CN115786232A - 雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法的方法，属于植物基因工程技术领域，所述方法步骤如下：选取雪莲种子，加赤霉素浸泡过夜；消毒，然后置于MS0培养基上培养，得到的雪莲的无菌苗，将无菌苗剪碎置于愈伤诱导培养基诱导出愈伤，将愈伤切碎；置于3/4MS愈伤诱导水培培养基中，获得悬浮愈伤系，将悬浮愈伤系浸泡到制备好的侵染液，然后转移到筛选培养基3/4MS培养基诱导愈伤1个月；将新长出的愈伤转移到分化筛选培养基3/4MS诱导再生芽3‑4个月，再转移到MS0生根培养基生根2‑3周；本发明首次将雪莲的遗传转化体系提高到85％以上，本发明在雪莲的遗传转化过程中全程使用GFP荧光蛋白进行实时监控，为基因工程改造雪莲，创制高产优质雪莲细胞系，推动雪莲的资源利用奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，植物高效遗传转化技术领域，尤其涉及雪莲遗传转化及相关基因工程材料的获得。
背景技术
雪莲是菊科凤毛菊属多年生高山植物，是珍稀濒危禁采的中草药资源，含有丰富的天然活性物质，性温、微苦，具有温肾助阳、祛风胜湿、通经活血等功效。由于天山雪莲生长环境特殊，4到5年开花，自然繁殖率低，生长缓慢，致使其很难通过育种和栽培技术获取雪莲资源。
结合现在多数研究总结，雪莲的遗传转化方法集中在农杆菌介导农杆菌，外植体的选择是叶片愈伤、种子愈伤、叶片，这些转化材料的选择都存在这转化效率低、资源受限的问题。植物的悬浮细胞为均一性、分散性良好且生长旺盛，是进行遗传转化非常优良的受体，目前没有雪莲悬浮细胞系遗传转化的报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法，以悬浮愈伤细胞为转化受体，解决了雪莲资源稀缺的问题，筛选出适合雪莲的不同生长阶段的培养基，确定筛选标记以及适合的筛选量，首次使用了GFP荧光蛋白在雪莲愈伤中时时监控，并且也是首次将雪莲的遗传转化体系提高到85％以上，为基因工程改造雪莲，推动雪莲的资源利用奠定基础。
为了实现上述发明的目的，本发明提供了一下技术方案：
一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法的方法，步骤如下：
(1)选取颗粒饱满的雪莲种子，加300mg·L-1GA3浸泡雪莲种子过夜；
(2)第二天将种子置于8-12％的次氯酸钠浸泡10-20min，无菌水冲洗，然后泡在0.5-1.5％的过氧化氢溶液48h；
(3)取出种子晾干，将种子置于MS0培养基，在24℃下，光周期为16h光照，8h黑暗，培养30-40d；所述的MS0培养基是在MS含量减半的基础培养基中，含有终浓度为15g·L-1蔗糖，4g·L-1植物凝胶，pH值为6；
(4)等到雪莲种子发芽后，选取已经确定的无菌苗置于MS0培养基，在24℃下，光周期为8h光照，16h黑暗，培养30-40d；
(5)将得到的雪莲的无菌苗，待无菌苗长到6-8cm，将苗子剪碎约0.5-1cm的正方形；置于愈伤诱导培养基3/4MS，在24℃下，暗培养；所述3/4MS培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，4g·L-1植物凝胶，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–16-BA，pH值为6；
(6)雪莲25-30d长出愈伤，将新长出的愈伤从雪莲叶片上剥离下来，用手术刀将愈伤切碎；将切好的愈伤置于加入100mL3/4MS愈伤诱导水培培养基中250mL的摇瓶中，在24℃下，黑暗培养40-50d；所述3/4MS水培培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–1 6-BA，pH值为6；
(7)后续雪莲水培愈伤进入快速期，每隔15天继代一次；
(8)提前制备侵染液：冻融法将质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD600＝0.4-0.5时加入乙酰丁香酮终浓度为100μmol·L–1，2h后离心富集菌液，使用3/4MS侵染液重悬为OD600＝0.2-0.3，侵染液制备完成；所述3/4MS侵染液是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–1 6-BA，100μmol·L–1乙酰丁香酮，pH值为6；
(9)将悬浮愈伤系浸泡到制备好的侵染液中里，同时真空抽滤10min，超声5min，抽真空10min，后将水培愈伤用滤纸晾干，于超净台中自然晾干约1-2h，置于共培养培养基3/4MS AS共培养两天；所述共培养培养基3/4MS AS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–1 6-BA，4g·L-1植物凝胶，100μmol·L–1乙酰丁香酮，pH值为6；
(10)将悬浮愈伤转移到筛选培养基3/4MS培养基诱导愈伤1个月；所述筛选培养基3/4MS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–1 6-BA，4g·L-1植物凝胶，300mg·L–1特美汀，1.5mg·L–1dl-phosphinotricin，pH值为6；
(11)将新长出的愈伤转移到分化筛选培养基3/4MS诱导再生芽3-4个月；所述分化筛选培养基3/4MS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，0.1mg·L–1NAA，3mg·L–16-BA，4g·L-1植物凝胶，300mg·L–1特美汀，1mg·L–1dl-phosphinotricin，pH值为6；
(12)将诱导出来的芽转移到MS0生根培养基生根2-3周；所述的MS0生根培养基是在MS含量减半的基础培养基中，含有终浓度为15g·L-1蔗糖，0.3mg·L–1NAA，4g·L-1植物凝胶，pH值为6；
本发明还提供利用上述方法对雪莲进行转基因的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、本发明首次将天山雪莲的遗传转化体系提高到85％以上，可以的利用基因工程分子生物学在雪莲上进行定向改造，同时可以对雪莲次生代谢产物在基因水平进行深入研究解析；
2、本发明为雪莲遗传转化提供了一种全新的外植体材料，雪莲愈伤悬浮系可以进行大量扩繁发酵，不受资源限制；
3、本发明中首次筛选出适合雪莲的在愈伤发育阶段和分化阶段除草剂筛选浓度。
附图说明
图1雪莲悬浮愈伤诱导过程图
(A)天山雪莲无菌苗(B)诱导天山雪莲叶片产生愈伤(C)观察的叶片愈伤的细节图(D)愈伤切碎悬浮培养(E)愈伤悬浮培养40d到50d(A、B、D、E bar＝2cm；C bar＝2mm)；
图2遗传转化过程图
(A)天山雪莲悬浮愈伤细节图(B)悬浮愈伤置于侵染液中(C)侵染后悬浮愈伤于滤纸晾干(D)侵染后悬浮愈伤置于共培养培养基(E)在蓝色激发光下观察的侵染悬浮愈伤的细节图(F)在自然光下观察的侵染悬浮愈伤的细节图(G)侵染悬浮愈伤生长在筛选培养(H)侵染悬浮愈伤生长在分化培养基愈伤变绿(I)侵染悬浮愈伤生长在分化培养基并且产生不定芽(J)分化出的芽生在在生根培养基(K)在蓝色激发光下观察再生苗的细节图(L)在自然光下观察再生苗的细节图(Abar＝5mm；B、C、D、G、H、I、J bar＝2cm；E、F、K、L bar＝2mm)；
图3转基因植物PCR鉴定图；
图4载体图谱pEarleyGate-GFP的T-DNA区段。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
本实施例提供了一种天山雪莲悬浮愈伤遗传转化系统建立的方法，主要是如下步骤：取天山雪莲种子消毒，待雪莲成苗后，把小苗剪成0.5-1cm置于3/4MS愈伤诱导培养上，待长愈伤，将愈伤切碎置于3/4MS愈伤诱导水培培养基，传代培养，待愈伤扩繁。将快速生长的悬浮愈伤置于侵染液中，抽真空10min超声5min抽真空10min，滤纸吸干水分，晾干约2h，于共培养培养基共培养两天，暗下培养一个月诱导产生新的有抗性的愈伤，后光照诱导抗性愈伤分化，长出来再生芽后置于生根培养基，获得转基因株系。所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。
实施例1：雪莲悬浮愈伤诱导的具体步骤和方法
(1)取新鲜的颗粒饱满的天山雪莲种子，将种子于清水中冲洗3遍，加300mg·L- 1GA3终浓度浸泡雪莲种子4℃过夜，提高雪莲种子的萌发率。
(2)第二天将种子于10％的次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗5到7次，待洗种子的无菌水澄清不发黄。
(3)用无菌水配置1％的过氧化氢溶液，将洗净的种子放入其中48h。
(4)取出种子在无菌滤纸上2到3h晾干，将种子置于MS0培养基。在24℃下，光周期为16h光照，8h黑暗，培养10-15d。
(5)待雪莲种子发芽后，选取已经确定的幼苗，置于MS0培基(瓶子)。在24℃下，光周期为8h光照，16h黑暗，培养20-30d。
(6)待长大的雪莲的无菌苗约到6-8cm的高度(图1A)，从瓶子里取出将苗子剪碎约0.5-1cm，置于愈伤诱导培养基3/4MS(图1B)。在24℃下，暗培养25-30d。
(7)待叶片周围长出白块状(图1C)，将新长出的愈伤从雪莲叶片上剥离下来，用手术刀将愈伤切碎。将切好的愈伤置于加入100mL 3/4MS水培培养基中250mL的摇瓶中(图1D)，在24℃下，黑暗培养40-50d。
(8)后续雪莲悬浮愈伤进入快速期，需要每隔15天对悬浮愈伤继代一次，在24℃下，130rpm，黑暗培养。
(9)将原始液体培养基倒掉，新长出的愈伤1/4的量进行继代，加入100mL 3/4MS水培培养基中250mL的摇瓶中。继代的过程要注意雪莲愈伤容易褐化，要将褐化的愈伤弃去，仅仅留下状态好的生长速度快的愈伤继续继代，雪莲悬浮系愈伤在稳定快速生长。
实施例2：雪莲悬浮愈伤侵染过程
(1)冻融法将构建好的载体转到EHA105农杆菌中，载体图谱如图4所示，将PCR鉴定转化验证成功的阳性菌株置于-80℃冰箱备用。
(2)从冰箱取出制备好的农杆菌，加入相应抗生素的LB培养基，在28℃下，200rpm，黑暗培养。
(3)当菌液浓度OD600值约为0.4-0.5时加入乙酰丁香酮终浓度为100μmol·L–1，28℃摇床200rpm培养2h。
(4)将培养好的菌液离心4000rpm，10min弃去LB培养基富集菌体，使用3/4MS侵染液将富集好的农杆菌重悬，重悬菌液OD600值约为0.2-0.3。
(5)悬浮雪莲愈伤弃去培养液，浸泡在侵染液中开始侵染。侵染的过程中先真空抽滤10min，超声5min，最后再真空抽滤10min(图2B)。完成后，弃去侵染液将愈伤置于提前灭菌好的滤纸吸干菌液，在超净工作台将愈伤吹干约2h，再吹的过程将愈伤翻动，均匀干燥侵染后的愈伤(图2C)，置于共培养培养基3/4MSAS(图2D)，在24℃下，黑暗共培养两天，可以观察雪莲悬浮愈伤侵染情况。在蓝色激发光下观察的悬浮愈伤的细节图(图2E)，蓝色激发光下有明显绿色荧光，在自然光下观察悬浮愈伤的细节图(图2F)。
(6)对不同时间转基因材料进行统计转化效率(表1)，计算公式为转化效率＝有荧光愈伤团/全部愈伤团。
表1农杆菌介导雪莲悬浮培养细胞转化效率
实施例3：天山雪莲转基因愈伤筛选诱导和再生的过程
(1)共培养结束后，将雪莲愈伤转移到3/4MS筛选培养基上，24℃黑暗培养诱导愈伤30d(图1G)。你
(2)暗培养过后将新长出来的愈伤转移到3/4MS筛选分化培养基。在24℃下，光周期为16h光照，8h黑暗，培养10-15d。诱导愈伤分化，40-50d愈伤变绿，且有部分愈伤分化成苗。
(3)在光照条件下，每隔15-20d愈伤继代一次。继代的过程要注意雪莲愈伤容易褐化，要将褐化的愈伤弃去，仅仅留下状态好的生长速度快的愈伤继续继代。
(4)将分化出的雪莲芽，每隔每隔20-25d继代一次，继代的过程要将褐化的芽弃去，仅仅留下状态好的芽的愈伤继续继代，待芽伸长，将所出的芽与芽分开，置于MS0生根培养基中，在24℃下，光周期为16h光照，8h黑暗，培养20-30d雪莲开始生根，在蓝色激发光下观察的再生苗的细节图(图2K)，蓝色激发光下有明显绿色荧光，在自然光下观察再生苗的细节图(图2L)。
实施例4：转基因植株鉴定
(1)取转基因的雪莲叶片，CTAB法提取雪莲DNA，提取后的DNA进行浓度测定，确定DNA质量。
(2)使用taq酶(taq mix)对转基因植物(图3)的DNA进行进行鉴定使用引物，进行PCR扩增产物鉴定，PCR反应体系为：2μLDNA，正/反向引物(10μM)各1μL，10μL taq酶和7μLddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s；72℃ 30s，28个循环；72℃ 10min。
引物序列如下：
bar-F:AGTCGACCGTGTACGTCTCC
bar-R:GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC
GFP-F:TGATGCCGTTCTTCTGCTTGTC
GFP-R:CAGTGCTTCAGCCGCTACCC
(3)反应结束后取PCR扩增产物点样5μL，进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳10min，160V，同时点样5μL 2000bp Ladder Maker作为标准分子量。bar基因和GFP基因的预期PCR产物大小分别为242bp和280bp(图3)。
综上实施例对本发明进行了详尽的叙述。但是它仅仅是本发明中的部分实例，不能完全概括本发明的全部技术细节，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明的贯彻理念和技术范围的梗概下，本发明还会有不同程度的改进。按本发明的发明理念，本发明申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变，对这些全部都进行专利保护。
Claims (2)
1.一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
(1)选取颗粒饱满的雪莲种子，加300mg·L-1赤霉素浸泡雪莲种子过夜；
(2)第二天将种子置于8-12％的次氯酸钠浸泡10-20min，无菌水冲洗，然后泡在0.5-1.5％的过氧化氢溶液48h；
(3)取出种子晾干，将种子置于MS0培养基，在24℃下，光周期为16h光照，8h黑暗，培养30-40d；所述的MS0培养基是在MS含量减半的基础培养基中，含有终浓度为15g·L-1蔗糖，4g·L-1植物凝胶，pH值为6；
(4)等到雪莲种子发芽后，选取已经确定的无菌苗置于MS0培养基，在24℃下，光周期为8h光照，16h黑暗，培养30-40d；
(5)将得到的雪莲的无菌苗，待无菌苗长到6-8cm，将苗子剪碎约0.5-1cm的正方形；置于愈伤诱导培养基3/4MS，在24℃下，暗培养；所述3/4MS培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，4g·L-1植物凝胶，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–16-BA，pH值为6；
(6)雪莲25-30d长出愈伤，将新长出的愈伤从雪莲叶片上剥离下来，用手术刀将愈伤切碎；将切好的愈伤置于加入100mL3/4MS愈伤诱导水培培养基中250mL的摇瓶中，在24℃下，黑暗培养40-50d；所述3/4MS水培培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–1 6-BA，pH值为6；
(7)后续雪莲水培愈伤进入快速期，每隔15天继代一次；
(8)提前制备侵染液：冻融法将质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD600＝0.4-0.5时加入乙酰丁香酮终浓度为100μmol·L–1，2h后离心富集菌液，使用3/4MS侵染液重悬为OD600＝0.2-0.3，侵染液制备完成；所述3/4MS侵染液是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–1 6-BA，100μmol·L–1乙酰丁香酮，pH值为6；
(9)将悬浮愈伤系浸泡到制备好的侵染液中里，同时真空抽滤10min，超声5min，抽真空10min，后将水培愈伤用滤纸晾干，于超净台中吹约1-2h，置于共培养培养基3/4MS AS共培养两天；所述共培养培养基3/4MS AS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–1 6-BA，4g·L-1植物凝胶，100μmol·L–1乙酰丁香酮，pH值为6；
(10)将悬浮愈伤转移到筛选培养基3/4MS培养基诱导愈伤1个月；所述筛选培养基3/4MS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，1.5mg·L–1NAA，1mg·L–16-BA，4g·L-1植物凝胶，300mg·L–1特美汀，1.5mg·L–1，pH值为6；
(11)将新长出的愈伤转移到分化筛选培养基3/4MS诱导再生芽3-4个月；所述分化筛选培养基3/4MS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L-1蔗糖，0.1mg·L– 1NAA，3mg·L–16-BA，4g·L-1植物凝胶，300mg·L–1特美汀，1mg·L–1草铵膦，pH值为6；
(12)将诱导出来的芽转移到MS0生根培养基生根2-3周；所述的MS0生根培养基是在MS含量减半的基础培养基中，含有终浓度为15g·L-1蔗糖，0.3mg·L–1NAA，4g·L-1植物凝胶，pH值为6。
2.利用权利要求1所述方法对雪莲进行转基因的应用。
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