CN110178725A - 一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组织培养领域，具体是指一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，包括培养无菌苗、诱导愈伤组织、高压灭菌、悬浮培养愈伤组织、干燥五个步骤，是一种规模化生产天山雪莲培养物的方法，可在保证绿原酸和紫丁香苷含量的基础上，稳定高产天山雪莲培养物；利用液体培养基进行悬浮培养，不仅可以扩大愈伤组织的数量，还能有效缩短时间。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法。
背景技术
天山雪莲含有黄酮、生物碱、多糖等多种有效成分，具有活血通经、散寒除湿、止血消肿、排体内毒素等功效。近年来，天山雪莲作为民族药和民间药在抗炎镇痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用备受关注。
天山雪莲因其生境特异，自然繁殖率较低，生长缓慢，人工栽培困难，长期以来掠夺性采挖使雪莲野生资源面临灭绝的危险。1996年中国已将天山雪莲列为二级保护植物，天山雪莲是唯一列入《中国植物红皮书》的雪莲植物，是中国国家三级濒危物种。2000年国务院13号文件已明令禁止采挖野生雪莲。
利用植物组织培养技术，高效培养富含活性成分的天山雪莲培养物，是解决天山雪莲资源短缺的有效途径，一方面解决了天山雪莲资源不足的问题，另一方面提高了有效成分的含量。
利用植物组织培养技术，特别是悬浮培养技术，可生产出符合《中国药典(2015版)》规定的绿原酸含量和紫丁香苷含量的愈伤组织，可实现规模化生产。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其快速、稳定。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，包括如下步骤：
(1)培养无菌苗：将天山雪莲种子做灭菌处理，将无菌种子用25℃的无菌水浸泡24h，接种在湿润的、无菌的、带滤纸的培养皿中萌发；
(2)诱导愈伤组织：将无菌苗的叶、根和茎转接至添加有植物激素的MS培养基上，在培养室诱导愈伤组织生长；
(3)高压灭菌：将装有25～50mL无菌悬浮培养液的锥形瓶，在120℃温度下高压灭菌16～18min；
(4)悬浮培养愈伤组织：将雪莲愈伤组织剪碎成颗粒，置于无菌悬浮培养液的锥形瓶中，然后放在摇床中，在转速为80～110r/min、温度为23～27℃、光照为8～14h/d的条件下培养15～25天，然后更换新的15～100mL悬浮培养液，继续培养10～30天；
(5)干燥：培养结束后，过滤分离得到愈伤组织，用蒸馏水洗2遍以上，置于30～55℃烘箱中烘干至恒重，即得干燥愈伤组织。
作为优选的，天山雪莲种子灭菌处理的方法为：使用70％乙醇处理30s，然后用0.1％升汞处理10min，最后用无菌水清洗4次。
作为优选的，培养无菌苗时，培养室的温度为15～20℃，室内相对湿度为50％～70％，光照强度为1000～1500lx。
作为优选的，诱导愈伤组织时，培养室的温度为18～22℃，相对湿度为50％～70％，光照为12h/d，光照强度为1000～1500lx。
作为优选的，诱导愈伤组织时，MS培养基上添加量的植物激素为：0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的NAA。
作为优选的，高压灭菌时，愈伤组织颗粒的直径为0.3～3.0mm，分散浓度为5～50个颗粒/mL。
作为优选的，悬浮培养愈伤组织时，悬浮培养液为添加有0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的MS液体培养基，悬浮培养液pH＝5.5～7.0。
本发明的有益效果为：提供一种规模化生产天山雪莲培养物的方法，可在保证绿原酸和紫丁香苷含量的基础上，稳定高产天山雪莲培养物；利用液体培养基进行悬浮培养，不仅可以扩大愈伤组织的数量，还能有效缩短时间。
具体实施方式
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，包括如下步骤：
(1)培养无菌苗：培养无菌苗时，在温度为15～20℃、室内相对湿度为50％～70％、光照强度为1000～1500lx的培养室中，对天山雪莲种子做灭菌处理，即将无菌种子用25℃的无菌水浸泡24h，然后接种在湿润的、无菌的、带滤纸的培养皿中萌发；
天山雪莲种子灭菌处理的方法为：使用70％乙醇处理30s，然后用0.1％升汞处理10min，最后用无菌水清洗4次；
(2)诱导愈伤组织：在温度为18～22℃，相对湿度为50％～70％，光照为12h/d，光照强度为1000～1500lx的培养室中将无菌苗的叶、根和茎转接至添加有植物激素的MS培养基上，植物激素为0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的NAA，诱导愈伤组织生长；
(3)高压灭菌：将装有25～50mL无菌悬浮培养液的锥形瓶，在120℃温度下高压灭菌16～18min；
悬浮培养液为添加有0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的NAA的MS液体培养基，悬浮培养液pH＝5.5～7.0；
(4)悬浮培养愈伤组织：将雪莲愈伤组织剪碎成颗粒，置于无菌悬浮培养液的锥形瓶中，然后放在摇床中，在转速为80～110r/min、温度为23～27℃、光照为8～14h/d的条件下培养15～25天，然后更换新的15～100mL悬浮培养液，继续培养10～30天；
(5)干燥：培养结束后，过滤分离得到愈伤组织，用蒸馏水洗2遍以上，置于30～55℃烘箱中烘干至恒重，即得干燥愈伤组织。
本发明在无菌条件下，通过雪莲愈伤组织的悬浮培养，获得符合《中国药典(2015版)》规定的绿原酸和紫丁香苷含量。为雪莲培养物的利用价值和生产提供参考依据，研究应用于生产，可消除雪莲地域条件的限制，满足市场对雪莲的需求。
本发明的有益效果为：提供一种规模化生产天山雪莲培养物的方法，可在保证绿原酸和紫丁香苷含量的基础上，稳定高产天山雪莲培养物；利用液体培养基进行悬浮培养，不仅可以扩大愈伤组织的数量，还能有效缩短时间。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养无菌苗：将天山雪莲种子做灭菌处理，将无菌种子用25℃的无菌水浸泡24h，接种在湿润的、无菌的、带滤纸的培养皿中萌发；
(2)诱导愈伤组织：将无菌苗的叶、根和茎转接至添加有植物激素的MS培养基上，在培养室诱导愈伤组织生长；
(3)高压灭菌：将装有25～50mL无菌悬浮培养液的锥形瓶，在120℃温度下高压灭菌16～18min；
(4)悬浮培养愈伤组织：将雪莲愈伤组织剪碎成颗粒，置于无菌悬浮培养液的锥形瓶中，然后放在摇床中，在转速为80～110r/min、温度为23～27℃、光照为8～14h/d的条件下培养15～25天，然后更换新的15～100mL悬浮培养液，继续培养10～30天；
(5)干燥：培养结束后，过滤分离得到愈伤组织，用蒸馏水洗2遍以上，置于30～55℃烘箱中烘干至恒重，即得干燥愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其特征在于：天山雪莲种子灭菌处理的方法为：使用70％乙醇处理30s，然后用0.1％升汞处理10min，最后用无菌水清洗4次。
3.根据权利要求1所述的一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其特征在于：培养无菌苗时，培养室的温度为15～20℃，室内相对湿度为50％～70％，光照强度为1 000～1500lx。
4.根据权利要求1所述的一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其特征在于：诱导愈伤组织时，培养室的温度为18～22℃，相对湿度为50％～70％，光照为12h/d，光照强度为1000～1 500lx。
5.根据权利要求1所述的一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其特征在于：诱导愈伤组织时，MS培养基上添加量的植物激素为：0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的NAA。
6.根据权利要求1所述的一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其特征在于：高压灭菌时，愈伤组织颗粒的直径为0.3～3.0mm，分散浓度为5～50个颗粒/mL。
7.根据权利要求1所述的一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其特征在于：悬浮培养愈伤组织时，悬浮培养液为添加有0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的MS液体培养基，悬浮培养液pH＝5.5～7.0。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN114176004A (zh) * | 2020-08-24 | 2022-03-15 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种天山雪莲的再生培养方法 |
| CN115786232A (zh) * | 2022-12-19 | 2023-03-14 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法 |
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2019
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| CN115786232A (zh) * | 2022-12-19 | 2023-03-14 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法 |
| CN115786232B (zh) * | 2022-12-19 | 2023-10-24 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法 |
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