KR100344573B1 - 아그로박테리움에 의한 형질전환 고추의 제조방법 및 그에 의해 생산된 고추 - Google Patents

Abstract

본 발명은 국내에서 재배되고 있는 고추 재배종 및 재래종을 재료로 하고 아그로박테리움을 형질전환 매개체로 이용한 효율적인 유전자 전환 기법에 관한 것이다. 고추 형질전환은 국내에서도 일부 연구자들이 시도하였으나 슈트(shoot)에서 뿌리(root)를 유도하는 과정에서 재현성이 낮고 효율도 지극히 낮은 단점이 있으나 본 방법은 이 단계의 한계를 극복하여 뿌리유도율이 25%에 달하고 그 기간도 3주 이내에 뿌리를 유도시킬 수 있는 기법이기 때문에 현재까지 시도된 고추 형질전환 방법 중에서 가장 우수한 것이다. 또한 형질전환 고추를 개발하는데 소요되는 기간을 4개월 내외로 현저히 단축시키며 앞으로 고추에 유용한 유전자를 형질전환시켜 국내 농업 발전과 종자 산업을 보호하는데 기여할 수 있으리라 사료되며 학문적으로도 원예작물 형질전환의 획기적 전기로 평가될 수 있으리라 본다.

Description

아그로박테리움에 의한 형질전환 고추의 제조방법 및 그에 의해 생산된 고추{Preparation Method for Transformated Capsicum ammuum and Capsicum ammuum thereof}

본 발명은 작물에 유용한 유전자를 도입 할 수 있는 아그로박테리움 투마파시엔 (Agrobactrium tumefaciensLBA4404)을 이용하여 고추를 형질전환 할 수 있는 기술에 관한 것이다. 고추는 사람들이 즐겨 먹는 음식 또는 음식에 사용되는 재료로서 우리나라에서는 상당히 대중화되어 있는 실정이므로 고추에 있어 유용한 형질을 가진 유전자를 도입할 수 있다면 재배농가 뿐만 아니라 국민 식생활 개선에도 크게 이바지 할 수 있다. 그러나 종래에는 형질전환 고추의 제조에 있어서, 슈트 (shoot)에서 뿌리(root)로의 유도과정에서의 재현율이 무척 낮고 효율면에서도 지극히 낮은 단점이 있다.

본 발명의 목적은 상기의 기술적인 문제에 대해 작물에 유용한 유전자를 도입할 수 있는 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefacienLBA4404)을 이용하여 고추 자엽을 형질전환 시키고, 자엽으로부터 슈트(shoot) 유도배지에서 슈트(shoot)를 유도한 후, 다시 유도된 슈트(shoot)로부터 뿌리(root) 유도배지하에서 뿌리(root)를 유도하는 2단의 유도과정을 통해 유용한 유전자로 형질 전환된 고추를 획득함에 있으며, 또 다른 목적으로는 본 발명에서 개발한 고추 형질 전환 기법은 국내외적으로 보고된 바가 없고, 일반적으로 모든 고추 품종에 적용될 수 있어 새로운 기능의 유전자를 짧은 시간내에 전환하여 고추 신 품종을 개발할 수 있기 때문에 국내 종묘산업의 발전과 농가의 소득 증대 및 국내 농업의 보호를 목적으로 이용함에 있다.

도 1은 고추를 형질전환하기 위하여 개발한 식물형질전환 운반체로서 식물게놈에 전달되는 부위의 유전자구조이다. (NOS-pro, NOS promoter; NPTⅡ, Neomycin Phosphotransferase Ⅱ; NOS-ter, NOS terminater; 35S-pro, CaMV 35S promoter; CMVCP, 오이모자이크바이러스 외피단백질유전자; RB, Right Border; LB, Left Border).

도 2은 아그로박테리움을 고추 자엽 절편에 감염시켜 형질전환시키고형질전환된 고추로 재분화 시키는 과정이다(A, 자엽을 전처리한 후 아그로박테리움과 공동배양하는 과정; B, shoot 유도배지에서 형질전환된 shoot가 유도되는 과정; C, shoot 분화배지에서 shoot가 발달되는 과정; D, shoot로부터 root가 생성되는 과정; E, root가 생성되어 재분화가 완료된 유식물체를 질석에서 순화되는 과정; F, 온실에서 육성되고 있는 고추 형질전환 식물체).

도 3는 형질전환 고추에 삽입된 오이모자이크바이러스 외피단백질유전자를핵산증폭반응(PCR)으로 확인한 그림이다(A, PCR 반응후 agarose gel에서 전기영동한 사진; B, 전기영동한 gel을 사용하여 PCR-DNA gel blot한 사진).

도 4는 다복을 재료로 하여 개발된 방법을 고추 재래종에 적용하였을 때에도 형질전환 shoot가 유도되는 과정이다(A, 태안재래; B, 강천재래; C, 제주재래; D. 다복).

본 발명은 (1)고추자엽의 형질전환, (2)슈트의 유도, (3)슈트의 신장, (4)뿌리의 유도라는 일련의 과정으로 구성된다. 고추를 형질전환하기 위해서는 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciensLBA4404)을 매개체로 고추 자엽조직에 감염시켜 유전자를 형질전환 시키고, MS(Murashige & Skoog)기본배지에 3% 수크로스(Sucrose), 0.4% 젤라이트(Gelrite), 호르몬제로 제아틴(Zeatin)과 인돌 아세트산(Indole Acetic Acid, IAA), 항생제로는 카나마이신(Kanamycin)과 카베니실린 (Carbenicillin)을 첨가한 슈트유도배지에 형질전환된 고추자엽을 배양하여 형질전환된 조직에서만 슈트(shoot)가 유도되도록 한다. 유도된 슈트(shoot)를 절단하여 MS 기본배지에 3% 수크로스, 0.4% 젤라이트, 호르몬제로 제아틴과 NAA, 항생제로는카나마이신과 카베니실린을 첨가한 슈트신장배지에서 계대배양하여 정상적인 어린 식물로 분화시킨다.

상기과정에 의해 분화된어린 형질전환체를 MS기본배지에 3%수크로스, 0.4%젤라이트, 호르몬제로 인돌부틸산(Indole Butylic Acid, IBA), 항생제로서 카나마이신과 카베니실린을 첨가한 뿌리유도배지에서 뿌리를 발생시키고 질석(vermiculite)용기에서 순화시켜 재분화된 형질전환 고추를 획득한다.

분화된 고추 종자는 생명공학연구소(대전)를 기탁기관으로 하여 1999년 2월 5일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC 0578BP이다. 이하 실시예를 통하여 본 발명의 내용을 구체적으로 설명하고자 하나 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 오이모자이크바이러스 외피단백질유전자 함유 운반체 제작

본 발명에 사용된 형질전환 유전자 및 운반체는 오이모자이크바이러스 외피단백질유전자 함유 운반체(pVCP)로서 1998년 3월 17일에 특허 출원된 '오이모자이크바이러스 저항성 토마토'(출원번호 : 제9096호, 발명자 : 손성한 외 4인) 개발에 사용된 것과 동일한 것을 사용하였다(도 1 참조).

<실시예 2> 고추 형질전환 및 슈트유도

고추(흥농, 다복)를 무균상태에서 발아시킨 자엽을 채취하여 양 끝에 상처를 낸 후 MS(Murashige & Skoog)기본배지(30 g/L sucrose, pH 5.6)에서 2일간전처리를수행하였다.전처리가끝난후자엽을아그로박테리움투마파시엔(Agrobacterium tumefaciensLBA4404(pVCP))와2일 동안MS기본배지에서 공동배양하여 유전자 형질전환을 시켰다. 이 후 고추 자엽을 멸균증류수로 세척하여 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens)을 씻어낸 후 슈트(shoot)유도배지(MS기본배지, 3% sucrose, 0.4% gelrite, 5 mg/L zeatin, 0.1 mg/L IAA, 100 mg/L kanamycin, 500 mg/L carbenicillin, pH 5.6)에 옮겨 형질전환된 자엽에서만 shoot가 유도되도록 하였다.(표 1, 도 2 참조).

<실시예 3> 형질전환 shoot의 재분화 및 뿌리유도

유도된 형질전환 슈트를 절단하여 슈트신장배지(MS기본배지, 3% sucrose, 0.4% gelrite, 2 mg/L zeatin, 0.05 mg/L NAA, 100 mg/L kanamycin, 500 mg/L carbenicillin, pH 5.6)에 계대배양하고 1개월간 키움으로써 생장점과 줄기를 갖는 정상적인 모양의 어린 식물로 분화시켰다. 분화된 형질전환 식물체에서 뿌리를 유도하기 위해 2 단계의 배지를 사용하였다.(표 1)

줄기와 생장점을 소유한 어린 형질전환체만을 선발하여 shoot의 기부(基部)를 절단하여 뿌리유도배지(MS기본배지, 3% sucrose, 0.4% gelrite, 5 mg/L IBA, 50 mg/L kanamycin, 500 mg/L carbenicillin, pH 5.6)에서 7일간 배양하여 뿌리를 유도시킬 수 있는 자극을 부여한 후 뿌리생성배지(1/2 salt MS기본배지, 3% sucrose, 0.4% gelrite, 50 mg/L kanamycin, 500 mg/L carbenicillin, pH 5.6)에서 뿌리가 생성, 분화되도록 배양하였다. 뿌리가 생성된 형질전환체를 멸균된 질석(vermiculite)에 이식하여 3 주간 순화시키고 이후 화분에 이식하여 온실에서 재배하였다.(도 2참조)

표 1. 고추 형질전환시 배지 조성 및 절차표

식품(품종)	전처리	explant	Agrobacterium공동배양	Shoot유도배지	Shoot신장배지	Root 유도	Root 생성
고추(다복)	MS기본배지(10 mg/LAgNO3)	자엽절편(2일간)	MS기본배지(2일간)	5 mg/Lzeatin0.1 mg/LIAA	2 mg/Lzeatin0.05 mg/LNAA	5 mg/L IBA(6일간)	1/2 MS기본배지
항생제조건	없음	100 mg/L kanamycin500 mg/L carbenicillin	50 mg/L kanamycin500 mg/L carbenicillin

<실시예 4> 형질전환체의 유전자 삽입 확인

발명에서 사용한 바이러스 외피단백질유전자가 이들 형질전환 개체에 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위하여 고추 형질전환체에서 genomic DNA를 분리하고 핵산연쇄증폭반응(PCR)을 수행하였다. 이때 바이러스 외피단백질유전자가 삽입되었는지 확인하는 PCR용 primer는 35S promoter의 3'-말단부위의염기서열(5'-TCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCT-3')을 PCR 5' primer(35S5')로 외피단백질유전자의3'-말단염기서열(5'-GCGAAACAAGCTTCTTATCGAATTCC-3')을 PCR 3'-primer(CPm3')로유전자의삽입을확인하였다.PCR은95℃에서 1분간 변성(denaturation),60℃에서 2분간 열처리(annealing), 72℃에서 2분간 연장(extension)의 온도 순환을 35회 반복, 수행하였으며, 이때 PCR의 정확도를 판단하기 위하여 식물내재 유전자인 ribulose1,5-bisphosphate carboxylase(RBCS)를 증폭 할 수 있는 primer인 5'-TACTATGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAG-3',5'-TTAGTAGCCTTCTGGCTTGATGGCGATGAAACT-3')를 반응액에 동시에 넣어 PCR을 수행하였다.

형질전환 고추는 0.8 kb 크기의 band가 생성되었으며(도 3A) 이를 서던 블랏(Southern blot analysis)으로 확인한 결과 pVCP binary vector중 CP 유전자가 고추 genome에 안정적으로 삽입되었음을 확인할 수 있었다(도 3B).

이 방법의 주요한 장점은 형질전환 슈트(shoot)로부터 뿌리를 3주 이내에 효율적으로 생성시키는 과정을 임목의 전형적인 2 단계의 뿌리 유도 과정을 고추에 적용한 것이 본 발명의 특징이다. 이 2 단계 뿌리 유도 기법은 기존의 담배, 토마토 등 원예작물의 뿌리유도 과정으로는 유도할 수 없었던 고추에서 뿌리 유도를 가능하게 한다. 또한 전과정에 소요되는 기간도 4 개월 내외로 비교적 단기간에 완료할 수 있으며 슈트에서 뿌리(root) 생성 효율도 약 25%로 우수하다. 본 발명에서 사용된 방법이 다른 고추품종에 대해서도 동일하게 적용될 수 있는 지 확인하기 위하여 국내 재래 품종인 강천재래, 제주재래, 태안재래에서도 동일한 방법으로 형질전환시킨 결과 재래종에서도 슈트가 잘 유도되어 대부분의 고추 품종에도 적용이 가능함을 보여주고 있다.(도 4 참조)

Claims (5)

1. 아그로박테리움을 이용하여 형질전환식물체를 제조하는 방법에 있어서,

   소정의 외래유전자를 함유한 아그로박테리움투마파시엔을 이용하여 고추자엽을 형질전환하는 단계와,

   형질전환된 고추자엽을 제아틴 및 IAA를 포함하는 슈트유도배지에서 슈트를 유도하는 단계와,

   유도된 슈트를 절단하여 제아틴 및 NAA를 포함하는 슈트신장배지에서 분화시키는 단계와,

   신장된 슈트의 기부를 절단하여 IBA를 포함하는 뿌리유도배지에서 뿌리를 유도하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 형질전환고추의 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 상기 제 1항의 형질전환 방법에 의하여 제조된 고추(KCTC 0578BP).