JP2003512822A - 外来性遺伝子発現を調節するプロモーター - Google Patents

外来性遺伝子発現を調節するプロモーター

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マーク−アンドレ ダオー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、トランスジェニック生物における外来性遺伝子の発現を調節するプロモーターであって、配列番号１から３に記載の配列および機能的断片またはその誘導体からなる群より選択される配列を有するプロモーターと同一の特徴を有するプロモーターを含み、前記プロモーターは前記遺伝子の発現が操作可能であるように前記外来性遺伝子に位置付けられているプロモーターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
(a)発明の分野 本発明は、トランスジェニック生物において、より具体的にはトランスジェニ
ック植物にいて、葉−特異的な外来性遺伝子発現を調節するプロモーターに関す
るものである。 (b)先行技術の説明 微生物の遺伝子形質転換は、有用な組換え分子を生産するために15年以上もの
間利用されており、医薬品産業、化粧品産業、皮膚薬産業における利用が現在も
開発され続けている。この一般的な概念を複雑な真核生物に対し適合させるため
に必要とされる技術の開発により、この技術はこの10年間で微生物から植物およ
び動物へと拡大された。基本的には、有益なタンパク質をコードする遺伝子、ま
たは有益な分子に導く代謝経路の修飾に係る酵素をコードする遺伝子は、cis-お
よびトランス-作用の調節配列に適切な様式にて結合され、標的細胞に転移され
、その分子機構に（一時的または安定な様式にて）取込まれる。次いで、トラン
スジェニック細胞、またはトランスジェニック細胞から再生された組織または器
官は、導入遺伝子の転写および翻訳を実行し、したがって有益なタンパク質を蓄
積でき、または有益な酵素活性により新しい代謝反応を実行できる。
【０００２】 台頭しつつある分子農業産業（動物または穀物における組換え分子の生産）は
、今世紀最も有望な産業の１つである。安全かつ再生可能な分子工場を提供する
ことはその産業の将来性を保証する。現在開発されている応用の中には、治療用
および診断用の低価格モノクローナル抗体の生産、無限量のホルモン類、サイト
カイン類、およびその他の慢性または致死的疾病治療用の生物活性分子の生産、
種々の血液成分に替わる生体安全代替物の生産、食品およびパルプ産業に関する
無限量の加工酵素の生産、廃棄物処理用の低コスト酵素の生産、化粧品産業に係
る安全な生体活性分子の生産がある。
【０００３】 この技術の適用に対する限界は、多くはトランスジェニック生物が十分量の組
換え産物を蓄積できないことに起因し、それは転写率の低さ、メッセンジャーの
不適当なスプライシング、外来性RNAの不安定性、翻訳率の低さ、組換えタンパ
ク質の内因性プロテアーゼの作用に対する過敏性または組換え生物の外来性タン
パク質に対する過敏性の結果から生じ、これらは不適当で限定された発育、また
は最悪の場合には宿主生物に対する強い有害作用を引き起こす結果なる。利ざや
が狭い場合、または残留物の処理および/または廃棄が生物安全性問題または環
境問題を引き起こす場合、生産レベルの不十分さが応用開発に直接的影響を与え
る。このように、所望の組換え製品の蓄積レベルの改善は、分子農業の多くの応
用分野における商業化を保証する重要な要因の１つと思われる。
【０００４】 光合成は、生物界において最も重要な代謝反応であり、ほとんどの陸生植物お
よび藻類、およびある種の細菌により行なわれている。この総合反応は、葉細胞
の葉緑体内に位置するチラコイド膜系内に空間的に整列した電子伝達タンパク質
の複雑な集合体と関連する。この電子伝達鎖は、光合成アンテナの一端では、全
ての光合成有機体に共通する分子であるクロロフィルなど種々の巨大分子と結合
しており、他の一端では、NADPHとATP合成に関与する酵素に、そしてNADPHおよ
びATPから有機分子へのエネルギー放出をガス状二酸化炭素の固定に結合させる
ことに関与するカルビンサイクルに結合している。総合的な光合成反応に関与す
るタンパク質の中の１つであるリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（Rubisc
o）は、地球上で最も豊富なタンパク質である。
【０００５】 このように、光合成をもっぱら行なっているのは葉細胞であり、植物バイオテ
クノロジー適用に強力な葉特異的発現カセットを構築する際、このような卓越し
た組織特異的代謝活性に関与する遺伝子プロモーターの使用は明らかに興味があ
る。
【０００６】 光合成装置のペプチド構成体の多くは、葉緑体ゲノムに存在する遺伝子にコー
ドされている。一例として、CO2固定のための触媒部位を有するRubiscoの重サブ
ユニットは葉緑体遺伝子にコードされている。しかし、この酵素の小サブユニッ
トは核遺伝子にコードされていることから、Rubisco全タンパク質は、2つの異な
るゲノムにコードされたサブユニットから作られる。明らかな理由で、トランス
ジェニック植物の葉の中に導入遺伝子の転写を制御するRubiscoプロモーターを
使用する試みには大きな興味がもたれている。このプロモーターは、広汎に特性
化され、発現ベクターにおけるその使用は、米国特許第4,962.028号により保護
されている。
【０００７】 トランスジェニック生物、より具体的にはトランスジェニック植物における外
来性遺伝子の発現を調節するプロモーターを提供することが大いに望まれている
。
【０００８】
【発明の概要】
本発明の目的の１つは、トランスジェニック生物、より具体的にはトランスジ
ェニック植物における外来性遺伝子の発現を調節するプロモーターを提供するこ
とである。
【０００９】 本発明の１つの実施形態によれば、トランスジェニック生物における外来性遺
伝子の発現を調節するプロモーターであって、配列番号１から３に記載の配列お
よび機能的断片またはその誘導体からなる群より選択される配列を有するプロモ
ーターと同一の特徴を有するプロモーターを含み、前記プロモーターは前記遺伝
子の発現が操作可能であるように前記外来性遺伝子に位置付けられているプロモ
ーターが提供される。
【００１０】 本発明の好ましいプロモーターは、配列番号１から３に記載の配列からなる群
より選択される配列を有する。
【００１１】 生物は植物であることが好ましい。
【００１２】 本発明のプロモーターは、光の有無により調節し得ることが好ましい。
【００１３】 好ましい植物は、双子葉植物、単子葉植物または裸子植物である。
【００１４】 本発明の他の実施形態によれば、トランスジェニック生物における外来性遺伝
子の発現を調節する方法であって、以下のステップ： a) 少なくとも請求項１のプロモーターおよび遺伝子ORFからなる発現コンスト
ラクトであって、前記プロモーターは前記遺伝子の発現が操作可能であるように
前記遺伝子に位置付けられている発現コンストラクトを用いてトランスジェニッ
ク生物を調製すること、 を含む方法が提供される。
【００１５】 本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
【００１６】 「機能的断片またはその誘導体」という表現は、外来性遺伝子の発現レベルを
配列番号１から３に記載される本発明のプロモーターと等しくできる配列番号１
から３の任意の誘導体または断片を意味している。
【００１７】
【発明の詳しい説明】
以下は、レポーター遺伝子の発現において調節され得るトランスジェニックア
ルファルファ系統を作成するため用いられる方法の詳細な説明である。
【００１８】 この実施形態において、配列番号１から３に記載される配列を有するプロモー
ターを、レポーター遺伝子およびターミネーターに連結し、次いでこのコンスト
ラクトを、アルファルファ葉へのDNAボンバードメント、およびDesgagnesら(199
5, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140)に記載されたアグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）媒介性DNA転移のために好適な植物発現ベクターに挿入した
。これら2つのDNA転移法は、レポーター遺伝子の発現が光により調節できること
を証明するために用いられた。材料および方法 DNA塩基配列決定： DNA塩基配列決定は、Sangerら（1977, P.N.A.S. USA, 74:6543-5647）に記載
されているとおりに実施した。
【００１９】 その結果得られた本発明のプロモーターは配列番号１から３に記載の配列を有
する。 発現カセットおよびベクターの構築： GUSレポーター遺伝子を用いて発現分析用カセットを以下のとおりに構築した
。プロモーターの無いGUSカセットは、pBI101をHindIIIおよびEcoRIで消化し、p
UC19のポリクローニング部位のHindIIIおよびEcoRI部位に挿入した。得られたプ
ラスミドをpBI201と命名し、次のコンストラクト構築のために使用した。pGPlas
3-2の種々の欠失断片を、pBI201のGUSレポーター遺伝子の5'端に転写的および移
行的に融合し、DNAボンバードメントを用いた一時的発現試験に使用した。適切
な欠失断片を同定し、pBI101（Clonetech社）などのバイナリー植物発現ベクタ
ーにサブクローニングした。これらの組換えプラスミドを、下記のＡ．ツメファ
シエンス（A. tumefaciens）感染により安定な組み込みのために用いた。 アグロバクテリウム媒介性DNA導入およびトランスジェニック系統の再生 組換えプラスミドを、Khoudiら(1999, Biotechnol. Bioeng., 64:135-143)に
記載されたエレクトロポーレーションにより、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404に導入した。次いで、選択した
アグロバクテリウム株を、選択圧（カナマイシン）の不在下、遺伝子型C5-1から
のリーフディスクと共に4日間共培養した。この培養期間後、リーフディスクを
洗浄し増殖させ、次いでB5H培地上にカルスを形成させた。次にカルスを、胚誘
導用のSH培地上に20日間移し換え、胚発生用のBOi2Y上で28日間培養した。魚雷
型胚をBOi2Yから除いて再生用のMS培地に入れた。カナマイシンは、共培養時を
除いて全培養培地およびMS上の再生時に添加した。この方法は、Desgagnesら(19
95, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42:129-140)に詳細に記載されている。根
づいた植物を、温室で完全に発育させた。
【００２０】 本発明は、その具体的な実施形態に関連させて記載したが、さらなる改変が可
能であることは理解されよう。また、本出願は、一般に、本発明の原理に従う変
化、利用または改造を含むことを意図し、本発明が関係する技術内で知られた、
または通例の実施内で生じるような前記の本質的な特徴に適用でき、また添付の
特許請求の範囲内に従って本発明の開示からの逸脱を含むものである。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD07 CD09 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 AA20 CA01 DA01 FA02

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トランスジェニック生物における外来性遺伝子の発現を調節
    するプロモーターであって、配列番号１から３に記載の配列および機能的断片ま
    たはその誘導体からなる群より選択される配列を有するプロモーターと同一の特
    徴を有するプロモーターを含み、前記プロモーターは前記遺伝子の発現が操作可
    能であるように前記外来性遺伝子に位置付けられているプロモーター。
  2. 【請求項２】 前記プロモーターが、光の有無によって前記遺伝子の転写発
    現用に調節されている請求項１のプロモーター。
  3. 【請求項３】 前記プロモーターが、配列番号１から３に記載の配列からな
    る群より選択される配列を有する請求項１のプロモーター。
  4. 【請求項４】 前記生物が植物である請求項１のプロモーター。
  5. 【請求項５】 前記植物が双子葉植物、単子葉植物または裸子植物である請
    求項４のプロモーター。
  6. 【請求項６】 トランスジェニック生物における外来性遺伝子の発現を調節
    する方法であって、以下のステップ： a) 少なくとも請求項１のプロモーターおよび遺伝子ORFからなる発現コンスト
    ラクトであって、前記プロモーターは前記遺伝子の発現が操作可能であるように
    前記遺伝子に位置付けられている発現コンストラクトを用いてトランスジェニッ
    ク生物を調製すること、 を含む方法。
  7. 【請求項７】 前記生物が植物である請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 前記植物が双子葉植物、単子葉植物または裸子植物である請
    求項７の方法。
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