KR101336507B1

KR101336507B1 - 오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스

Info

Publication number: KR101336507B1
Application number: KR1020110110988A
Authority: KR
Inventors: 김국형; 서장균; 권선정; 박상호; 최홍수; 김미경; 곽해련; 이수헌; 김정수; 손성한
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-12-03
Also published as: KR20120006463A

Abstract

본 발명은 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 각각 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) 3종을 포함하는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물을 제공한다. 또한 기탁번호 KACC95081P, KACC95082P 또는 KACC95083P의 아그로박테리움 투메파시언스를 제공한다.

Description

오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스{Agrobacterium tumefaciens species capable of reconstituting infection activity of Cucumber mosaic virus in plant}

본 발명은 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스에 관한 것이다.

생명공학 연구를 위해서는 수많은 기술들이 필요한데, 그 중에서도 형질전환 기술은 기본적으로 없어서는 안 될 중요한 기술 중 하나이다. 형질전환이란, 말 그대로 본래 가지고 있지 않은 형질(유전자)을 도입하거나 본래 가지고 있는 형질을 제거하는 것이다. 이를 통해서 그 형질에 대한 기능을 분석할 수 있다.

특히, 식물의 형질전환 기술은 식물유전자의 기능 또는 발현 분석에 매우 유용하게 활용할 수 있는 중요한 기술로서 식물의 발달, 분화에 관여하는 여러 가지 현상을 규명하거나 유용유전자의 도입을 통한 신 기능성 품종을 개발하는 기술로 활용되어 왔다. 일반적으로 식물의 형질전환은 조직배양 기술을 바탕으로 발달해 왔으나 조직배양을 이용한 경우 재분화(regeneration) 기간이 길어 시간과 노력이 많이 요구되는 단점이 있고, 재분화 과정에서의 체세포변이 또는 자연적인 기형 형성이 나타나는 등의 심각한 문제점이 제기되었다. 따라서, 조직 배양을 거치지 않는 식물 형질전환 기술이 개발되었는데, 이는 조직배양을 거치지 않고 식물이 생장하는 상태 그대로 생장점 부위에 위치하는 세포들을 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포로부터 재분화하는 줄기에서 형질전환된 종자를 획득하여, 유전적으로 안정된 형질전환 식물체를 획득할 수 있는 기술이다. 이 기술에서 파생된 것이 아그로박테리움 균주(Agrobacterium strain)를 이용한 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration) 방법이다.

아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)은 많은 쌍자엽 식물들에서 근두암종병(Crown gall disease)을 일으키는 토양 세균으로서 오랫동안 알려져 왔다. 1970년대에는, 아그로박테리움의 Ti 플라스미드가 병원성과 관련되어 있으며, Ti 플라스미드의 일부인 T-DNA는 식물 게놈 내로 통합된다는 것이 밝혀졌다. 이후에는 T-DNA가 근두암종의 형성에 필요한 호르몬 합성 유전자들(시토키닌 및 옥신(auxin))을 포함하며, 이들 유전자들은 세균으로부터 유도되지만, 식물 내에서 발현된다는 것이 밝혀졌다. Ti 플라스미드의 독성영역(Vir 영역)내에 위치된 일군의 유전자들은 T-DNA의 절제 및 이들의 식물로의 이동에 필요하며, 또한 T-DNA의 반대쪽 말단들에 위치한 오른쪽 경계(border) 서열 및 왼쪽 경계 서열로 명명되는 경계 서열들이 그 절제에 요구된다는 것도 밝혀졌다.

오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)는 1916년 처음으로 보고되었다(Doolittle, S, The mosaic diseases of cucurbits, U.S.D.A. Agri. Bull (1961) 879:69). CMV는 직경 28-30nm인 공모양 3분절 게놈의 다입자성 바이러스로서, 오이(Cucumis sativus) 등에서 잎에 모자이크 증상을 나타내고, 과실은 작아지고 기형이 되어 수확량은 물론 상품가치가 크게 떨어지게 한다. CMV는 매우 넓은 범위의 숙주 범위를 가지며, 세계 전역에 분포되어 있다.

CMV의 유전체(genome)는 3개의 양성 센스 단일 가닥(positive-sense single-stranded) RNA들(RNA1, RNA2 및 RNA3)과 RNA3으로부터 파생된 RNA4가 있다. RNA1 및 RNA2는 병원성을 지니고 있고, 바이러스 복제와 관련된 각각 1a 및 2a 단백질을 코딩하고 있다. RNA3은 3a 단백질과 코트 단백질(coat protein; CP)을 코딩하고 있다. 3a 단백질은 세포 대 세포 이동 기능과 관련되어 있다. 코트 단백질은 RNA3으로부터 전사된 서브게놈(subgenome) RNA(RNA4)로부터 번역된다. 이러한 특성들은 브로모바이러스(bromovirus), 이라바이러스(ilarvirus) 및 알팔파 모자이크 바이러스(alfalfa mosaic virus)에서도 나타난다.

국제특허출원번호 PCT/JP1999/005386호(국제출원일 1999. 09. 30)는 식물 형질전환 벡터에 관한 것으로서, 아그로박테리아의 vir 단백질들에 의한 벡터의 경계 서열들의 인식 가능성을 상승시키도록 변형된 아그로박테리아를 사용하고, 따라서 T-DNA 외의 DNAs의 식물 염색체들 내로의 전달 가능성을 낮추는 식물 형질전환용 벡터들, 특히, 상기 벡터들은 아그로박테리아의 vir 단백질들에 의해 인식될 수 있는 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열들, 상기 경계 서열들의 사이에 위치하고, 식물 내로 도입될 유전자가 그 안으로 삽입될 수 있는 T-DNA 서열, 그리고 박테리아 내에서 상기 벡터들의 복제를 가능하게 하는 복제 개시점을 포함하며, 복수의 왼쪽 경계 서열들을 가지는 것을 특징으로 하는, 식물 형질전환에 사용되는 벡터들이 개시되어 있다.

따라서 본 발명자들은 국내 포장의 팥에서 분리한 오이 모자이크 바이러스의 감염성 클론을 바이너리 벡터(binary vector)에 담아 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용해 식물체에 도입하는 방법인 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration) 방법으로 바이러스 유전자를 식물체에 도입하여 감염성 CMV 활성이 재구성됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 각각 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) 3종을 포함하는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물을 제공한다. 또한 기탁번호 KACC95081P, KACC95082P 또는 KACC95083P의 아그로박테리움 투메파시언스를 제공한다. 바람직하게는 상기 식물체는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)인 것을 특징으로 하는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물에 관한 것이다. 전통적인 조직배양을 이용한 식물 형질전환 기술은 형질전환 과정의 낮은 효율 뿐만 아니라 재분화(regeneration) 기간이 길어 시간과 노력이 많이 요구되는 단점이 있고, 재분화 과정에서의 체세포 변이 또는 자연적인 기형 형성이 나타나는 등의 심각한 문제점이 있었다. 본 발명의 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물을 사용하면 식물체 내로 유전자를 도입하는데 있어서, 전통적인 식물 형질전환과 비교했을 때 신속하고 편리하다는 장점이 있다. 이러한 활용도가 높은 식물 형질전환용 유전자운반체 개발은 식물의 발달, 분화에 관여하는 여러 가지 현상을 규명하거나 유용유전자의 도입을 통한 신 기능성 품종을 개발하는 기술로 활용될 수 있다.

도 1은 pSNU1 벡터의 구조 모식도를 나타낸다.
멀티플 클로닝 사이트(multiple cloning site) 부분:1-68bp, cis-cleaving 리보자임 서열(Rz):69-119bp, NOS 폴리-A:184-436bp, T-보더(오른쪽):474-499bp, pVS1 sta:1540-2540bp, pVS1 rep:3223-4223bp, pBR322 bom:4543-4803bp, pBR322 ori:4943-5223bp, 카나마이신(Kanamycin) 저항 유전자(aadA):5514-6308bp, T-보더(왼쪽):6733-6758bp, 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus; CaMV) 35S 듀플리케이트 프로모터:6877-7628bp
도 2는 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염성 클론의 구조 모식도를 나타낸다. A) CMV RNA1이 클로닝된 pCkpaR1 모식도, B) CMV RNA2가 클로닝된 pCkpaR2, C) CMV RNA3이 클로닝된 pCkpaR3; CP: 코트 단백질(coat protein).
도 3은 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 통한 감염성 클론의 접종 방법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 4는 CMV에 감염된 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물체의 병징 발현 사진을 나타낸다.
도 5는 RT-PCR 기법을 이용하여 CMV 감염성 여부를 확인한 젤 사진이다.
레인 1: 사이즈 마커(size marker), 레인 2: 대조구(mock), 레인 3: 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 통해 CMV 감염성 클론이 접종된 실험구(상엽), 레인 4: 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 통해 CMV 감염성 클론이 접종된 실험구(접종된 잎)

본 발명의 제 1의 양태는 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 각각 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) 3종을 포함하는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물을 제공한다. 바람직하게는 상기 식물체는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)인 것을 특징으로 하는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제 2의 양태는 또한 기탁번호 KACC95081P, KACC95082P 또는 KACC95083P의 아그로박테리움 투메파시언스를 제공한다.

pCkpaR1(서열번호 1), pCkpaR2(서열번호 2), pCkpaR3(서열번호 3) 유전자를 포함한 균주는 2008년 5월 21일 농업생명공학연구원에 각각 기탁번호 KACC 95081P, KACC 95082P, KACC 95083P로 기탁되었다.

본 발명에서 사용되는 '아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)'라는 용어는 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미한다. 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 바늘이 없는 주사기를 사용해서 압력을 줌으로써 식물의 잎에 주입하여 식물체 세포로 원하는 유전자를 이동시키는 방법이다. 이는 전통적인 식물 형질전환과 비교하면 신속하고 편리하다는 장점이 있다.

본 발명에서 사용되는 '벡터'라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다. 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 식물세포, 원핵세포, 효모세포, 곤충세포를 포함한다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 오이 모자이크 바이러스의 감염성 클론을 이용한 식물체 형질전환용 재조합 벡터의 설계 및 제조

오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 감염성 클론을 운반하기 위한 벡터로서 pSNU1 벡터를 이용하였다(도 1). pSNU1 벡터는 T-DNA의 왼쪽 보더(left border), 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus; CaMV)의 double 35S promoter, 멀티플 클로닝 사이트(multiple cloning site; MCS; EcoRI, XbaI, StuI, NcoI, BamHI, KpnI, SacI, MluI, XhoI, SrfI, SmaI, SpeI), cis-cleaving ribozyme sequence(Rz), NOS terminator(NOS poly-A), T-DNA의 오른쪽 보더(right border)를 순서대로 포함하고 있다. 따라서 아그로박테리움(Agrobacterium)에 형질전환하여 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 통해 식물에 원하는 유전자를 전달할 수 있다. 또한 pSNU1 벡터는 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자를 포함하고 있다.

T-DNA를 바탕으로 한 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)이 가능한 CMV 감염성 클론을 제작하기 위해, 국내 포장의 팥으로부터 분리한 CMV 분리체(isolate)을 이용하였다. 해당 CMV 분리체(isolate)에 의해 감염된 팥으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 이 전체 RNA로부터 프라이머 (5'-GGAATTCTGGTCTCCTTTTRGAGRCC-3'(서열번호 4) 혹은 5'-AGGGATCCTGGTCTCCTTTTRGAGRCC-3'(서열번호 5))를 이용하여 역전사 반응을 통해 CMV RNA1, RNA2, RNA3에 대한 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA로부터 CMV RNA1을 증폭하기 위해 프라이머 (5'-AGGATCCGTTTATTTACAAGAGCGTACGG-3'(서열번호 6)와 5'-AGGGATCCTGGTCTCCTTTTRGAGRCC-3'(서열번호 7))을 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. CMV RNA2를 증폭하기 위해서는 프라이머 (5'-AGGGATCCGTTTATTTACAAGAGCGTACGG-3'(서열번호 8)와 5'-GACTAGTGGTCTCCTTTTRGAGRCC-3'(서열번호 9))를, CMV RNA3를 증폭하기 위해서는 프라이머 (5'-AGGGATCCGTAATCTTACCACTGTG-3'(서열번호 10)와 5'-AGGGATCCTGGTCTCCTTTTRGAGRCC-3'(서열번호 11))을 이용하였다. 각 프라이머들을 이용하여 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분을 1주기로 35주기 반복한 후, 72℃에서 10분간 반응시켜 CMV 각 RNA의 염기서열을 함유한 DNA 절편을 증폭하였다.

pSNU1 벡터에 클로닝하기 위해 CMV RNA1 PCR 산물을 BamHI으로 처리하여 벡터의 해당 위치에 클로닝하였으며 CMV RNA2의 경우 BamHI과 SpeI, CMV RNA3의 경우 BamHI 제한 효소를 이용하여 클로닝하였다. 그 결과 얻게된 CMV RNA1이 클로닝 된 벡터를 pCkpaR1(서열번호 1), CMV RNA2가 클로닝 된 벡터를 pCkpaR2(서열번호 2), CMV RNA3이 클로닝 된 벡터를 pCkpaR3(서열번호 3)이라 명명하였다(도 2).

pCkpaR1(서열번호 1), pCkpaR2(서열번호 2), pCkpaR3(서열번호 3) 유전자를 포함하는 균주는 2008년 5월 21일 농업생명공학연구원에 각각 기탁번호 KACC 95081P, KACC 95082P, KACC 95083P로 기탁되었다.

< 실시예 2 > 아그로 - 인필트레이션(Agro-infiltration)을 통한 감염성 클론의 접종 및 감염성 확인

각 클론의 플라스미드 DNA를 이용하여 전기충격(electroporation) 방법을 통해 아그로박테리움 균주(Agrobacterium strain) GV2260을 형질 전환하였다. pCkpaR1, pCkpaR2 및 pCkpaR3로 각각 형질 전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)을 5ml의 YEP 액체 배지 (50mg/ml의 카나마이신(kanamycin)과 50mg/ml의 리팜피신(rifampicin) 포함)에서 30℃의 조건에서 16시간 동안 진탕배양한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지 (50mg/ml의 카나마이신(kanamycin), 50mg/ml의 리팜피신(rifampicin)과 20uM의 아세토시린존(acetosyringon) 포함)에 접종하여 30℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양하였다. 배양액을 4800G에서 10분간 원심분리하여 아그로박테리움(Agrobacterium)을 침전시키고 MMA 인필트레이션(infiltration) 버퍼 (MS salts, 10mM MES, pH5.6, 200uM 아세토시린존(acetosyringon))에 600nm의 파장에서 O.D. 1의 농도로 다시 현탁시켰다. 그 다음 현탁액을 30℃의 조건에서 2시간 동안 진탕배양하였다. pCkpaR1, pCkpaR2 및 pCkpaR3로 각각 형질 전환된 아그로박테리움(Agrobacterium) 배양액을 같은 비율로 섞은 후 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 잎의 배축면에 1ml 주사기를 이용하여 압력으로 인플트레이션(infiltration) 하였다. 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration) 후 5-8일 후 RT-PCR 및 병징의 발달 관찰을 통해 CMV DNA 클론의 감염성을 확인하였다(도 3). 그 결과, CMV 감염성 클론을 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 통해 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물에 접종한 후 7일 후 상엽으로부터 CMV에 의해 나타나는 병징을 관찰할 수 있었다(도 4).

또한 CMV 감염성 클론을 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 통해 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물에 접종한 후 7일 후 상엽으로부터 전체 RNA를 추출한 후 CMV RNA3에 특이적인 프라이머 (5'-TCCCTGTTGAGCCCCCTTACTTT-3'(서열번호 12) 와 5'-CAACTCAGATCCCGCCACAGA-3'(서열번호 13))를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 젤 전기영동(gel electrophoresis)을 통해 PCR 산물을 확인하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 20초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1주기로 35주기 반복한 후, 72℃에서 10분간 반응시켰다.

확인결과 CMV 감염성 클론을 접종한 식물에 대해서 예상되는 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있었으며, 따라서 해당 식물이 CMV에 의해 전신 감염(systemic infection)이 되었음을 확인할 수 있었다(도 5).

농업생명공학연구원

KACC95081

20080414

농업생명공학연구원

KACC95082

20080414

농업생명공학연구원

KACC95083

20080414

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Claims

기탁번호 KACC95081P의 아그로박테리움 투메파시언스.
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