KR100804766B1

KR100804766B1 - Ｃｍｖ 병원형 감염에 내성인 형질전환 고추

Info

Publication number: KR100804766B1
Application number: KR1020060100689A
Authority: KR
Inventors: 한지학; 이윤희; 신선희; 정민; 최순호; 허남한; 이장하; 류기현
Original assignee: 주식회사 농우바이오
Priority date: 2006-10-17
Filing date: 2006-10-17
Publication date: 2008-02-18

Abstract

본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 CMVP0 - CP 유전자를 도입한 CMVP0(Fny-CMV) 및 CMVP0(Ca-P1-CMV) 감염에 복합 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 고추에 관한 것이다.

본 발명에 따른 아그로박테리움을 이용한 CMVP0 - CP 유전자가 도입된 형질전환 고추는 현존 고추 CMV 우점종인 CMVP0와 Ca-P1-CMV에 효과적인 복합 내성을 갖는 고추 형질전환체인 것으로 평가되었다.

형질전환, 고추, CMV, 병원형, Pathotype, 내성

Description

ＣＭＶ 병원형 감염에 내성인 형질전환 고추{Transgenic Hot Pepper Tolerant to CMV Pathotype}

도 1은 본 발명에서 사용한 CMVP0 - CP 유전자의 염기서열을 보여주는 사진이다.

도 2는 CMVP0 - CP 유전자를 형질전환한 고추의 육성과정을 보여주는 육성도이다 (A: 자엽의 형질전환 후 선발배지에 치상 및 배양(4주), B: 캘러스 형성(5주), C: 신초 성장(8주), D: 뿌리 형성(12주), E: 순화(15주), F: 하우스 재배(23주).

도 3은 PCR 조사를 통한 CMVP0 - CP 유전자 밴드(band)의 확인 결과를 보여주는 사진이다. (M: molecular marker, 1-9: transformed (T₀), N: non-transformed, P1- 2: bacterial cells harboring CMVPO - CP)

도 4는 T₀ 고추의 Southern blot 분석 결과를 보여주는 사진이다.

(1-6: transformed (T₀), N: non-transformed)

도 5는 Ca-P1-CMV에 접종 후 성장한 T₁ 세대 형질전환체 중에서 내성체(좌)와 이병체(우)를 보여주는 사진이다.

도 6은 Ca-P1-CMV에 접종 후 T₂ 세대 고추의 내성(위상단)과 이병성(하단) 개체를 보여주는 사진이다.

도 7은 T₂ #7 분리집단에서의 PCR 현상 결과를 보여주는 사진이다.

(M: molecular marker, 1-21: transformed (T₃), N: non-transformed, P: bacterial cells harboring CMVPO - CP)

도 8은 포장실험에서 형질전환체에 대하여 Ca-P1-CMV의 자연발생 정도를 조사한 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 CMVP0 - CP 유전자를 도입한 고추 CMV 병원형(pathotype)에 복합 내성을 갖는 형질전환 고추에 관한 것이다.

고추는 전 세계의 채소재배 면적 중 7위에 달하며 지구상의 인구 약 50억 명이 식품, 염료, 의약품 등 여러 가지 형태로 이용하고 있는 매우 중요한 채소 작물이다. 고추는 국내 종자시장에서도 매우 중요한 작물로 취급된다. 국내의 고추 종자 매출이 전 채소 종자시장의 약 20%(300억원)를 차지하고 있으며 고추 생산관련 총 산업 매출량은 연간 2조원에 달하는 경제적 가치가 매우 높은 작물이다. 또한 국내 고추 총생산량이 전 세계 고추 생산량의 5%를 차지하고 있을 만큼 국제적 위상이 높다. 그 이유는 우리나라 고추 육성가들의 육종기술이 뛰어나며 우수한 유전자원을 많이 확보하고 있고 고추의 재배, 생산, 가공, 판매망의 인프라가 잘 마련되어 있기 때문이다. 따라서 고추는 국내 작물 중에서 세계적 경쟁력을 갖추고 있는 몇 안 되는 작물중의 하나이다.

고추의 CMV(cucumber mosaic virus)는 한국뿐만 아니라 중국을 포함하여 세계적으로 농가의 고추 수확에 많은 피해를 주는 바이러스이다. 특히 1980년대 중반부터 한국 농가에 만연하기 시작한 CMV는 수확량에 많은 피해를 입혔다. 그러나 90년대 중반에 CMVP0(Fny-CMV) 바이러스 저항성 유전자원을 이용하여 육종적으로 CMV에 저항하는 신품종을 개발하였으며 그 이후 여러 종자회사에서 비슷한 CMV 저항성품종을 개발하였다. 그 결과, 2000년까지 CMVP0 바이러스 저항성 품종이 아무런 문제없이 상업화되었으나, 최근에 불행하게도 이런 저항성 품종들이 새로운 바이러스(Ca-P1-CMV)에 모두 감염이 되고 있다. Ca-P1-CMV은 국내 고추 품종을 모두 감염시키는 무서운 바이러스로서 고추 농가에 많은 피해를 주고 있기 때문에 새로운 품종개발이 절실한 상황이다. 또한 CMV는 중국, 인도 등에서도 만연하고 있어 고추 종자의 수출시장 선점의 측면에서도 Ca-P1-CMV 및 CMVP0에 복합 저항성 신규 고추를 개발하는 것은 그 의의가 크다 할 것이다.

고추에 있어서 CMV 형질전환체와 관련된 종래기술로는 CMV - CP 유전자를 이용하여 CMV에 저항하는 고추 형질전환체를 개발하여 T₃ 세대까지 선발한 보고(Cai et al., 2002)가 있다. 그러나 이는 확인이 되지 않은 CMV 균주(strain)에 의한 것이며 또한 현재 이 고추의 저항성 정도에 대한 후속보고가 없는 실정이다. 또 다른 기술은 고추 형질전환기술로서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 고추형질전환방법 관련 특허는 미국에서 처음 발표되었으나, 이후 지금까지 고추 형질전환이 성공 된 사례는 세계적으로 매우 드물며, 더욱이 고추형질전환의 재현성을 보여 주는 경우는 거의 없었다. 단지 국내 백경희 교수팀에서 형질전환된 고추를 이용한 논문 등에서 간헐적 성공 사례들이 발표되었을 뿐이다.

한편, 2000년 이후 갑자기 대량 발생한 Ca-P1-CMV은 최근 경기도 여주에서 Ca-P1-CMV을 고추에서 분리하였으며(Lee et al., 2006), 현재 국내에서 존재하는 고추 품종과 계통을 전부 이병시키는 바이러스이다. 이는 현재로서는 Ca-P1-CMV에 대한 저항성품종 개발이 구축되어 있지 않으며 저항성 유전자원 자체가 확실히 구명되어 있지 않다.

따라서 현존하는 고추에 감염피해를 주고 있는 2가지 중요한 CMV pathotype (P0, P1 또는 Fny-CMV, Ca-P1-CMV)에 복합 내성을 갖는 신규 고추의 개발이 절실히 요망되고 있다. 또한 Ca-P1-CMV에 대하여 내성을 갖을 뿐만 아니라 향후 도래할 수 있는 CMV 변종에 대하여도 잠재적 내성을 갖는 신규 고추의 개발도 요망되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 최근 고추에 감염이 심한 새로운 CMV(오이 모자이크 바이러스)에 대항하기 위하여 CMVP0 - CP 유전자를 형질전환 하여 현존 고추 CMV 우점종인 CMVP0와 Ca-P1-CMV에 내성을 갖는 고추 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CMVP0 - CP 유전자가 도입되어 다양한 CMV 병원형에 복합 내성을 갖는 형질전환 고추를 제공하는 것이다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 CMVP0 -CP 유전자를 도입한 고추 CMV 병원형(pathotype) 감염에 복합 내성을 갖는 형질전환 고추에 관한 것이다. 또한 상기 형질전환 고추를 이용한 교배된 고추에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 CMVP0 - CP 유전자를 도입한 CMVP0 및 CMVP1 감염에 복합 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 고추에 관한 것이다.

본 발명의 형질전환 고추는 고추의 외식체(explant)를 캘러스 유도 배지에 치상하여 전 배양하는 단계; 상기 전 배양한 외식체를 CMVP0 - CP 유전자가 도입된 아그로박테리움과 공동 배양하는 단계; 상기 공동 배양한 외식체를 선별 배지에서 배양하여 형성된 캘러스를 선발하는 단계; 상기 캘러스를 절단하고 이를 신초 유도 배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계; 상기 신초를 뿌리 유도 배지에서 배양하여 뿌리를 형성시키는 단계 및 상기 뿌리가 형성된 식물체를 순화시키는 단계를 포함하여 육성되어 CMVP0 및 Ca-P1-CMV 감염에 복합 내성을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 CMVP0 - CP 유전자가 도입된 아그로박테리움은 CMVP0 - CP(그림 1) 유전자를 pCAMBIA 2300 벡터에 삽입하여 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움 EHA 105 균주에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움을 50㎎/ℓ 카나마이신, 50㎎/ℓ 리팜피신 및 100μM 아세토실린곤을 포함하는 YEP 배지에서 배양한 배양액을 원심분리한 후, MS 기본배지로 O.D₆₀₀ 값이 0.3~0.6이 되도록 희석한 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구성을 바람직한 실시 예를 통하여 보다 상세히 설명할 것이나, 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 기재된 바에 의해 한정되어야 할 것이다.

<실시 예 1> CIT 방법을 이용한 고추 형질전환

(주) 농우바이오 보유 계통 P915, P2377을 1/2MS 배지 (sucrose 1.5% + 0.8% agar, pH 5.8)에서 8-10일간 발아 후 자엽(cotyledon)을 칼로 자른 뒤 호르몬을 처리한 배지 (0.8% agar, pH 5.8)에서 치상한다. 호르몬은 2,4-D 1 ㎎/ℓ, 또는 IAA 1 ㎎/ℓ, 또는 zeatin 2 ㎎/ℓ + IAA 0.3 ㎎/ℓ 조합들을 사용할 수 있다. 치상 기간은 20-60시간 내이며 광조건 하에서 25℃를 유지하는 배양기(incubator)에서 배양한다. Agrobacterium과의 공동배양을 통한 형질전환을 하기 위하여 자엽(cotyledon)을 MS 기본배지 + 0.8% agar + 2 ㎎/ℓ BA + 500 ㎎/ℓ kanamycin에 배양하여 신초(shoot)를 유도한다. 공동배양을 위해서 Agrobacterium EHA 105를 사용하였으며 O.D 값이 0.3-0.6일 때 약 20분간 접종하고 와싱버퍼(washing buffer)로 여러 차례 Agrobacterium을 세척한 다음 48-70 시간동안 광조건에서 공동배양한다. 외식체(explant)들을 MS배지에 kanamycin 80 ㎎/ℓ, cefotaxime 100 ㎎/ℓ, lilacilline 300 ㎎/ℓ, zeatin 2.0 ㎎/ℓ + IAA 0.3 ㎎/ℓ을 첨가한 배지에 치상 후 4-5주를 incubator안에서 키우면 캘러스(callus)가 자라기 시작한다. 캘러스는 이후 약 5-8주 더 키운 다음 MS배지에 kanamycin 30-80 ㎎/ℓ, cefotaxime 300 ㎎/ℓ, zeatin 2.0 ㎎/ℓ + IAA 0.01 ㎎/ℓ를 첨가하여 치상 후 약 한달을 키우면 shoot가 형성하기 시작한다. 신초 신장(Shoot elongation)은 이후 약 2달간 계속된다. Shoot을 MS배지에 kanamycin 20-30 ㎎/ℓ, cefotaxime 200 ㎎/ℓ를 첨가한 배지에 치상하면 뿌리가 4-5주 뒤에 형성한다. 뿌리가 약 10 cm 까지 성장한 뒤에 배지를 잘 제거한 후 지피포트(zippy pot)에 옮겨 심은 뒤 몇 일간 같은 incubator 안에 둔 후 온실에서 재배한다 (그림 2).

<실시 예 2> PCR을 이용한 형질전환체 검증

녹색형광단백질(green fluorescence protein: GFP)을 발현하는 callus와 발현하지 않는 callus에서 각각 DNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. 사용한 PCR 프라이머(primer)로는 35S promoter에 있는 sense로서 35S-5' C: 5' - ATGAC GCACAATCCCACTAT - 3', antisense로서는 CMVP0-CP-3': 3'-C CTCACGAGGGTCAGACT-CCATGG-GG-5'를 사용하였다. PCR 반응으로 PCR premix (Bioneer)를 사용하였고 반응조건은 55℃/1분; 94℃/1분; 72℃/1분; 35cycle 이었다. T₀ 식물체가 확보되면 PCR 실험을 통하여 CMVP0 - CP band 유무를 조사하였다 (그림 3).

<실시 예 3> Southern blot을 통한 형질전환체의 복제(copy) 수

서로 다른 형질전환체 6개체 (T₀)에서 genomic DNA를 추출하여 삽입된 CMVP0 - CP 유전자의 copy 수를 조사하였다. 각 DNA 샘플당 30㎍을 Dra I과 Xba I으로 절단한 다음 0.8% agarose gel안에 20 voltage에서 14시간 전기영동하였다. 총 16시간 동안 blotting한 다음 CMVP0-CP 유전자를 ³²P-dCTP로 labelling하여 Southern blot에 20시간/65℃ 조건으로 합성하고 높은 엄밀도(stringency)로 세척하였다. Southern blot 결과에서 보는 바와 같이 형질전환체의 대부분 유전자가 게놈 상에 1 copy가 존재하는 것으로 여겨지며, 또한 형질전환체 3번과 4번은 같은 band locus가 보임으로 기원(origin)이 같은 형질전환체이며 나머지는 서로 다른 형질전환체인 것으로 간주된다(그림 4).

<실시 예 4> CMVP1 내성 고추 형질전환체 선발을 위한 접종 및 ELISA 진단

CMVP1을 Nicotiana tabacum cv. Xanthi - nc의 담배 4-5매에 접종 후 2-3주 이상이 되면 모자이크 증상을 나타낸다. 이를 접종원으로 이용한다. 접종원을 수확하여 유발 등을 이용하여 마쇄하고 완충액(0.01M Potassium Phosphate buffer, pH 7.0)을 첨가하여 접종원(w:v = 1:4)을 만든다. 이렇게 만들어진 접종원을 고추 자엽 2매에 carborundum(600mesh)법을 이용하여 접종을 한다. 이렇게 접종을 하면 빠르면 5일부터 발병되기 시작을 하여 약 3주 정도 되면 발병개체를 조사할 수 있는 기간이 된다. 이렇게 조사를 한 후 육안조사의 경우 바이러스 진단이 정확하지 않아 이 때 바이러스의 감염여부를 한 번 더 확인하기 위하여 ELISA법을 이용하여 검정을 실시하였다.

본 검정 시험에서 사용하는 ELISA Kit는 상기의 방법을 이용한 DAS-ELISA (Direct double antibody sandwich - Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)를 사용하는데, 다원항체(polyclonal antibody)를 이용하는 방법으로 미국 Agdia사에서 생산하여 (주)기산바이오텍에서 위탁판매하고 있는 ELISA Kit를 이용하여 진단을 하였다.

총 595개의 T₁ 형질전환체 고추를 검정한 결과 Ca-P1-CMV에 매우 내성이 강한 19점을 최종 선발하였다(표 1). 그리고 이 19점은 PCR 결과 CMVP0 - CP 유전자를 모두 보유하고 있었다. Ca-P1-CMV에 내성인 형질전환체는 원예적으로 이병성 고추와 판이하게 차이가 난다(그림 5). 내성체는 정상적으로 성장하며 반면에 Ca-P1-CMV에 이병체는 첫째 전체 외형이 잘 자라지 못하여 작으며 둘째로 잎이 연한 초록 및 노란 색으로 변하여 생육진전에 지장이 생기며 셋째로는 과실이 작으며 종자도 정상에 비해 약 20% 정도 밖에 맺히지 못한다.

[표 1] T₁ 고추에 대한 Ca-P1-CMV 내성 조사.

BN	Number of plants tested	Eye checking/ No.of tolerance	1st ELISA/ No.of tolerance	2nd ELISA/ No.of tolerance
CM1(P915)	77	0	?	?
CM2(P915)	53	0	?	?
CM3(P915)	77	48	9	4
CM4(P915)	80	45	11	5
CM5(P915)	77	35	6	2
CM6(P915)	64	2	0	?
CM7(P2377)	51	39	5	3
CM8(P2377)	53	18	3	0
CM9(P915)	63	21	12	5
Total	595	208	46	19
control	121	0	-	-

19점의 선발된 T₁ 형질전환체 고추를 자가수분하여 T₂ 세대를 확보한 다음 다시 접종시험을 하였다(표 2). 총 357점의 T₂ 고추를 검정한 결과 112점의 강한 내성 을 가진 고추를 선발하였다. T₁에 비해서 내성체 수가 많은 이유는 T₁ 내성체에서 자가 교배를 통하여 CP 유전자에 의해서 저항성을 부여하는 인자들이 집적되었을 것으로 판단된다. T₂ 고추 역시 T₁에서 본 것처럼 내성과 이병성의 원예적인 차이가 확연히 차이가 났다(그림 6).

[표 2] T₂ 고추에 대한 Ca-P1-CMV 내성 조사.

Transgenic pepper	Number of plants tested	Tolerant (Eye-judgment)	Tolerant (1st ELISA)	Tolerant (2nd ELISA)
CMVPO-CP-B20	50	22	9	3
CMVPO-CP-E2	45	42	20	10
CMVPO-CP-E7	45	45	23	16
CMVPO-CP-H14	62	54	38	28
CMVPO-CP-H15	86	61	37	24
CMVPO-CP-H16	41	31	31	18
CMVPO-CP-H17	28	24	22	13
Total	357	279	180	112
control	196	0	?	?

이중에서 원예적으로 양호한 특성을 보이는 30점을 재 선발하여(그림 7) 동형 접합성(homozygosity)을 조사하였다. PCR을 통하여 각 T₂ 세대에서 아래처럼 약 20점을 검정했을 때 전부 밴드를 가지는 개체를 선발하여 T₃ 세대를 구축하였다.

현재 국내에서는Ca-P1-CMV의 감염도가 심하다. 따라서 T₃ 세대를 노지포장에서 CMV에 자연 발생되도록 하여 실제 자연에서의 감염도를 조사하고자 하였으며 바이러스 유무는 ELISA로 검정하였다. Ca-P1-CMV의 감염 매개체는 진딧물이다. 따라 서 진딧물이 만연하는 정도에 따라 감염도가 차이가 있지만 본 실험구(여주)에서는

대조구에 비해서 형질전환체가 상당히 적게 감염되는 것으로 나타났다(그림 8). 파종 후 2달 까지 형질전환체 약 75%는 전혀 감염되지 않았으나 같은 기간에 비형질전환체는 20%만 감염이 지연되었다. 따라서 형질전환체는 감염에 대한 지연효과가 매우 높았으며 또한 외형적으로 비형질전환체 잎은 감염이 매우 심하였으며 대조적으로 형질전환체 잎은 약간의 모자이크 반응을 보였다.

<실시 예 4> T₃ 형질전환체의 CMVP0 내성 고추 집단 선발

현재 CMVP0에 대한 내성 고추는 국내 종자회사에서 품종으로 만들었기 때문에 CMVP0 단독 감염에 대한 문제는 없다. 그러나 Ca-P1-CMV은 점점 만연해지고 있으며 고추의 이병정도는 CMVP0보다 상위개념이어서 Ca-P1-CMV의 내성개발이 급선무이며 본 발명으로 이러한 필요조건을 충족하였다고 본다. 그러나 바이러스는 항상 게놈 상에서 쉽게 돌연변이(mutation) 되기 때문에 향후 어떤 CMV 변이체가 만연되더라도 본 발명체가 내성을 유지할 수 있는지가 매우 중요한 관건이다. 통계적으로 바이러스 유전자의 염기배열이 90% 이상의 유사성이 있으면 유전자 발현차단(gene silencing)으로 내성을 갖는 것으로 알려져 있다.

CMVP0와 Ca-P1-CMV간 CP 유전자의 아미노산 유사성이 96%이기에 Ca-P1-CMV에 내성을 갖는 고추형질전환체가 CMVP0에도 내성을 갖는지 조사하였다. T₃ 고추 동형 접합체(homozygote) 49점을 CMVP0로 2번 연속 접종을 한 다음 ELISA 조사를 하였다. 그 결과 CMVP0에 매우 강한 고추 36점을 확보하게 되었다(표 3). 따라서 Ca-P1-CMV에 저항성을 갖는 고추형질전환체는 CMVP0에도 저항을 가짐으로서 향후 어떤 CMV 변이체 또는 strain에도 내성을 가질 수 있을 것으로 평가되었다.

[표 3] Ca-P1-CMV에 내성을 갖는 T₃ 세대의 CMVP0에 감염 검정

	Number of plants tested	Susceptible	Resistant
T₃(P915)	49	13	36
Non-transformed	49	48	1(접종miss)

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 CMVP0 - CP 유전자가 도입된 형질전환 고추는 현존 고추 CMV 우점종인 CMVP0와 Ca-P1-CMV에 효과적인 복합 내성을 갖는 고추 형질전환체인 것으로 평가되었다.

또한 본 발명에 따른 아그로박테리움을 이용한 CMVP0 - CP 유전자가 도입된 형질전환 고추는 다양한 CMV 병원형에 대하여 잠재적인 복합 내성을 나타낼 수 있을 것으로 기대되었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 CMVP0 - CP 유전자를 도입하여 CMVP0 및 Ca-P1-CMV 감염에 복합 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 고추.
제1항에 있어서, 상기 형질전환 고추를 자가수분한 것을 특징으로 하는 고추.
제1항에 있어서, 상기 형질전환 고추는 고추의 외식체(explant)를 캘러스 유도 배지에 치상하여 전 배양하는 단계; 상기 전 배양한 외식체를 CMVP0 - CP 유전자가 도입된 아그로박테리움과 공동 배양하는 단계; 상기 공동 배양한 외식체를 선별 배지에서 배양하여 형성된 캘러스를 선발하는 단계; 상기 캘러스를 절단하고 이를 신초 유도 배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계; 상기 신초를 뿌리 유도 배지에서 배양하여 뿌리를 형성시키는 단계 및 상기 뿌리가 형성된 식물체를 순화시키는 단계를 포함하여 육성된 것을 특징으로 하는 형질전환 고추.
제2항에 있어서, 상기 CMVP0 - CP 유전자가 도입된 아그로박테리움은 CMVP0 - CP 유전자를 pCAMBIA 2300 벡터에 삽입하여 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움 EHA 105 균주에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움을 YEP 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 형질전환 고추.