CN105296528A - 一种南非半边莲遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

一种南非半边莲遗传转化方法，包括以下步骤，(1)外植体的制备；(2)质粒载体构建；(3)通过电击将双元质粒载体导入农杆菌的方法；(4)半边莲的遗传转化。本发明转化效率高、方法完整，可用作南非半边莲遗传转化的标准方法。本发明对南非半边莲的转基因育种有重要意义，也为南非半边莲用于基因功能验证提供技术支撑。

Description

一种南非半边莲遗传转化方法

技术领域

本发明涉及一种植物遗传转化方法，具体涉及一种南非半边莲遗传转化方法。

技术背景

南非半边莲(Lobeliaerinus)属于菊目(Asterale)桔梗科(Campanulaceae)植物，南非半边莲又叫山梗菜、六倍利，多年生草本植物，原产地南非。由于南非半边莲具有植株矮小、生长期短、开花量大、花色丰富等特点，常用作园林绿化的饰边植物和组合盆栽；同时，也是研究花色分子遗传的理想模式植物。当前，南非半边莲作为重要的花卉作物，虽然由于其优良特性可作为花卉的模式植物，但目前还没有成熟和系统的转化方法被报道。

目前，植物遗传转化技术在实现手段上主要有农杆菌转化和基因枪两种手段。其中，基因枪法属于直接转化的方法，是直接将裸露的DNA向植物组织转移，因而DNA在植物基因组中的整合缺乏限制因素，随机性大，规律性差；同时，由于转基因当代情况复杂，后代的基因分离情况也就复杂，分析较为困难。而农杆菌转化系统与DNA直接转化方法中DNA被动地整合到染色体上不同，它是一种生物转化系统，因而具有主动性，它选择性地转移Ti质粒上以两个25bp重复序列为两端的T-DNA；在virD2蛋白的帮助下，它可以主动地插入到植物染色体上；并且，通过农杆菌转化系统获得的转基因植株还具有基因拷贝数低(一般1～3拷贝)、转基因较少沉默以及可转移基因片段较长等优点。植物的再生往往从愈伤组织或外植体的特定区域发起，形态发生途径有两条：一条是器官发生，即由愈伤组织形成芽或根的过程；另一条是体细胞胚发生，其标志是形成在类似合子胚结构的胚状体，它在一定条件下可以长成完整的植株。其中，体细胞胚的形成，可以通过两种途径：一是通过外植体组织单一细胞直接进行体细胞胚形成，可以保持品种的稳定性；二是通过外植体形成愈伤组织间接进行体细胞胚形成。愈伤组织系统经历了脱分化及再分化过程，有如下优势：第一，已分化的细胞均回到脱分化的分生细胞水平，易接受外源基因，转化效率较高；第二，扩繁量大，转化的愈伤组织通过继代培养，能够分化更多转化植株；第三，多种组织、器官均能诱导愈伤组织，外植体试材广泛。但是，愈伤组织再生途径的缺点是嵌合体较多，获得的再生植株无性系变异较多，转化的外源基因遗传稳定性较差，这是由于外植体诱导的愈伤组织为多细胞形成。因此，由外植体直接分化芽比诱导愈伤组织困难，使转化细胞直接分化成植株更为困难，其转化频率低于愈伤组织再生系统；而体细胞胚具有很强的接受外源DNA的能力，转化率和转化效率都很高。

综上，探索寻找一种通过农杆菌介导南非半边莲外植体体细胞胚的高效遗传转化方法，对南非半边莲的转基因育种有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种南非半边莲遗传转化方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案，一种南非半边莲遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)外植体的制备：首先培养无菌苗，获取幼苗真叶作外植体；

(2)质粒载体构建：质粒载体pIG121Hm(优选含有百合LhF3H基因的启动子的pIG121Hm载体)通过大肠杆菌进行扩增，提取、纯化质粒DNA后用DNA限制性内切酶酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行纯化，备用；通过PCR对目标基因进行扩增，设计的引物含有相应的位点，用T4连接酶将制备的目标基因DNA与空载体进行定向连接。

(3)农杆菌电击转化：将质粒载体通过电击导入浓度为OD₆₀₀＝0.6～1.0感受态农杆菌细胞EHA105中，加入LB培养基，室温静置50～70min，将菌液涂布到含50mg/L卡那霉素和潮霉素的LB平板上，在28℃下培养2～3d，通过PCR方法筛选阳性克隆，接着放大和保存阳性EHA105细胞，然后挑取成功转化双元质粒载体的农杆菌EHA105，接种于含卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB液体培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h；接着挑取过夜培养物于含50mg/l卡那霉素和潮霉素的YEB培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h，获得菌液浓度为OD600＝0.6～1.0；挑取细胞于YEB培养基中，培养6～12h，将菌液在3000～6000rpm条件下离心5～15min，用细菌悬浮液培养基重新悬浮农杆菌，使得菌液浓度为OD600＝0.2用于转化；

(4)半边莲的遗传转化：将真叶剪成5mm×5mm叶片，浸泡在EHA105农杆菌悬浮液中培养3～5min，将浸泡后的叶片外植体转移到共培养培养基上，在24～26℃下黑暗培养2.5～3.5d，用清洗培养基清洗叶片2～4次；接着将叶片外植体转接到去农杆菌介导培养基上，在24～26℃，光照条件下培养1周；接着将叶丝转移到筛选培养基(SM)，24～26℃下光照培养，每2周继一次代，持续1个月；接着在选择/再生培养基上培养愈伤组织，24～26℃光照培养1个月；然后转接幼苗到生根培养基上，在24～26℃光照培养16h，培养6～8天，直到长出完整的转化植株时炼苗移植。

进一步，步骤(1)中，所述培养无菌苗是将种子浸泡于70％乙醇5～10s，接着转入1％的次氯酸钠溶液中浸泡20min，然后用无菌水冲洗种子3次，将种子接种于含0.3％无蔗糖的植物凝胶的1/2MS培养基上，在25℃，光照时数为16h的条件下，培养1～2周后取叶片作外植体。

进一步，步骤(2)中，pIG121Hm空载体与目标基因DNA混匀后，在65℃下先处理3min，迅速置于冰上冷却，之后再进行连接。

进一步，步骤(4)中，所述1L共培养培养基(CCM)成分为：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×MS铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100mg肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.2+19.6mg乙酰丁香酮；

所述1L清洗培养基(WL)成分:100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+pH5.6+300mgaugmentin，用此培养基清洗农杆菌浸染后的叶片，能有效除去活体农杆菌及其它杂物；

所述1L去农杆菌培养基(AEM)成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgkinetin+pH5.7-5.8+300mgAugmentin，其中高浓度的100g/L肌醇对愈伤组织分化和胚状体的形成有促进作用，用此培养基能有效杀死农杆菌，并诱导愈伤或体细胞胚的产生；

所述1L筛选培养基(SM)成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.7-5.8+300mgAugmentin+30mghygromycin，用此培养基能有效筛选出抗性愈伤或体细胞胚；

所述1L选择/再生培养基(SRM)成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.7-5.8+300mgAugmentin+30mghygromycin+0.5mgBA+0.2mgIAA，其中低浓度的0.5mg/LBA和0.2mg/LIAA有利于胚状体的发育；

所述1L生根培养基(RDM)成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.7-5.8+0.1mgIAA，其中，IAA有利于根系的诱导及生长；

所述炼苗移植条件是营养土：蛭石＝3:1。

本发明通过农杆菌直接感染叶片伤口，进而诱导愈伤组织或者体细胞胚的方法，成功获得了转基因植株，转化效率高、方法完整，可用作南非半边莲遗传转化的标准方法。利用农杆菌介导半边莲胚性愈

伤组织快速得到转化体，与基因枪法相比，减轻工作量，提高工作效

率；建立较高的转基因体系，为半边莲功能基因组研究提供平台。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

1、实验材料

品种材料：南非半边莲“Bluemoon”。

农杆菌菌株：EHA105。

载体：含百合LhF3H基因启动子的pIG121Hm。

外源基因：百合LhMYB8。

2、培养基(见表1)

表1培养基名称缩写、名称和组分

3、实验方法

(1)载体构建：质粒载体为带百合LhF3H基因的启动子的pIG121Hm(pro^LhF3H-pIG121Hm)，目的基因为百合LhMYB8。pro^LhF3H-pIG121Hm载体序列以及LhMYB8的全长序列，分别SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。

扩增LhMYB8全长基因以及通过PCR方法添加酶切位点接头。使用的引物是LhMYB8(5′-GCGtctagaGTGGGACTCCATAAGTAACAG-3′，见SEQIDNO:3)和LhMYB8fr(5′-GGCgagctcAGAGGGACACTCATGTAGTCA-3′，见SEQIDNO:4)。PCR扩增片段纯化后进行XbaI/SacI双酶切。酶切条件按照限制性内切酶试剂的说明书。酶切产物经过凝胶电泳富集、纯化后备用。载体pro^LhF3H-pIG121Hm经XbaI/SacI双酶切，酶切条件按照限制性内切酶试剂的说明书。酶切产物经过凝胶电泳富集、纯化后备用。使用DNA连接试剂盒TakaraDNAligationkitVer.2.1连接载体以及目的基因。连接条件按照试剂盒的说明书，并作以下修改：连接之前将空载体以及待插入DNA片段在65℃处理3min以提高连接效率。

将连接好的载体导入大肠杆菌进行扩增和阳性鉴定。用LhMYB8特异性引物LhMYB8-1f(5′-AGCTTCACAGCCTCCTCGGT-3′，见SEQIDNO:5)和LhMYB8-1r(5′-ACTACAGCTGAAACACGGCG-3′，见SEQIDNO:6)进行PCR扩增验证。PCR扩增退火温度为60℃，延伸时间45s。为了保证DNA插入方向正确，且无串联DNA发生，用引物LhMYB8-1f(5′-AGCTTCACAGCCTCCTCGGT-3′，见SEQIDNO:7)以及载体特异性引物TerR1(5′-GTTCCTTCTTCACTGTCCCT-3′，见SEQIDNO:8)进行PCR扩增验证。PCR扩增退火温度为56℃，延伸时间2min。为了保证插入DNA在操作过程的序列完整性，用LhMYB8-2f(5′-GTGGGACTCCATAAGTAACAG-3′，见SEQIDNO:9)和LhMYB8-2r(5′-AGAGGGACACTCATGTAGTCA-3′，见SEQIDNO:10)进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。PCR扩增退火温度为60℃，延伸时间45s。

(2)农杆菌的电击转化：将1μl构建好的pIG121Hm载体和40μl感受态农杆菌细胞在冰中混匀；用BTX电击仪600进行电击；电击后加500μlLB的培养基，并转移到离心管中，在室温静置1h，将菌液涂布到含50mg/l卡那霉素和潮霉素的LB平板上；培养平板置于28℃培养2～3天；待菌斑长出后，通过PCR的方法筛选阳性克隆。

(3)阳性EHA105细胞的扩增：挑阳性单克隆，接种到3mlYEB培养基中(含50mg/l卡那霉素和潮霉素)。摇床摇菌20h，条件为温度28℃，转速170spm。摇菌后接种3μl到10mlYEB培养基(含50mg/l卡那霉素和潮霉素)。摇床摇菌20h，条件为温度28℃，转速170spm。摇菌后使细菌浓度达到OD₆₀₀0.6-1.0。在4℃、5000rpm离心5min，弃上清液收集细胞，再用细菌悬浮培养基(BSS)重新悬浮和调整细胞浓度，使细胞浓度OD₆₀₀0.2。

(4)培养无菌苗：将种子在70％乙醇中浸泡数秒后，转移，在1％的次氯酸钠溶液中浸泡20min，接着用无菌水冲洗种子3次；将种子置于含0.3％琼脂糖凝胶但不含蔗糖的1/2MS固体培养基上；在25℃，光周期16h/8h条件下培养，1～2周后取真叶或子叶用于遗传转化。

(5)半边莲遗传转化：用手术刀将叶片剪成5mm×5mm，然后将60个叶片外植体浸泡在4mLEHA105农杆菌悬浮液中，浸泡时间不超过5min；将叶片用无菌纸擦干，用滤纸干燥叶丝后，将外植体转移到CCM培养基，并在25℃下黑暗培养3d；取出叶片外植体，用清洗培养基(WL)清洗叶片3次，将叶片用无菌纸擦干；将叶片外植体转接到AEM培养基上，在25℃、光照条件下培养一周；将叶丝转移到SM培养基，25℃下光照培养，每2周继一次代，持续一个月；培养愈伤组织在SRM培养基上，25℃、光照培养一个月，幼苗能清晰地看见，转接幼苗到RDM培养基上，在25℃光照培养16h，培养一个星期，直到发根；按照炼苗：蛭石＝3:1将盆转移到塑料袋中，给植株充分浇足水，密封塑料袋，一周后开小开口，一周之后开更大一点，最终拿出盆。

3、实验结果：取了60个外植体，经过潮霉素筛选培养基筛选以后，分别有61.4％(子叶)和48.7％(真叶)的外植体成功诱导抗性愈伤，分别有10.2％(子叶)和7.3％(真叶)的外植体成功诱导体细胞胚。抗性愈伤/体细胞胚总计85.5％(子叶)和63.8％(真叶)成功获得了再生植株。若以最后获得的阳性植株数目与外植体数目的比值来评价转化效率，子叶和真叶的转化效率分别为55.2％和43.8％。

综上，虽然真叶的转化效率低于子叶，但是差别不是很大，考虑到真叶外植体更容易获得，因而在操作上更加实用、易行。

Claims (5)

1.一种南非半边莲遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体的制备：首先培养无菌苗，获取幼苗真叶作外植体；

(2)质粒载体构建：质粒载体pIG121Hm通过大肠杆菌进行扩增，提取、纯化质粒DNA后用DNA限制性内切酶酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行纯化，备用；通过PCR对目标基因进行扩增，设计的引物含有相应的位点，用T4连接酶将制备的目标基因DNA与空载体进行定向连接。

(3)农杆菌电击转化：将质粒载体通过电击导入浓度为OD₆₀₀＝0.6～1.0感受态农杆菌细胞EHA105中，加入LB培养基，室温静置50～70min，将菌液涂布到含50mg/L卡那霉素和潮霉素的LB平板上，在28℃下培养2～3d，通过PCR方法筛选阳性克隆，接着放大和保存阳性EHA105细胞，然后挑取成功转化双元质粒载体的农杆菌EHA105，接种于含卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB液体培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h；接着挑取过夜培养物于含50mg/l卡那霉素和潮霉素的YEB培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h，获得菌液浓度为OD600＝0.6～1.0；挑取细胞于YEB培养基中，培养6～12h，将菌液在3000～6000rpm条件下离心5～15min，用细菌悬浮液培养基重新悬浮农杆菌，使得菌液浓度为OD600＝0.2用于转化；

(4)半边莲的遗传转化：将真叶剪成5mm×5mm叶片，浸泡在EHA105农杆菌悬浮液中培养3～5min，将浸泡后的叶片外植体转移到共培养培养基上，在24～26℃下黑暗培养2.5～3.5d，用清洗培养基清洗叶片2～4次；接着将叶片外植体转接到去农杆菌介导培养基上，在24～26℃，光照条件下培养1周；接着将叶丝转移到筛选培养基(SM)，24～26℃下光照培养，每2周继一次代，持续1个月；接着在选择/再生培养基上培养愈伤组织，24～26℃光照培养1个月；然后转接幼苗到生根培养基上，在24～26℃光照培养16h，培养6～8天，直到长出完整的转化植株时炼苗移植。

2.根据权利要求1所述的南非半边莲遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养无菌苗是将种子浸泡于70％乙醇5～10s，接着转入1％的次氯酸钠溶液中浸泡20min，然后用无菌水冲洗种子3次，将种子接种于含0.3％无蔗糖的植物凝胶的1/2MS培养基上，在25℃，光照时数为16h的条件下，培养1～2周后取叶片作外植体。

3.根据权利要求1或2所述的南非半边莲遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，pIG121Hm空载体与目标基因DNA混匀后，在65℃下先处理3min，迅速置于冰上冷却，之后再进行连接。

4.根据权利要求1或2所述的南非半边莲遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述质粒载体pIG121Hm是含有百合LhF3H基因的启动子的pIG121Hm载体。

5.根据权利要求1、2或4之一所述的南非半边莲遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述1L共培养培养基成分为：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×MS铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100mg肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.2+19.6mg乙酰丁香酮；

所述1L清洗培养基成分:100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+pH5.6+300mgaugmentin；

所述1L去农杆菌培养基成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgkinetin+pH5.7-5.8+300mgAugmentin；

所述1L筛选培养基成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.7-5.8+300mgAugmentin+30mghygromycin；

所述1L选择/再生培养基成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.7-5.8+300mgAugmentin+30mghygromycin+0.5mgBA+0.2mgIAA；

所述1L生根培养基成分：100ml10×MS大量+10ml100×MS微量+5ml200×铁盐+1.25ml800×MS有机+30g蔗糖+100g肌醇+8g琼脂+1mg2,4-D+0.1mgKinetin+pH5.7-5.8+0.1mgIAA；

所述炼苗移植条件是营养土：蛭石＝3:1。