例3中细胞E1与周细胞的共定位检测结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种细胞培养基，含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。

本发明提供的细胞培养基的各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了该细胞培养基能够为培养细胞提供更加充足的营养物质和更加稳定的生存环境，优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为1-100μg/ml，胰岛素的浓度为1-100μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，表皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为5-100ng/ml，硒酸钠的浓度为1-100μg/L，碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L。更优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为20-100μg/ml，胰岛素的浓度为5-50μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，表皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为5-50ng/ml，硒酸钠的浓度为1-50μg/L，碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L。进一步优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为50-100μg/ml，胰岛素的浓度为10-30μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml，硒酸钠的浓度为2-30μg/L，碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L。

在该细胞培养基中，成纤维细胞生长因子可以是本领域中任何一种常规的成纤维细胞生长因子，但是为了使得成纤维细胞生长因子能够起到更为优异的诱导调控的作用，优选地，成纤维细胞生长因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

同时，细胞培养基的pH可以在宽的范围内变化，但是为了进一步地保证培养细胞的环境稳定，优选地，细胞培养基的pH为7.5-8。

本发明还提供了一种细胞培养基的制备方法，包括：

a、将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子混合得到混合物W1；

b、将混合物W1进行pH的调节制得混合物W2；

c、将混合物W2进行灭菌处理制得细胞培养基。

在上述的制备方法中，各原料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了制得的细胞培养基能够为培养细胞提供更加充足的营养物质和更加稳定的生存环境，优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为1-100μg/ml，胰岛素的浓度为1-100μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，表皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为5-100ng/ml，硒酸钠的浓度为1-100μg/L，碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L。更优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为20-100μg/ml，胰岛素的浓度为5-50μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，表皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为5-50ng/ml，硒酸钠的浓度为1-50μg/L，碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L。进一步优选地，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，维生素C的浓度为50-100μg/ml，胰岛素的浓度为10-30μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml，硒酸钠的浓度为2-30μg/L，碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L。

在上述制备方法中，成纤维细胞生长因子可以是本领域中任何一种常规的成纤维细胞生长因子，但是为了使得成纤维细胞生长因子能够起到更为优异的诱导调控的作用，优选地，成纤维细胞生长因子选自碱性成纤维细胞生长因子。

在上述的步骤b中，pH的调节的方式较为多样，可以直接通过碱进行调节，也可以通过缓冲溶液进行调节，但是为了提高细胞培养基的制备效率，优选地，在步骤b中，pH的调节通过加碱进行，且混合物W2的pH为7.5-8。

另外，在上述步骤c中，灭菌可以是本领域中任何一种常规的灭菌方式，如射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌，从灭菌效果上考虑，优选采用湿热灭菌，更优选地，灭菌处理通过具有0.1-0.3μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。

本发明进一步提供了上述的细胞培养基或者根据上述的方法制备而成的细胞培养基在将血管内皮细胞祖细胞诱导分化为血管内皮细胞中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例和制备例中，DMEM培养为Thermo Fisher Scientific公司的市售品，F12培养基为ThermoFisher Scientific公司的市售品，维生素C，胰岛素为Sigma Aldrich公司的市售品，血管内皮生长因子为R&D Biosystems公司的市售品，转化生长因子β信号通路抑制剂为Sigma Aldrich公司牌号为SB431542的市售品，激活素A为R&D Biosystems公司的市售品，骨形成蛋白4为R&D Biosystems公司的市售品，糖原合成酶激酶-3为Sigma Aldrich公司的牌号为BIO的市售品，Rho相关的蛋白激酶(ROCK抑制剂)为Sigma Aldrich公司的牌号为Y27632的市售品，表皮生长因子为R&D Biosystems公司的市售品，成纤维细胞生长因子为R&D Biosystems公司的牌号为bFGF的市售品。

制备例1

1)将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、维生素C、碳酸氢钠、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)、糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)和糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)混合制得混合物W3；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：2，维生素C的浓度为50μg/ml，胰岛素的浓度为50μg/ml，激活素A的浓度为55ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为60ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)的浓度为30μM，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为BIO)的浓度为25μM，硒酸钠的浓度为20μg/L，碳酸氢钠的浓度为500mg/L。

2)将氢氧化钠加入至上述混合物W3中以将pH调至7.8制得混合物W4；

3)将上述混合物W4通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A1。

制备例2

按照制备例1的方法进行制得细胞培养基A2，所不同的是步骤1)中未使用Rho蛋白激酶抑制剂，并且Rho蛋白激酶抑制剂的浓度为10μM。

制备例3

a、将DMEM培养基、F12培养基、维生素C、硒酸钠、500mg碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子和牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂混合充分得到混合物W5；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：2，维生素C的浓度为50μg/ml，胰岛素的浓度为55μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为45ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为25μM，硒酸钠的浓度为20μg/L，碳酸氢钠的浓度为500mg/L。

b、将氢氧化钠加入至上述混合物W5中以将pH调至7.8制得混合物W6；

c、将上述混合物W6通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基B1。

制备例4

a、将DMEM培养基、F12培养基、维生素C、硒酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子(牌号为bFGF)混合得到混合物W1；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：2，维生素C的浓度为55μg/ml，胰岛素的浓度为60μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为65ng/ml，表皮生长因子的浓度为50ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为45ng/ml，硒酸钠的浓度为20μg/L，碳酸氢钠的浓度为500mg/L。

b、将氢氧化钠加入至上述混合物W1中以将pH调至7.8制得混合物W2；

c、将上述混合物W2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基C1。

制备例5

a、将DMEM培养基、F12培养基、维生素C、硒酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子(牌号为bFGF)混合得到混合物W1；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1，维生素C的浓度为2μg/ml，胰岛素的浓度为3μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为7ng/ml，表皮生长因子的浓度为8ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为8ng/ml，硒酸钠的浓度为2μg/L，碳酸氢钠的浓度为400mg/L。

b、将氢氧化钠加入至上述混合物W1中以将pH调至7.8制得混合物W2；

c、将上述混合物W2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基C2。

制备例6

a、将DMEM培养基、F12培养基、维生素C、硒酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子(牌号为bFGF)混合得到混合物W1；其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：4，维生素C的浓度为90μg/ml，胰岛素的浓度为100μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为95ng/ml，表皮生长因子的浓度为85ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为90ng/ml，硒酸钠的浓度为40μg/L，碳酸氢钠的浓度为600mg/L。

b、将氢氧化钠加入至上述混合物W1中以将pH调至7.8制得混合物W2；

c、将上述混合物W2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基C3。

实施例1

1)将培养皿用Matrigel基质胶进行包被(当然使用玻璃连粘蛋白Vitronection亦可)2h；然后在37℃的水浴中复苏冻存的人类多能干细胞，并将该细胞接种至上述培养基中，然后加入E8多能干细胞培养液(购自LifeTechnologies公司)在37℃下进行培养，并且每天更换培养基，直至多能干细胞增殖到80％融合度(confluency)时，接着以0.5mM EDTA(PH＝8.0，渗透压(Osmolarity)＝340mOsm)进行消化传代以保持了人多能干细胞细胞团的状态。当需要单细胞传代时，应用Trypsin酶(当然TrypLE Express酶也可以)消化，并向培养基中加入牌号为Y-27632的Rock抑制剂(工作浓度为10μM，提高细胞的存活率)培养24h。

2)去除培养基，以PBS缓冲溶液清洗3次，接着用Trypsin(胰蛋白酶)消化细胞5分钟至单细胞状态，以面积比1：8传至新的用Matrigel基质胶或者Vitronectin包被的培养皿中，加入细胞培养基A2在37℃下培养1天；接着更换细胞培养基A1在37℃下培养1天制得中内胚层前体细胞。

3)在37℃下，将上述中内胚层前体细胞于细胞培养基B1中培养3天得到细胞D1，其中，每天更换培养基。

4)在37℃下，将上述细胞D1于细胞培养基C1中培养5天得到细胞E1，其中，每天更换培养基。

实施例2

根据实施例1的方法进行培养得到细胞E2，所不同的是将细胞培养基C1换成细胞培养基C2。

实施例3

根据实施例1的方法进行培养得到细胞E3，所不同的是将细胞培养基C1换成细胞培养基C3。

对比例1

根据实施例1的方法进行培养得到细胞E4，所不同的是细胞培养基C1不含有表皮生长因子。

对比例2

根据实施例1的方法进行培养得到细胞E5，所不同的是细胞培养基C1不含有硒酸钠。

对比例3

根据实施例1的方法进行培养得到细胞E6，所不同的是细胞培养基C1不含有血管内皮生长因子。

检测例1

首先，用trypsin消化上述细胞D1或者细胞E1至单细胞状态，用PBS缓冲溶液轻轻摇晃重新悬浮并计数。取8万单细胞悬浮的细胞，800g离心3分钟，丢弃上清液，加入100ul含有1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲溶液，轻轻摇晃重新悬浮细胞。加入各个检测抗体(CD31和CD34)，轻轻混匀。在4℃下避光孵育30分钟；接着800g离心5分钟，丢弃上清，加入100ul含有1％BSA的PBS，轻轻摇晃重新悬浮细胞，最后流式细胞仪进行检测。检测结果见图2和图3。

其中，图1是人类多能干细胞的形态特征图，图2是基于CD31+CD34+表征细胞D1的形态特征图，图3是基于CD31+CD34-表征细胞E1的形态特征图，由图可知，细胞D1已成功诱导分化为血管内皮细胞祖细胞，细胞E1已成功诱导分化为血管内皮细胞。

图4是人类多能干细胞的细胞系图，图5是人类多能干细胞诱导分化后5天CD31和CD34的表达检测结果图，其中，CD31的抗体和PE荧光基团(Phycoerythrin)偶联，CD34的抗体和APC蛋白荧光基团(Allophycocyanin)偶联。由于CD31和CD34可以与血管内皮细胞及其祖细胞表面上的标记蛋白进行偶联，进而使得血管内皮细胞及其祖细胞表面获得荧光或磁性，从而使得血管内皮细胞及其祖细胞能够在流式细胞仪中被鉴定、分离或者富集。通过图4和图5可知，分化后的细胞中，一部分为CD31+CD34+表达的血管内皮细胞祖细胞，另一部分为CD31+CD34-表达的血管内皮细胞。

同样地，通过检测例1的方法可知，细胞E2-E3已成功诱导分化为血管内皮细胞，而细胞E4-E6未成功诱导分化为血管内皮细胞，从而说明本发明提供的培养基能够将多能干细胞成功地诱导分化为血管内皮细胞。

检测例2

首先，将Matrigel基质胶在4℃下孵育3小时使其成为流动状半固态，并放置于冰上。接着在细胞培养皿中铺设一层Matrigel基质胶，在37℃下待其凝固。将细胞D1或者细胞E1铺设在凝固后的Matrigel上，加入培养基以培养4天后通过显微镜观察类血管网络生成情况。检测结果见图7和图8。

其中，图6是人类脐带血管内皮细胞系图(作为阳性对照)，图7是细胞D1的类血管网络生成结果图，图8是细胞E1的类血管网络生成结果图。上述三图对照可知，细胞D1和E1均形成有与人类脐带血管内皮细胞相似的类似血管状的网格，进一步说明本发明提供的培养基能够将多能干细胞成功地诱导分化为血管内皮细胞。

同样地，通过检测例2的方法可知，细胞E2-E3形成有与人类脐带血管内皮细胞相似的类似血管状的网格，而细胞E4-E6未形成有与人类脐带血管内皮细胞相似的类似血管状的网格，从而进一步说明本发明提供的培养基能够将多能干细胞成功地诱导分化为血管内皮细胞。

检测例3

将细胞E1和周细胞共同在matrigel基质胶上共培养，结果见图9。由该图可知，细胞E1和周细胞形成类似血管状的网络，并且两种细胞有显著的共定位，显示了血管内皮细胞招募周细胞的功能，从而说明了本发明提供的细胞培养基培养制得的血管内皮细胞能够得以广泛应用。

同样地，通过检测例3的方法可知，细胞E2-E3能够与周细胞形成类似血管状的网络，并且两种细胞有显著的共定位；而细胞E4-E6未能与周细胞形成类似血管状的网络。从而进一步说明了本发明提供的细胞培养基培养制得的血管内皮细胞能够得以广泛应用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为1-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为1-100μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，所述表皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，所述成纤维细胞生长因子的浓度为5-100ng/ml，所述硒酸钠的浓度为1-100μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L；

优选地，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为20-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为5-50μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，所述表皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，所述成纤维细胞生长因子的浓度为5-50ng/ml，所述硒酸钠的浓度为1-50μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L；

更优选地，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为50-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为10-30μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，所述表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，所述成纤维细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml，所述硒酸钠的浓度为2-30μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，所述成纤维细胞生长因子选自碱性成纤维细胞生长因子。

4.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基的 pH为7.5-8。

5.一种细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

a、将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子混合得到混合物W1；

b、将所述混合物W1进行pH的调节制得混合物W2；

c、将所述混合物W2进行灭菌处理制得细胞培养基。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为1-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为1-100μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，所述表皮生长因子的浓度为5-100ng/ml，所述成纤维细胞生长因子的浓度为5-100ng/ml，所述硒酸钠的浓度为1-100μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L；

优选地，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为20-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为5-50μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，所述表皮生长因子的浓度为5-50ng/ml，所述成纤维细胞生长因子的浓度为5-50ng/ml，所述硒酸钠的浓度为1-50μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L；

更优选地，所述DMEM培养基与F12培养基的体积比为1：1-1：4，所述维生素C的浓度为50-100μg/ml，所述胰岛素的浓度为10-30μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，所述表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，所述成纤维细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml，所述硒酸钠的浓度为2-30μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L。

7.根据权利要求5或6所述的细胞培养基，其中，所述成纤维细胞生长因子选自碱性成纤维细胞生长因子。

8.根据权利要求5或6中任意一项所述的细胞培养基，其中，在步骤b中，所述pH的调节通过加入碱进行，且所述混合物W2的pH为7.5-8。

9.根据权利要求5或6中任意一项所述的细胞培养基，其中，所述灭菌通过具有0.1-0.3μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。

10.根据权利要求1-4中任意一项所述的细胞培养基或者根据权利要求5-9中任意一项所述的方法制备而成的细胞培养基在将血管内皮细胞祖细胞诱导分化为血管内皮细胞中的应用。