KR20060107060A - 한국산 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자를 이용한 식물체내에서의 외래 유전자의 발현을 증대시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한국산 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자, 상기 유전자를 발현시키는 벡터, 상기 벡터가 형질전환된 아그로박테리움 형질전환체 및 상기 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 서열번호1로 기재되는 염기서열로 이루어지는 유전자를 식물체 내에서 발현시키면 그 식물체에 동시에 도입된 다른 유용한 유전자의 발현을 증대시켜 유용유전자의 발현에 의한 단백질의 발현량, 발현기간 및 안정성이 증대 되도록 하는 한국산 오이모자이크바이러스 유래 2b유전자, 상기 유전자를 발현시키는 벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 아그로박테리움 형질전환체(기탁번호:KACC 95033P) 및 상기 아그로박테리움 형질전환체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
오이모자이크바이러스 2b유전자, 발현증대
Description
도 1은 RT-PCR에 의하여 클로닝된 본 발명의 파프리카에 감염된 한국산 오이모자이크바이러스 2b유전자의 염기서열을 나타낸다.
도 2는 한국산 CMV 2b 단백질과 다른 CMV 2b 단백질들과의 아미노산 서열 상동성 비교 결과이다.
도 3은 한국산 CMV와 다른 CMV와의 계통수(phylogenetic tree)이다.
도 4는 KG-CMV 2b유전자를 발현시키는 식물형질전환용 벡터 지도이다.
도 5는 담배잎 조직에서의 2b유전자의 발현에 의한 GFP 발현증대 효과를 나타낸다.
도 6은 담배잎 조직에서의 GFP 및 2b 유전자의 mRNA 발현량을 분석한 결과이다.
본 발명은 식물체 내에 도입된 유용유전자의 발현을 증진시켜 유전자 산물인 단백질의 발현량 및 발현기간을 증대시키고 안정화시키는데 필요한 유전자를 탐색하는 과정에서 유전자침묵(Gene silencing)을 억제한다고 알려진 2b 유전자의 신규기능을 확인하고 생명공학의 핵심분야인 분자농업(molecular farming)에 활용하고자 개발된 2b유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움에 관한 것이다.
대부분의 진핵생물은 상동성에 의존한 RNA 파괴시스템을 유전자침묵현상(post-transcriptional gene silencing, PTGS)이라 하며, 동물에서는 RNA 간섭(RNA interference), 진균에서는 quelling이라고 하지만 기존원리는 동일하다. 어떤 식물 바이러스는 유전자침묵현상을 차단하는 단백질을 암호하는 것으로 알려져 있는데, poty 바이러스의 HC-Pro(helper component-proteinase) 단백질은 유전자침묵현상이 유지되는 것을 방해하고, 오이모자이크바이러스의 2b 단백질은 새로 생겨나는 잎에 PTGS가 일어나는 것을 차단한다. 또한 감자바이러스 X의 p25 단백질은 유전자침묵현상이 식물체 전체로 퍼지는 것을 차단하는 것으로 알려져 있다(The Plant Journal (2002), 29(5), 555~567).
생명공학은 현재에도 급속히 발전하고 있고 그 범위도 넓어져 가고 있다. 특히 식물 또는 동물들에게서 인간에게 유용한 특성을 발휘할 수 있도록 외래유전자를 도입하여 형질전환식물 또는 형질전환동물을 제조하는 기술분야에 관한 연구가 활발하며, 그중에서도 동물에 비하여 식물을 대상으로 한 유전자조작은 더욱 실용 화단계에 와있다. 이처럼, 외래유전자를 도입하여 신기능의 GM작물을 개발함에 있어서 외래유전자 도입에 따른 효과를 가시적으로 얻기 위해서는 도입유전자의 발현량을 일정 이상 증대시켜야 할 뿐만 아니라, 도입유전자의 발현을 안정적으로 유지시켜야 한다. 그러나 상기한 유전자 침묵(gene silencing)과 같은 문제가 발생하여 유용한 도입유전자의 안정적인 발현을 안정적으로 증대시키기 곤란하다는 문제가 빈번하게 발생하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 식물체에 도입된 다른 유용한 유전자의 발현량, 발현기간을 혁신적으로 증대시키고 발현단백질의 안정화를 도모할 수 있는 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자의 신규기능을 개발하고 응용가능성을 확인하여 생명공학분야에 응용될 수 있도록 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 외래유전자를 도입한 형질전환식물에 있어서 한국산 오이모자이크바이러스 2b유전자를 발현시키면, 유전자 침묵현상이 억제될 뿐만 아니라, 도입유전자의 발현량, 기간이 혁신적으로 증대되므로써, 단백질 발현의 불안정성의 문제가 해결되어 유용한 유전자를 대량으로 안정적으로 생산할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 유용한 유전자의 발현을 안정적으로 증대시킬 수 있는 한국산 오이모자이크바이러스 2b유전자 및 그 염기서열이 제공된다.
본 발명의 상기 유전자는 염기서열이 333bp인 서열목록의 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 110개의 아미노산을 갖는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 상기 유전자를 "2b-paprika"로 명명하였다. 상기 "2b-paprika" 유전자에 의해 번역되는 아미노산으로 기존에 보고된 CMV의 2b유전자와 상동성을 도 2와 같이 비교하였다. 본 발명에서 사용된 한국산 CMV는 Fny, Y, O, Kor, MG8, B, Legume과 계통학적으로 가까운 것으로 나타났다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 2b유전자를 식물형질전환 운반체에서 발현시키는 방법이 제공된다. 상기 식물형질전환 운반체는 본 발명의 2b유전자가 식물체 내에서 발현되도록 할 수만 있다면 그 종류 및 제조방법에는 큰 제한이 없다. 바람직하게는, 35S 프로모터와 터미네이터 사이에 본 발명의 2b유전자를 삽입시키면 상기 2b유전자가 식물체내에서 발현하여 유용유전자의 발현을 증대시킬 수 있다. 그 예로 본 발명에서는 도4에 도시된 바와 같이 35S 프로모터와 nos 터미네이터에 본 발명의 2b유전자가 삽입된 "p2b-0229"벡터를 제조하였다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 2b유전자를 포함하는 식물형질전환용 벡터를 아그로박테리움에 형질전환하여 식물의 핵 DNA에 2b유전자를 삽입시켜 발현시킬 수 있는 기술이 제공되며, 본 발명에서는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)AGL1에 "p2b-0229"를 형질전환시켰다. 이 아그로박테리움 형질전환체를 농촌진흥청 부설 농업생명공학연구원 한국농용미생물보존센터에 2005년 3월 10일에 수탁번호 KACC 95033P로 기탁하였다.
본 발명의 아그로박테리움 형질전환체 제조방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:
1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1로 이루어지는 2b유전자 서열을 포함하는 식물형질전환용 벡터를 제조하는 단계;
2) 아그로박테리움(Agrobacterium)에 상기 발현벡터를 도입하는 단계.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
본 발명의 2b유전자에 의한 단백질의 안정적 대량생산 기능 확인은 다음과 같이 하였다.
[단계1: KG-CMV 2b유전자의 클로닝]
파프리카에서 분리한 한국산 CMV 이병잎으로부터 바이러스 RNA를 분리하였다. 분리한 바이러스 RNA에 프라이머로 5'-GGATCC GGG TTG AGC GTG TAA ATT CC-3'와 5'-GAGCTC CAA TAC TGC CAA CTC AGC TCC-3'를 사용하여 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하여 유전자를 합성하였다. 역전사(reverse transcription)는 45℃에서 30분, 94℃에서 15분 수행하였고, PCR은 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분을 30회 반복하였다. 이렇게 합성된 유전자는 염기서열측정기(ABI 3100)를 사용하여 CMV의 2b 염기 및 아미노산 서열을 확인하였으며, 그 서열은 도 1에 나타내었다.
[단계2: 식물형질전환벡터에 삽입]
상기 단계1에서 클로닝한 KG-CMV 2b유전자를 pBI221의 BamHⅠ와 SacⅠ site 사이에 삽입하여 35S 프로모터와 nos 터미네이터를 붙인 후, 이 P35S-2b-TNOS 카세트(casette)를 pGreen-0229의 HindⅢ와 EcoRⅠ site에 삽입하는 방법에 의하여 도4의 p2b-0229를 제작하였다.
[단계 3: 아그로박테리움 형질전환체의 제조]
상기 벡터 p2b-0229를 숙주인 아그로박테리움 투메파시엔스(strain AGL1)에 형질전환하기 위하여, 아그로박테리움에 전기충격(electroporation)으로 벡터를 삽입하고 YEP 평판배지에서 2일간 배양하여 형질전환 아그로박테리움 콜로니를 확인하였다.
[단계4: 담배에 Agro-infilteration에 의한 2b유전자기능 검정]
p2b-0229를 함유한 아그로박테리움 형질전환체 AGL-1(이하, 'p2b-0229 AGL-1')을 카나마이신(kanamycin) 50ug·mL-1, 엠피실린(ampicillin) 50ug·mL-1, 테트라시클린(tetracycline) 5ug·mL-1이 포함된 LB 브로스를 29℃에서 진탕배양기(shaking incubator)로 배양한 다음, 상기 배양액을 원심분리(5000gㅧ5min)하여 아그로박테리움을 침전시킨 후, 펠렛을 10mM MgCl2, 0.1mM 아세토시링곤 용액에 재현탁하여 농도를 조정하고(OD600 = 0.2), 얼음에 2시간 동안 방치하여 아그로박테리움을 준비하였다. 유전자 기능을 확인하기 위한 Agro-infiltration은 파종 후 3주 가 지난 담배의 잎 뒷면에 1mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 아그로박테리움을 주입하는 방법으로 수행하였다.
실험예1:KG-CMV 2b 유전자의 기능 검정
상기 단계 1~3에 의하여 제조된 p2b-0229 AGL-1의 농도를 OD600에서 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8로 준비하였다.
또한, 하기와 같은 방법으로 형광단백질유전자(GFP, Green Fluorescence Protein) 운반체인 pGFP-0229도 동일한 아그로박테리움(strain AGL-1)에 형질전환하여 2b유전자의 기능검정을 위한 마커유전자로 사용하였다.
pGFP-0229 AGL-1의 농도를 OD600에서 0.2으로 고정하고, 상기 p2b-0229 AGL-1과 함께 N. benthamiana의 잎 조직에 침윤(infiltration)시켜 3, 7, 12 및 17dpi의 UV를 조사하면서 기능을 확인하여 도5에 나타내었다.
도5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 2b 유전자가 함께 도입된 경우, 모든 농도에서 GFP단백질이 발현되었다. 또한, GFP만 도입된 경우에는 7일째에 발현이 급격히 감소하였지만, 2b유전자가 함께 도입된 경우에는 GFP 단백질이 발현된 기간이 최대 17일까지 연장되어 유전자의 안정적 발현증대의 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예2:GFP mRNA의 발현증대 확인
상기 실험예1과 동일한 방법으로 OD600에서 농도가 0.2인 pGFP-0229 AGL-1 및 농도가 0.2인 p2b-0229 AGL-1을 준비하였다.
실시예1(GFP+2b/3dpi)
파종 후 3주가 지난 담배의 잎 뒷면에 1mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 pGFP-0229 AGL-1를 침윤하고 나서 4일 후, pGFP-0229 AGL-1 및 p2b-0229 AGL-1을 침윤한 다음 3일이 경과하고 나서, UV를 조사하면서 4일간 매일 관찰하여, 그 결과를 도6에 나타내었다.
실시예2(GFP+2b/10dpi)
파종 후 3주가 지난 담배의 잎 뒷면에 1mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 pGFP-0229 AGL-1를 침윤하고 나서 4일 후, pGFP-0229 AGL-1 및 p2b-0229 AGL-1을 침윤한 다음 10일이 경과하고 나서, UV를 조사하면서 4일간 매일 관찰하여, 그 결과를 도6에 나타내었다.
비교예1(Control)
파종 후 25일이 지난 담배의 잎에 UV를 조사하면서 4일간 매일 관찰하여, 그 결과를 도6에 나타내었다.
비교예2(GFP/3dpi)
파종 후 3주가 지난 담배의 잎 뒷면에 1mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 pGFP-0229 AGL-1를 침윤하고 나서 4일 후, pGFP-0229 AGL-1를 침윤한 다음 3일이 경과하고 나서, UV를 조사하면서 4일간 매일 관찰하여, 그 결과를 도6에 나타내었다.
비교예3(GFP/10dpi)
파종 후 3주가 지난 담배의 잎 뒷면에 1mL 주사기(syringe)를 사용해 기공을 통해 pGFP-0229 AGL-1를 침윤하고 나서 4일 후, pGFP-0229 AGL-1을 침윤한 다음 10일이 경과하고 나서, UV를 조사하면서 4일간 매일 관찰하여, 그 결과를 도6에 나타내었다.
도6에 나타난 바와 같이 GFP만 도입된 비교예2 및 3의 경우에는 담배 형질전환체에 내재적으로 발현하던 GFP mRNA가 영향을 받아 유전자침묵이 되었으나, 2b 유전자가 함께 도입된 경우에는 GFP mRNA가 안정적으로 발현되고 유전자침묵도 발생하지 않는 기능을 보여주었다.
본 발명은 2b유전자를 활용하여 유용단백질을 식물체내에서 제약, 진단시약, 기능성물질 등을 간편하고 저비용으로 대량생산하는 분자농업(molecular farming)에서 유용하게 활용될 수 있는 유전자를 제공하며, 동시에 상기 유전자를 활용할 수 있는 식물형질전환 벡터 제조, 아그로박테리움 형질전환 및 기능확인 기술을 제공한다.
<110> Rural Development Administration
<120> 2b GENE FROM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, EXPRESSION VECTOR EXPRESSING
THE GENE, AGROBACTERIUM TRANSFORMANTS TRANSFORMED WITH THE
VECTOR AND PRODUCTION METHOD OF THE TRANSFORMANTS
<160> 1
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 333
<212> DNA
<213> cucumber mosaic virus
<400> 1
atggaattga acgtaggtgc aatgacaaac gtcgaactcc aactggctcg tatggtggag 60
gtgaagaaac ggagacgaag atctcacaaa cagaatcgac gggaacgagg tcacaaaagt 120
cccagcgaga gagcgcgttc aaatctcaga ctgttccgct tcctaccgtt ctatcaagta 180
gatggttcgg aactgacagg gtcatgccgc catgcgagcg tggcggagtt acccgagtct 240
gaggcctctc gtttagagtt atcggcggag gaccatgatt tcgacgatac agattggttc 300
gccggtaacg aatgggcgga aggtgctttc tga 333
Claims (4)
- 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는, 한국산 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자.
- 제1항의 유전자를 포함하는 식물형질전환용 벡터.
- 제2항의 벡터가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) KACC 95033P.
- 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환체의 제조방법;1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1로 이루어지는 2b유전자 서열을 포함하는 식물형질전환용 벡터를 제조하는 단계;2) 아그로박테리움(Agrobacterium)에 상기 발현벡터를 도입하는 단계.
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| KR1020050029041A KR100679715B1 (ko) | 2005-04-07 | 2005-04-07 | 한국산 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자를 이용한 식물체내에서의 외래 유전자의 발현을 증대시키는 방법 |
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| KR101154142B1 (ko) * | 2008-09-08 | 2012-06-14 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬수 있는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물 |
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| WO2019049111A1 (en) * | 2017-09-11 | 2019-03-14 | R. J. Reynolds Tobacco Company | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING THE EXPRESSION OF GENES OF INTEREST IN A PLANT BY CO-EXPRESSION WITH P21 |
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2005
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| KR101154142B1 (ko) * | 2008-09-08 | 2012-06-14 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬수 있는 아그로박테리움 투메파시언스 혼합물 |
| KR101336507B1 (ko) * | 2011-10-28 | 2013-12-03 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스 |
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| WO2019049111A1 (en) * | 2017-09-11 | 2019-03-14 | R. J. Reynolds Tobacco Company | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING THE EXPRESSION OF GENES OF INTEREST IN A PLANT BY CO-EXPRESSION WITH P21 |
| US11649465B2 (en) | 2017-09-11 | 2023-05-16 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Methods and compositions for increasing expression of genes of interest in a plant by co-expression with p21 |
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