CN111454976B

CN111454976B - 用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法、应用

Info

Publication number: CN111454976B
Application number: CN202010186754.6A
Authority: CN
Inventors: 娄素琳; 胡章立; 黄思敏; 林鑫
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2040-03-17
Also published as: CN111454976A

Abstract

本发明提供一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法、应用，所述构建方法通过扩增得到普通小球藻的番茄红素ε‑环化酶基因，构建所述番茄红素ε‑环化酶基因重组表达载体；将所述番茄红素ε‑环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε‑环化酶基因莱茵藻。所得到的转基因衣藻能够高产叶黄素，利用藻类无性繁殖、生长快速的特点，因此可以低成本，快速地获取叶黄素。

Description

用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法、应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，特别涉及一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法、应用。

背景技术

叶黄素最显着的生物活性是其抗氧化特性。叶黄素能被氧化剂迅速氧化，从而减小细胞内自由基等其他物质被氧化的几率，从而实现对机体的抗氧化保护。与其他类胡萝卜素成员相似，叶黄素的抗氧化能力归功于其共轭碳双键系统。该结构允许单线态氧的猝灭和自由基的清除。因为它超强的抗氧化特性，它是维持和促进人们身体健康的的一类营养素，并且越来越多的证据支持它们在预防或延迟慢性疾病方面的保护作用。

叶黄素广泛分布于水果，蔬菜和花卉中，其中万寿菊花是迄今为止商业叶黄素最丰富的天然来源。然而，万寿菊叶中存在的大量叶黄素被酯化，其重量的一半都是脂肪酸，因此，化学皂化在叶黄素产品的制造中是必需。此外，万寿菊叶黄素的产量也受季节，种植面积和高人力成本的限制。普通小球藻作为天然叶黄素提取常用材料之一，日渐受到重视和深入研究。

目前普通小球藻提高叶黄素提取量的手段主要包括优化提取方法、优化培养条件等，由于普通小球藻遗传转化体系不稳定，不利于通过基因工程手段改造提高叶黄素产量。相对与普通小球藻，莱茵衣藻具有遗传体系稳定、遗传背景清晰及藻胞内足够存储代谢产物场所的条件，是一个公认的良好细胞工厂。例如，Cordero等将C.zofingiensis的PSY基因转化至莱茵衣藻中，获得一株叶黄素含量显著提高的莱茵衣藻转化子(Cordero B F，Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91(2)：341-351)。因此本发明将通过绿藻模式生物莱茵衣藻进行改造，以期获得一株高表达叶黄素转基因莱茵衣藻工程藻株。

本发明将对莱茵衣藻进行基因工程改造，将含有普通小球藻叶黄素合成途径中的关键基因CvLCYE的重组质粒转化至莱茵衣藻，在莱茵衣藻中过表达CvLCYE，提高莱茵衣藻叶黄素含量，为实现莱茵衣藻生产叶黄素可产业化奠定基础。

故此，亟需获得一株高表达叶黄素转基因莱茵衣藻工程藻株

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法、应用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其中，其包括：

扩增得到普通小球藻的番茄红素ε-环化酶基因，构建所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体；

将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵衣藻。

所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其中，所述番茄红素ε-环化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其中，所述番茄红素ε-环化酶基因为人工转化番茄红素ε-环化酶基因。

所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其中，所述构建所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体，具体包括：

对番茄红素ε-环化酶-T载体、pH124空载体进行双酶切，得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124，用T4 DNA连接酶进行连接，得到番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体。

所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其中，所述对番茄红素ε-环化酶-T载体、pH124空载体进行双酶切，得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124，用T4 DNA连接酶进行连接，得到番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体，包括：

将得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124，用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应结束后，将连接产物与大肠杆菌感受态细胞混合冰上放置，加入无抗LB培养基，摇床复苏，复苏菌液涂布氨苄青霉素抗性平板；倒置培养过夜,得到转化子；

对所述转化子用新抗性平板二筛，二筛后的转化子菌落进行PCR扩增，得到番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体。

所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其中，将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，其中转化方法为珠磨法。

所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其中，所述将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵藻，包括：

将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体用限制性内切酶NotI进行单酶切使其线性化；将线性化番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵藻。

一种普通小球藻的番茄红素ε-环化酶，其中，由番茄红素ε-环化酶基因编码得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种转基因衣藻，其中，采用如上所述的方法制备得到。

一种上所述的转基因衣藻，在提高莱茵衣藻叶黄素含量中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法、应用，所述构建方法通过扩增得到普通小球藻的番茄红素ε-环化酶基因，构建所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体；将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵藻。所得到的转基因衣藻能够高产叶黄素，利用藻类无性繁殖、生长快速的特点，因此可以低成本，快速地获取叶黄素。

附图说明

图1为本实施例提供的一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法的流程图。

图2为CvLCYE基因结构图。

图3为pH124-CvLCYE质粒酶切验证电泳图。

图4为CC124-pH124-CvLCYE转化子DNA PCR扩增结果的电泳图。

图5为叶黄素标准品以及转化子HPLC峰图。

具体实施方式

本发明提供用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法，应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅

用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、

“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

下面结合附图，通过对实施例的描述，对发明内容作进一步说明。本实施例提供了一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，如图1所示，所述方法包括：

S10、扩增得到普通小球藻的番茄红素ε-环化酶基因，构建所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体。

具体地，CvLCYE是普通小球藻(Chlorella vulgaris)F197的番茄红素ε-环化酶基因。根据CvLCYE基因的CDS序列，在基因不同位置设计了的特异引物，分别以cDNA和基因组DNA为模板，进行扩增；综合不同特异引物获得的CvLCYE基因组DNA序列，拼接后获得了基因全长；再将CDS序列与基因全长序列进行交叉比对，发现CvLCYE基因含7个外显子，6个内含子，如图2所示，图中灰色阴影部分为基因的外显子区域，白色部分为基因内含子区域：CvLCYE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将CvLCYE基因构建至至莱茵衣藻的表达载体pH124中，得到重组表达载体pH124-CvLCYE。

在本实施例中，其中，CvLCYE基因的克隆操作步骤如下：

1)克隆CvLCYE基因的cDNA

分别用TAP培养基、FC培养基培养普通小球藻，将其培养至对数生长期，提取微藻RNA；以提取RNA作为模板，进行逆转录反应后，获取普通小球藻的cDNA；按照表1.1配置变性反应液，65℃变性5min后放置冰上冷却；按照表1.2配置反转录反应液，充分混匀后，PCR仪或者水浴锅进行温浴，温浴程序：30℃10min，42℃60min，95℃5min；得到普通小球藻的cDNA，并置于-20℃保存。

表1.1变性反应液体系

表1.2反转录反应体系

2)PCR扩增

以反转录后普通小球藻cDNA分别作为模板，利用对应的基因特异引物进行PCR反应；用高保真的KOD DNA聚合酶进行扩增。按照表1.3配置反应体系，扩增参数：预变性98℃5min；30个扩增循环，每个循环依次：98℃30s、62℃30s、68℃2min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；确认PCR片段与基因大小一致后，进行后面的加A连T等操作。

表1.3普通小球藻cDNA扩增CvLCYE基因的PCR反应体系

3)3′端的dA附加反应

利用KOD的TA克隆试剂盒将目的片段克隆到T载体，在此之前我们将PCR产物进行3′端加A处理；取KOD系列的扩增产物9μL置于新的试管，添加10x A-attachment Mix 1μL，并充分搅，于60℃进行10-30min反应；加A反应液的一部分用于连接反应。

4)TA克隆

a)按表1.4配制TA克隆反应体系；

b)加入的PCR产物量根据PCR产物的浓度、纯度、大小,DNA序列等的不同而不同，通常pTA2 Vector和PCR产物mole比可设定为1：3。

c)将反应液于室温(15～25℃)进行30min反应；连接较短DNA片断(2kb以下)，通过5min反应就能得到充分的克隆效率。另外，如果延长反应时间，可提高克隆效率。如果进行过夜(12～18小时左右)反应时，在4℃进行。

表1.4 TA克隆反应体系

d)连接反应结束后，取5μL pTA2-CvLCYE连接产物与大肠杆菌感受态细胞混合，冰上放置30min后42℃热激30s，加入无抗LB培养基，37℃摇床复苏60min；复苏菌液涂布氨苄青霉素抗性平板；倒置于37℃培养箱培养过夜。

5)菌液筛选鉴定

转化子用新的抗性平板进行二次筛选后，菌落作为模板，按表1.5配置PCR反应体系进行扩增；扩增参数：预变性95℃5min；30个扩增循环，每个循环依次：95℃30s、62℃30s、72℃1min 40s。

表1.5 pTA2-CvLCYE转化子菌落PCR反应体系

PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，和测序结果得到转化子pAT2-CvLCYE和CvLCYE基因。

莱茵衣藻表达载体pH124-CvLCYE的构建，操作如下：

1)CvLCYE-T载体、pH124空载体酶切

用Eco72I、NheI对CvLCYE-T载体、pH124空载体进行双酶切；按表2.1配置反应体系，37℃酶切30min；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收纯化目的片段；

表2.1质粒CvLCYE-T、pH124双酶切反应体系

2)线性化质粒pH124与目的片段CvLCYE连接转化

纯化后的目的片段CvLCYE和线性化质粒pH124，用T4 DNA连接酶进行连接；按照表2.2配置反应体系，22℃连接反应30min；

表2.2目的片段CvLCYE与线性化质粒pH124连接体系

连接反应结束后，取5μL连接产物与大肠杆菌感受态细胞混合，冰上放置30min后42℃热激30s，加入无抗LB培养基，37℃摇床复苏60min；复苏菌液涂布氨苄青霉素抗性平板；倒置于37℃培养箱培养过夜。

3)转化子筛选鉴定

转化子用新抗性平板二筛，二筛后的转化子菌落进行PCR扩增，设计载体上的检测引物：p124检引，按照表2.3配置PCR反应体系进行扩增，扩增参数：预变性95℃5min；30个扩增循环，每个循环依次：95℃30s、62℃30s、72℃2min；

菌落PCR阳性的转化子，小量培养后提取质粒，按照1)的方法，用Eco72I、NheI对重组质粒pH124-CvLCYE进行双酶切。

表2.3重组质粒pH124-CvLCYE转化子菌落PCR反应体系

构建好莱茵衣藻表达载体后，对其进行双酶切验证，再以未进行酶切反应的质粒作为对照。重组质粒pH124-CvLCYE在我们进行双酶切后，预期是能够获得目的片段以及pH124空载体2条条带；基因的大小1605bp，质粒pH124空载体大小为4899bp；酶切结果如图3所示(图中M泳道为DL10000 maker，1泳道为质粒pH124-CvLCYE，2泳道为质粒pH124-CvLCYE双酶)，从图中我们可以看出，条带的数目以及对应的片段大小与预期的保持一致；因此，酶切的结果证明重组质粒pH124-CvLCYE构建完成。

S20、将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵衣藻。

具体地，所述将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，操作步骤如下：

1)质粒线性化

将质粒pH124-CvLCYE用限制性内切酶NotI进行单酶切使其线性化；按照表2.4配置反应体系，37℃酶切反应30min；回收酶切后的产物。

表2.4质粒pH124-CvLCYE NotI单酶切反应体系

2)玻璃珠转化至莱茵衣藻

a)玻璃珠分装，干净离心管称取0.3-0.4g的0.5mm玻璃珠，灭菌后干燥待用；

b)质粒线性化：重组质粒用NotI进行酶切，酶切体系为：酶切产物进行纯化；

c)莱茵衣藻培养，25℃摇床，光照培养至对数生长期；

d)收集藻液，3000rpm，5min离心收集藻液；

e)按照1:100的比例，用新鲜TAP培养基，对离心后的藻体沉淀进行重悬，温和吸打；

f)藻液与质粒进行混匀，吸取350μL浓缩后的藻液，缓慢加入含玻璃珠的离心管中；接着吸取2μg线性化的质粒至藻液中；温和混匀；

g)涡旋震荡，涡旋震荡调至最大转速，震荡25-30秒；

h)将涡旋震荡后的藻液，吸取移至10mL新鲜TAP中，25℃摇床，弱光培养过夜；

在本实施例中，为了验证转化效果，进行了莱茵衣藻转化子鉴定，操作如下：

1)转化子重新划线至新的抗性平板中，25℃培养箱，光照培养；

2)待生长起来后，扩接至液体中；生长到对数期后，提取转化子DNA：

a)取2-3ml藻液，8000rpm离心5min后去上清；

b)加入62.5μL的Buffer KAC(Buffer HS I或Buffer HS II的1/8体积)，充分混匀。冰上放置5min，12,000rpm离心5min。

c)取上清，加入与上清液等体积的Buffer GB，充分混匀。

d)将Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

e)将500μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

f)将700μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

g)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2min。

h)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30～50μL的Elution Buffer或灭菌水，室温静置5min。

i)12,000rpm离心2min洗脱DNA。

3)提取后的转化子DNA作为模板，按照表2.5配置反应体系进行PCR扩增，扩增参数：预变性95℃5min；30个扩增循环，每个循环依次：95℃30s、62℃30s、72℃2min。

表2.5莱茵衣藻转化子DNA PCR反应体系

从转化子DNA扩增目的基因，同时设置以质粒pH124-CvLCYE作为扩增模板的阳性对照，若是转化子为阳性，则会有1条与阳性对照大小一致的电泳条带；从图4中(M泳道为DL2000 maker，1泳道为阳性对照用质粒pH124-CvLCYE作为扩增模板；2-10泳道为实验组以转化子DNA作为扩增模板)可以看出2-10转化子，除3、6号转化子外，其余均与阳性对照组条带保持一致，说明转化成功，2、4、5、7-10号转化子为目的阳性转化子。

基于上述用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，本发明还提供了一种普通小球藻的番茄红素ε-环化酶，其由番茄红素ε-环化酶基因编码得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于上述用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，本发明还提供了一种转基因衣藻，该转基因衣藻中含有强表达番茄红素ε-环化酶基因。可将其应用于叶黄素的生产。

下面通过实施例对所获得的转基因衣藻中的叶黄素含量进行测量验证。

到莱茵衣藻CvLCYE转化子后，我们将其进行大量培养。藻液在收集后进行冻干处理，称重并记录实验组和对照组的藻体干重；接着我们对藻细胞进行破碎，用丙酮：甲醇＝8：2的混合溶液作为萃取剂萃取破碎后的藻细胞胞内色素；再进行氮吹浓缩后，用甲醇进行溶解，详细操作如下：

1)藻泥收集、干燥、称重

a)离心收集藻液，8000rpm，5min，，至所有藻液全部收集完成；

b)将收集有藻液的离心管，进行空转，10,000rpm，5min，充分舍弃藻体中的水分；

c)将含有藻体沉淀的离心管，用封口膜封口(不完全封闭)

d)-80℃超低温冰箱进行预冷处理15min

e)快速将预冷处理后的藻体移至真空冷冻干燥机中，进行冷冻干燥4-5小时，至藻体从离心管壁自然脱落；

f)藻体称量

2)萃取

a)藻体干燥后，很难直接充分溶解于萃取想，先用蒸馏水进行菌体湿润

b)含干燥菌体的离心管中加20mL蒸馏水，充分震荡至藻体溶解，6000rpm，5min；

c)重复上一步骤

d)含湿润后的藻体离心管中，加入的等量的玻璃珠；

e)加入3mL萃取剂；

f)充分震荡至藻体完全溶解；

g)避光，55℃温浴15min；

h)10,000rpm，10min，将上清转移至干净15mL离心管中；

i)再加入2mL丙酮至剩余藻体中，震荡、55℃避光温浴10min；

j)10,000rpm，10min，将上清转移至干净15mL离心管中，获得萃取液

3)氮吹

a)萃取液利用氮吹仪进行氮吹浓缩；

b)含萃取液的15mL离心管，对应放置氮吹仪的样品孔；

c)调节样品液面与氮气针(输送氮气至样品)的距离，避免太远损失氮气，避免太近，样品喷涌造成损失；

d)打开氮气开关，至氮气压力指针跳至中间；

e)拧松氮气针(输送氮气至样品)，确保氮气能通畅进入离心管中；

f)缓慢转动氮气压力阀，同时观察样品液面；看到液面有明显气流冲击，且不至于喷涌出离心管，即为合适的氮气压力，停止转动压力阀；

g)3-5min进行观察，调整氮气针与样品液面距离，确保最大程度利用氮气；

h)15-20min后，样品中的丙酮全部挥发完，样品形成沉淀贴附在离心管壁，即为干燥完成；

i)反方向转动压力阀、关闭氮气开关。

HPLC检测叶黄素含量

萃取后得到的色素，通过HPLC对其中的叶黄素含量进行检测。首先，设置不同质量浓度的叶黄素标准品进行HPLC检测，从而得到番茄红素含量与峰面积的对应关系，并绘制标准曲线；接着，对实验组和对照组的色素进行检测，获得各自的叶黄素峰峰面积，通过标准曲线计算叶黄素含量；再分别对藻体的干重，最终获得各组单位菌体干重叶黄素的含量。岛津仪器使用以及还有标准曲线的绘制等；HPLC检测叶黄素的基本参数如下：

1)仪器：岛津

2)高效液相色谱柱：Intertsil ODS C18柱(250*4.6mm，粒径5μm)

3)进样量：20μL

4)流速：1mL/min

5)检测波长：450nm；

6)流动相：A＝纯水；叶黄素流动相B＝甲醇：异丙醇＝8:2

7)LC程序参见表2.6；

表2.6 HPLC检测叶黄素含量的LC程序

得到转化子后，我们将转化子藻株与野生型分别进行破碎，萃取提取胞内的色素，色素经处理后进行HPLC检测。HPLC检测时，先以不同浓度的叶黄素的标准品上样检测，同时也作为对照；接着再将转化子与野生型藻细胞提取的色素进行上样检测。各组的HPLC峰图如图5所示，从图中我们可以看出，叶黄素的峰保留时间在12.5-13.0min左右，转化子与野生型，除了叶黄素峰外还有其余洗脱峰，但不对叶黄素的峰造成干扰，不影响我们对叶黄素峰的积分。

对每个样品的叶黄素峰面积进行积分，同时用不同浓度的标准品对应的叶黄素峰积分，绘制出叶黄素含量与峰面积的标准曲线，利用标准曲线的函数得到各样品的叶黄素含量；再用单位藻体质量所含的叶黄素进行分析，结果如表2.7

表2.7莱茵衣藻单位藻干重叶黄含量表

表中1-4代表转化子藻株，WT代表野生型CC124；表中列举了各藻株单位藻干重的叶黄素含量，以及分别与野生型的比例，可以看出，转化子的叶黄素含量相对于野生型都有明显的提高，最低的1号转化子是野生型的1.367倍，最高的是野生型的2.317倍。这说明CvLCYE在莱茵衣藻体内，对其叶黄素含量的提高具有显著的作用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因莱茵衣藻及其构建方法、应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 1

atggtgcttg gcaacacaca ggagcccagc cgcccgtctc ctgcccttgc ggggcagcac 60

gacccaaact atgcagcccg cataggctcc tttgaggctc cccttgtgga ggctcaggcc 120

agcaaggacg atcccgagca gccgtcgctg gctggggcgc tcccggcctt tgacctgagc 180

gccaccgccg acgtggcggt cgtgggtgct ggccctgcgg gcctggcgct tgctgctgag 240

ctggcacagc agggcctcag cgtcgcactg gtcagcccgg aggccaagtt cgtgaacaac 300

tacggcgttt ggctggacga gttccgggag attgggctgg agcacacact ggatgcagtg 360

tgggacgatg cggtgtgctt cttcaaggat gcacagatgg tgagggtggg ccgcccctac 420

ggccgcgtct gccgtcgccg cctgcgccag cacctgctct cgcgctgcgc cgaggcgggg 480

gtgcagtacg tggaggccga ggtggacacc gccagctcag catctgacca gcaggcagcc 540

cagctggtcc tgtcagacgg ccgcacgctg aggtgccgcc tgccggtgct ggccagcggc 600

gtggcggcgg ggcggctgct caagtacgag gagggcgtgc cagctgttgc ggcacagacg 660

gcttacggca tcgaagccga ggtggagggg tatgcggcgg cctacccgcc tgacaagatg 720

ctgttcatgg acttccggcg gcaccacact gggctgtacg acggtaccgc cacgcagcag 780

aagcccggca tgagccagca cgggcaggac gggctgtggg gcacagaggg cgagacgccg 840

tccttcctct atgccatgcc cctgggcggt aaccgagtgt tcctggagga gacgtgcctg 900

gtggcccgcc ccgcgctgcc gtttgccacg ctgaagcggc ggctggagcg gcgctgccgc 960

gcgctgggca tcaaggttgg cgaggttcat gaggaggagt ggagctatat cccggtggga 1020

ggcccgctgc cgctgcccga ccagccggcg gcggcgtttg gtgcagcggc aaaccttgtg 1080

cacccggcca cgggatacag catcacacgc agcctgcgcg aggcgccctc cgtggcgcgt 1140

gcagccaagc aggcgctgga ggagcagccc agcagcgcgg cggcggttcg cttcttgtgg 1200

gaggcgctgt ggacgcagga gcggcggcgc caggcgtcgt tccaggtgtc tggcatggag 1260

ctgctgtgcc agctggacgc gcgcgccacc gccgacttct tcaccacctt cttcaagctg 1320

cccgcctcct actggcgcgg cttcctagcc agcaagctca gctcggtgga cctgctgagc 1380

tttgcaatgc tgacttgggt gctggcgccg cccaacatca aggccaagct gatcgcccac 1440

ttcatgaccg acccctcggg ccgctacatg atcagctgct acaccggaaa gaaccgcgag 1500

cagtgggagg agccgcagga aagcgccgcg ccgctgccca cagcagcagc cggcatgctg 1560

ttgctgcagc agctggcagc agcggcggcg gagcgcgccg tgtga 1605

<210> 2

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 2

Met Val Leu Gly Asn Thr Gln Glu Pro Ser Arg Pro Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ala Gly Gln His Asp Pro Asn Tyr Ala Ala Arg Ile Gly Ser Phe Glu

20 25 30

Ala Pro Leu Val Glu Ala Gln Ala Ser Lys Asp Asp Pro Glu Gln Pro

35 40 45

Ser Leu Ala Gly Ala Leu Pro Ala Phe Asp Leu Ser Ala Thr Ala Asp

50 55 60

Val Ala Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ala Glu

65 70 75

Leu Ala Gln Gln Gly Leu Ser Val Ala Leu Val Ser Pro Glu Ala Lys

80 85 90

Phe Val Asn Asn Tyr Gly Val Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Ile Gly

95 100 105

Leu Glu His Thr Leu Asp Ala Val Trp Asp Asp Ala Val Cys Phe Phe

110 115 120

Lys Asp Ala Gln Met Val Arg Val Gly Arg Pro Tyr Gly Arg Val Cys

125 130 135

Arg Arg Arg Leu Arg Gln His Leu Leu Ser Arg Cys Ala Glu Ala Gly

140 145 150

Val Gln Tyr Val Glu Ala Glu Val Asp Thr Ala Ser Ser Ala Ser Asp

155 160 165

Gln Gln Ala Ala Gln Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Thr Leu Arg Cys

170 175 180

Arg Leu Pro Val Leu Ala Ser Gly Val Ala Ala Gly Arg Leu Leu Lys

185 190 195

Tyr Glu Glu Gly Val Pro Ala Val Ala Ala Gln Thr Ala Tyr Gly Ile

200 205 210

Glu Ala Glu Val Glu Gly Tyr Ala Ala Ala Tyr Pro Pro Asp Lys Met

215 220 225

Leu Phe Met Asp Phe Arg Arg His His Thr Gly Leu Tyr Asp Gly Thr

230 235 240

Ala Thr Gln Gln Lys Pro Gly Met Ser Gln His Gly Gln Asp Gly Leu

245 250 255

Trp Gly Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Phe Leu Tyr Ala Met Pro Leu

260 265 270

Gly Gly Asn Arg Val Phe Leu Glu Glu Thr Cys Leu Val Ala Arg Pro

275 280 285

Ala Leu Pro Phe Ala Thr Leu Lys Arg Arg Leu Glu Arg Arg Cys Arg

290 295 300

Ala Leu Gly Ile Lys Val Gly Glu Val His Glu Glu Glu Trp Ser Tyr

305 310 315

Ile Pro Val Gly Gly Pro Leu Pro Leu Pro Asp Gln Pro Ala Ala Ala

320 325 330

Phe Gly Ala Ala Ala Asn Leu Val His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Ile

335 340 345

Thr Arg Ser Leu Arg Glu Ala Pro Ser Val Ala Arg Ala Ala Lys Gln

350 355 360

Ala Leu Glu Glu Gln Pro Ser Ser Ala Ala Ala Val Arg Phe Leu Trp

365 370 375

Glu Ala Leu Trp Thr Gln Glu Arg Arg Arg Gln Ala Ser Phe Gln Val

380 385 390

Ser Gly Met Glu Leu Leu Cys Gln Leu Asp Ala Arg Ala Thr Ala Asp

395 400 405

Phe Phe Thr Thr Phe Phe Lys Leu Pro Ala Ser Tyr Trp Arg Gly Phe

410 415 420

Leu Ala Ser Lys Leu Ser Ser Val Asp Leu Leu Ser Phe Ala Met Leu

425 430 435

Thr Trp Val Leu Ala Pro Pro Asn Ile Lys Ala Lys Leu Ile Ala His

440 445 450

Phe Met Thr Asp Pro Ser Gly Arg Tyr Met Ile Ser Cys Tyr Thr Gly

455 460 465

Lys Asn Arg Glu Gln Trp Glu Glu Pro Gln Glu Ser Ala Ala Pro Leu

470 475 480

Pro Thr Ala Ala Ala Gly Met Leu Leu Leu Gln Gln Leu Ala Ala Ala

485 490 495

Ala Ala Glu Arg Ala Val

501

Claims

1.一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其特征在于，其包括：

将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵衣藻；

所述番茄红素ε-环化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述构建所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体，具体包括：

对番茄红素ε-环化酶-T载体、pH124空载体进行双酶切，得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124；

对所述转化子用新抗性平板二筛，二筛后的转化子菌落进行PCR扩增，得到番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体；

所述将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵衣藻，包括：

将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体用限制性内切酶NotI进行单酶切使其线性化；将线性化番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵藻；

所述番茄红素ε-环化酶基因含7个外显子，6个内含子；

所述番茄红素ε-环化酶-T载体、pH124空载体进行双酶切的反应体系为：酶切buffer 2μL、Eco72I 1 μL、NheI 1μL、番茄红素ε-环化酶-T载体或pH124空载体 1 μg、无菌水 Up to20μL；

所述将得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124，用T4 DNA连接酶进行连接，其中，连接体系为：番茄红素ε-环化酶基因与载体的摩尔比1:1-1:5、线性化质粒pH124 20-100 ng、10X T4 DNA Ligase Buffer 2 μL、T4 DNA Ligase 0.2 μL、无菌水 Upto 20μL。

2.根据权利要求 1 所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其特征在于，所述番茄红素ε-环化酶基因为人工转化番茄红素ε-环化酶基因。

3.根据权利要求 1 所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法，其特征在于，所述将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中，其中转化方法为珠磨法。

4.一种普通小球藻的番茄红素ε-环化酶，其特征在于，由番茄红素ε-环化酶基因编码得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。