CN107326006A - 一种人胚胎干细胞分化为内皮细胞专用的培养基及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种商业用的人胚胎干细胞无血清分化培养基，由以下终浓度的成分构成：L‑谷氨酰胺2mmol/L、维甲酸浓度为3×10^‑9mol/L、转铁蛋白6mg/L、亚硒酸钠30mg/L和人表皮细胞生长因子:0.15mg/L，纤连蛋白:0.5mg/L，TGF‑β1其浓度为5ng/ml，细胞分化促进肽浓度为100ppm，用DMEM/F12(1：1)培养基进行配置。该分化培养基中由于不含有动物来源的血清，因此可以控制感染风险；在分化培养基中加入了特异性促进干细胞分化活性的小肽，使得细胞生长以及分化速度显著提高。

Description

一种人胚胎干细胞分化为内皮细胞专用的培养基及其方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养基技术领域，具体涉及一种人胚胎干细胞分化为内皮细胞专用的培养基及其方法。

背景技术

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，因为胚胎干细胞可以分化成多种功能的APSC多能细胞，被认为是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。由胚胎来源的原始(未分化)细胞，它们具有分化成为众多特异细胞类型的潜能。

胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。任何涉及丧失正常细胞的疾病，都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗。如用神经细胞治疗神经退行性疾病(帕金森病、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等)，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复坏死的心肌等。胚胎干细胞还是基因治疗最理想的靶细胞。这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到控制和治愈疾病的目的。这种遗传改造包括纠正病人体内存在的基因突变，或使所需基因信息传递到某些特定类型细胞。

CN 100465268 C中公开了一种人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基。该培养基配方为：N25-30mL，B2710-60mL，谷氨酰胺0.0146-0.73g，β-巯基乙醇5-10μl，非必需氨基酸中的一种或几种共计：3-30mL，碱性成纤维细胞生长因子20-200mg，小牛血清白蛋白0.2-0.8g；用DMEM/F12定容至1000mL，pH7.2-7.8。该培养基成分确定，且无任何动物来源的成分，使用安全性高。该方法并不能特异性的针对分化为内皮细胞的用途。

CN 103194423 B公开了用于体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的一组培养基和试剂盒，及其在体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞中的用途、体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法，以及内皮细胞或其衍生物。其中，该组培养基包括：第一培养基，其为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培养基；第二培养基，其为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的IMDM/F12培养基；以及第三培养基，其为EGM2培养基。利用本发明的该组培养基能够高效快速地诱导胚胎干细胞向内皮祖细胞及内皮细胞进行分化。但是该方法使用的培养基组分复杂，使用不方便，不适合大规模推广使用。

CN 1990858 A中公开了一种培养血管内皮细胞的方法涉及组织工程学中获得种子细胞的方法，本发明在基本上不含有动物血清的培养基中培养人胚胎干细胞，然后利用RA和TGF－β培养出血管内皮细胞，为组织工程化种子细胞的获得开辟了新的来源。但是该方法在转化率上同样也比较低，不适于大规模推广使用。

另外，在前期的研究发现培养诱导人胚胎干细胞分化为内皮细胞具有一定的优势，但是分化效率较低。诱导率以及分化时间都还有待进一步提高。

基于以上方法或培养基组成方面的不足，在利用培养基培养细胞在过程中，生长速度慢，容易出现老化的特征，从而影响细胞的大量扩增。而内皮细胞在用于临床治疗时对细胞数量有很大的要求，而且还必需在短时间内得到足够的细胞以满足治疗的需要，因此开发一种能够使得商用的人胚胎干细胞高质量的分化为内皮细胞变得迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供培养人商业用的胚胎干细胞无血清培养基，能够提高人胚胎干细胞地生长速度，提高分化扩增速率，同时保证干细胞和内皮细胞生物学特性。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是:提供一种商业用的人胚胎干细胞无血清分化培养基，其特征在于，由以下终浓度的成分构成：L-谷氨酰胺2mmol/L、维甲酸浓度为3×10^-9mol/L、转铁蛋白6mg/L、亚硒酸钠30mg/L和人表皮细胞生长因子:0.15mg/L，纤连蛋白:0.5mg/L，TGF-β1其浓度为5ng/ml，细胞分化促进肽(序列如SEQ ID NO：1或2所示)终浓度为100ppm，用DMEM/F12(1：1)培养基进行配置。

DMEM/F12(1：1)培养基采用DMEM和F12按溶液体积比1:1混合而成。

本发明另外提供一种培养胚胎干细胞的方法，首先制备MEF；其次，人胚胎干细胞的复苏、培养和传代；再次，人胚胎干细胞悬浮法制备EB以及分化；最后检测分化得到的内皮细胞状况。

采用本发明提供的制备方法，具有以下有益效果:

1、在分化培养基中由于不含有动物来源的血清，因此可以控制感染风险；

2、在分化培养基中加入了特异性促进干细胞分化活性的小肽，使得细胞生长以及分化速度显著提高；

3、制备得到的内皮细胞的生物学特性与自然内皮细胞相似，活性保持不变；

4、经过试验验证的内皮细胞在保持了较长的时间内的生物学特性不发生改变。而且细胞的分化效率以及成活率都较高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。

实施例1:第一种方法人胚胎干细胞的复苏、培养和传代培养；

(1)取商业购买的人胚胎干细胞系(H9)，购买自江苏斯坦福生物技术有限公司。在水浴锅内迅速融化(15s)，加入到含20mL人胚胎干细胞培养基(L-谷氨酰胺2mmol/L、维甲酸浓度为3×10^-9mol/L、转铁蛋白6mg/L、亚硒酸钠30mg/L和人表皮细胞生长因子:0.15mg/L，纤连蛋白:0.5mg/L，TGF-β1其浓度为5ng/ml，细胞分化促进肽(序列如SEQ ID NO：1所示)终浓度为100ppm，用DMEM/F12(1：1)培养基进行配置)的50mL离心管中，自然沉淀30min，吸去上清，用3mL培养基轻轻重悬沉淀后将重悬液加入到已经铺好MEF的0.1％明胶处理过的6cm培养皿中。当人胚胎干细胞的克隆长满后，用200U/mL胶原酶W，37℃处理lOmin后，挑起克隆碎片到MEF铺好的6孔板中培养。

(2)人胚胎干细胞悬浮法制备以及分化：人胚胎干细胞克隆用200U/mL胶原酶IV37℃处理10min后，挑起克隆碎片转移到低粘附性培养皿中，悬浮培养，悬浮培养基为：L-谷氨酰胺2mmol/L、维甲酸浓度为3×10^-9mol/L、转铁蛋白6mg/L、亚硒酸钠30mg/L和人表皮细胞生长因子:0.15mg/L，纤连蛋白:0.5mg/L，TGF-β1其浓度为5ng/ml，细胞分化促进肽(序列如SEQ ID NO：1所示)终浓度为100ppm，用DMEM/F12(1：1)培养基进行配置定容；4d后将细胞转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养(2EBs/cm2)(培养基成分同悬浮培养基)，每天观察内皮细胞情况，大约5-8d后收获细胞。

实施例2:第二种方法人胚胎干细胞的复苏、培养和传代培养；

(1)取商业购买的人胚胎干细胞系(H9)，购买自江苏斯坦福生物技术有限公司。在水浴锅内迅速融化(15s)，加入到含20mL人胚胎干细胞培养基(L-谷氨酰胺2mmol/L、维甲酸浓度为3×10^-9mol/L、转铁蛋白6mg/L、亚硒酸钠30mg/L和人表皮细胞生长因子:0.15mg/L，纤连蛋白:0.5mg/L，TGF-β1其浓度为5ng/ml，细胞分化促进肽(序列如SEQ ID NO：2所示)终浓度为100ppm，用DMEM/F12(1：1)培养基进行配置)的50mL离心管中，自然沉淀30min，吸去上清，用3mL培养基轻轻重悬沉淀后将重悬液加入到已经铺好MEF的0.1％明胶处理过的6cm培养皿中。当人胚胎干细胞的克隆长满后，用200U/mL胶原酶W，37℃处理lOmin后，挑起克隆碎片到MEF铺好的6孔板中培养。

(2)人胚胎干细胞悬浮法制备以及分化：人胚胎干细胞克隆用200U/mL胶原酶IV37℃处理10min后，挑起克隆碎片转移到低粘附性培养皿中，悬浮培养，悬浮培养基为：L-谷氨酰胺2mmol/L、维甲酸浓度为3×10^-9mol/L、转铁蛋白6mg/L、亚硒酸钠30mg/L和人表皮细胞生长因子:0.15mg/L，纤连蛋白:0.5mg/L，TGF-β1其浓度为5ng/ml，细胞分化促进肽(序列如SEQ ID NO：2所示)终浓度为100ppm，用DMEM/F12(1：1)培养基进行配置定容；4d后将细胞转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养(2EBs/cm²)(培养基成分同悬浮培养基)，每天观察内皮细胞情况，大约5-8d后收获细胞。

对照例采用文献“体外定向诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞及其与脐静脉内皮细胞的比较，汪雁归等，中南大学学报，2017年第4期，p374-379”中的方法作为作为对照，其中干细胞采用实施例1-2所使用的干细胞，具体实施步骤按照该文章记载的步骤和条件进行。

实施例3分化转化效率分析

从分化的第5天开始，每天检测分化细胞的表面标志物的表达情况。通过检测内皮细胞特异性标志物CD144的表达标志物，在分化的第1-4天几乎检测不任何CD 144的表达，但在第5天开始，CD144表达上调急剧上升，达到了内皮细胞的表达水平，这说明内皮细胞分化成功。通过逐天检测分化情况，第5-8天的内皮细胞转化率如下。

表1转化率表格

从表1的结果可以看出，在第6天即可实现基本最高值的转化效率，而且最终的转化效率达到接近97.6％，比现有技术有显著的提高，而且转化的方法简单，快捷，便于大规模操作。

实施例3内皮细胞凋亡检测

采用本领域常用的凋亡试剂盒检测各组内皮细胞凋亡比例。实施例1和2以及对照的方法制备得到的内皮细胞，分别将内皮细胞经24h缺氧处理后Hoechst 33258染色，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。随机选择10个高倍镜视野(x 100)进行统计，缺氧24h后内皮细胞的凋亡比例结果如下：

表2

	实施例1	实施例2	对照
				凋亡比例	2.7±0.5％	2.4±0.3％	16.4±0.3％

从检测结果可以看出，实施例1和2的方法得到的内皮细胞具有较好的细胞活性。这充分说明，本发明提供的活性肽培养基，特别是其中的活性肽能够高效的提高细胞的活性。另外，采用细胞耐久性试验，实施例1和2制备的人胚胎干细胞诱导出现的内皮细胞在体外可以维持内皮细胞活性4个月以上，具有较好的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉朱猛

〈120〉一种人胚胎干细胞分化为内皮细胞专用的培养基及其方法

〈160〉2

〈210〉1

〈211〉27

〈212〉PRT

〈213〉人工序列

〈400〉细胞分化促进肽1

MHPLVYVQQGEDTNALRNVQDQGDLEY

〈160〉2

〈210〉1

〈211〉26

〈212〉PRT

〈213〉人工序列

〈400〉细胞分化促进肽2

ESFANPRHLKIDWIHAYIHKWAYFSS

Claims (3)

1.一种商业用的人胚胎干细胞无血清分化培养基，其特征在于，由以下终浓度的成分构成：L-谷氨酰胺2mmol/L、维甲酸浓度为3×10^-9mol/L、转铁蛋白6mg/L、亚硒酸钠30mg/L和人表皮细胞生长因子:0.15mg/L，纤连蛋白:0.5mg/L，TGF-β1其浓度为5ng/ml，细胞分化促进肽浓度为100ppm，用DMEM/F12(1：1)培养基进行配置。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述细胞分化促进肽序列如SEQ ID NO：1-2任一所示。

3.一种使用商业上购买的人胚胎干细胞制备分化的内皮细胞的方法，包括以下步骤：

(1)人胚胎干细胞的复苏、培养和传代培养；

取商业购买的人胚胎干细胞系，在水浴锅内迅速融化，加入到含20mL权利要求1-2任一项所述的培养基的50mL离心管中，自然沉淀30min，吸去上清，用3mL培养基轻轻重悬沉淀后将重悬液加入到已经铺好MEF的0.1％明胶处理过的6cm培养皿中。当人胚胎干细胞的克隆长满后，用200U/mL胶原酶W，37℃处理lOmin后，挑起克隆碎片到MEF铺好的6孔板中培养。

(2)人胚胎干细胞悬浮法制备以及分化：人胚胎干细胞克隆用200U/mL胶原酶IV 37℃处理10min后，挑起克隆碎片转移到低粘附性培养皿中，悬浮培养，悬浮培养基为权利要求1-2任一项所述的培养基；4d后将细胞转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养2EBs/cm2，培养基成分同悬浮培养基，每天观察内皮细胞情况，大约5-8d后收获细胞。