ES2254235T3 - Promotor para regular la expresion de genes foraneos. - Google Patents
Promotor para regular la expresion de genes foraneos.Info
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Abstract
Un promotor para regular la expresión de un gen foráneo en una planta transgénica, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las secuencias identificadas en SEQ ID NO:1 a 3.
Description
Promotor para regular la expresión de genes
foráneos.
La invención se refiere a un promotor para
regular la expresión de genes foráneos en un organismo transgénico,
más específicamente, de una manera específica de hoja en plantas
transgénicas.
Durante más de 15 años se han utilizado las
transformaciones genéticas de microbios para producir moléculas
recombinantes útiles y, en la actualidad, las aplicaciones se
aprovechan en las industrias farmacéutica, cosmacéutica y
dermacéutica. En los últimos diez años, esta tecnología se ha
expandido desde los microbios hasta las plantas y animales, con el
desarrollo de las técnicas requeridas para adaptar este concepto
general a organismos eucariotas complejos. Básicamente, un gen que
codifica una proteína de interés, o un gen que codifica una enzima
responsable de la modificación de una vía metabólica que conduce a
una molécula de interés, se une de una manera apropiada a
secuencias reguladoras de acción cis y trans, y se transfiere a una
célula diana en la que se incorpora en la maquinaria molecular (de
una manera transitoria o estable). La célula transgénica, o un
tejido u organismo regenerado a partir de la célula transgénica,
entonces realizará la transcripción y traducción del transgén y,
por tanto, es capaz de acumular la proteína de interés, o de
realizar la nueva reacción metabólica a través de la actividad de
la enzima de
interés.
interés.
La industria emergente de cultivo molecular es
una de las industrias más prometedoras del siglo venidero. Su
promesa consiste en proporcionar factorías moleculares seguras y
renovables para la industria. Entre las aplicaciones que se han
desarrollado en la actualidad se encuentran la producción de bajo
coste de anticuerpos monoclonales para usos terapéuticos y de
diagnóstico, la producción de cantidades ilimitadas de hormonas,
citoquinas y otras moléculas bioactivas para el tratamiento de
enfermedades crónicas o letales, la producción de sustitutos
bioseguros para diversos componentes sanguíneos, la producción de
cantidades ilimitadas de enzimas procesadoras para la industria
alimentaria y de pasta de papel, la producción de bajo coste de
enzimas para el tratamiento de residuos, y la producción de
moléculas bioactivas seguras para la industria cosmética.
Las limitaciones a la aplicación de esta
tecnología a menudo provienen de la incapacidad de los organismos
transgénicos para acumular cantidades adecuadas del producto
recombinante, como resultado de unas bajas velocidades de
transcripción, un escisión inadecuada del mensajero, la
inestabilidad del ARNm foráneo, unas velocidades de traducción
deficientes, la hipersusceptibilidad de la proteína recombinante a
la acción de proteasas endógenas, o la hipersusceptibilidad del
organismo recombinante a la proteína extraña que produce un
crecimiento inadecuado y limitado o, en el peor de los casos, unos
fuertes efectos perjudiciales en el organismo hospedante. La
insuficiencia del nivel de producción tiene un impacto directo sobre
el desarrollo de aplicaciones en las que los márgenes de beneficio
son estrechos, o cuando el tratamiento y/o eliminación de la
materia residual provoca problemas medioambientales o de
bioseguridad. La mejora en el nivel de acumulación del producto
recombinante deseado, por tanto, parece ser un factor crítico que
garantiza la comercialización de muchas aplicaciones del cultivo
molecular.
La fotosíntesis es una reacción metabólica de
suprema importancia en el mundo vivo. La realizan la mayoría de las
plantas terrestres y algas, y algunas bacterias. La reacción global
implica un ensamblaje complejo de proteínas de transferencia de
electrones dispuestas espacialmente dentro del sistema de membranas
tilacoides localizadas en el cloroplastos de las células de las
hojas. Esta cadena de transporte de electrones está acoplada, en un
extremo, con la antena fotosintética, que comprende una diversidad
de macromoléculas, incluyendo una molécula común a todos los
organismos fotosintéticos, la clorofila, y, en el otro extremo, a
las enzimas implicadas en la síntesis de NADPH y ATP, y al ciclo de
Calvin, implicado en el acoplamiento de la liberación de la energía
desde el NADPH y ATP con la fijación de dióxido de carbono gaseoso
en moléculas orgánicas. Entre las proteínas implicadas en la
reacción fotosintética global, una, la ribulosa bifosfato
carboxilasa (Rubisco), es la proteina más abundante sobre
la tierra.
la tierra.
Por tanto, la fotosíntesis es a lo que se dedican
las células de las hojas, y existe un interés obvio en la
utilización de promotores de genes implicados en esta importante
actividad metabólica específica de tejido cuando se construyen
módulos de expresión fuertes específicos de hoja para aplicaciones
en la biotecnología vegetal.
Muchos de los constituyentes peptídicos del
aparato fotosintético son codificados por genes presentes en el
genoma cloroplástico; por ejemplo, la subunidad pesada de Rubisco,
que porta los sitios catalíticos para la fijación de CO_{2}, está
codificada por un gen cloroplástico. Sin embargo, la subunidad
pequeña de esta enzima está codificada por un gen nuclear y, por
tanto, la holoproteína de Rubisco está formada por subunidades
codificadas por dos genomas diferentes. Por razones obvias, ha
habido un gran interés en tratar de emplear promotores de Rubisco
para controlar la transcripción de transgenes en hojas de plantas
transgénicas. El promotor se ha caracterizado exhaustivamente y su
uso en vectores de expresión está protegido por la patente de EEUU
nº 4.962.028.
Keng-Hock Pwee et al. (The
Plant Journal (1993), 3(3), 437-449)
describen el uso de una secuencia promotora de plastocianina de
guisante para la expresión de beta-glucuronidasa
(GUS) en plantas de tabaco transgénicas. Una serie de deleciones 5'
del gen promotor de plastocianina de guisante fusionados con el gen
indicador de beta-glucuronidasa se ha estudiado para
su expresión en plantas de tabaco transgénicas. No se han descrito
otras modificaciones de esta secuencia promotora.
Sería muy deseable proporcionar un promotor para
regular la expresión de genes foráneos en un organismo trangénico,
de forma más específica en plantas transgénicas.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un promotor para regular la expresión de genes
foráneos en un organismo trangénico, de forma más específica en
plantas transgénicas.
Según una realización de la presente invención,
se proporciona un promotor para regular la expresión de genes
foráneos en organismos trangénicos, que comprende un promotor que
tiene las características identificativas de un promotor que tiene
una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias
indicadas en SEQ ID NO: 1 a 3, y sus fragmentos funcionales o
derivados, en el que dicho promotor está adaptado para estar
operativamente colocado con respecto a dicho gen foráneo para la
expresión de dicho gen.
El promotor preferido de la presente invención
tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las
secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1 a 3.
Preferiblemente, el organismo es una planta.
Preferiblemente, el promotor de la presente
invención puede modularse por la presencia o ausencia de luz.
La planta preferida es una dicotiledónea, una
monocotiledónea o una gimnosperma.
Según otra realización de la presente invención,
se proporciona un método para regular la expresión de genes
foráneos en organismos transgénicos, que comprende las etapas
de:
a) preparar un organismo trangénico utilizando un
constructo de expresión que consiste en al menos un promotor de la
presente invención, y un ORF ("open reading frame", marco de
lectura abierto) de un gen, en el que dicho promotor está
operativamente colocado con respecto a dicho gen para la expresión
de dicho gen.
Para los fines de la presente invención, a
continuación se definen las siguientes expresiones.
La expresión "sus fragmentos funcionales o
derivados" pretende significar cualquier derivado o fragmento de
las secuencias SEQ ID NO: 1-3 que permite un nivel
de expresión de un gen foráneo equivalente al del promotor de la
presente invención indicado en SEQ ID NO: 1-3.
A continuación se expone una descripción
detallada del método utilizado para generar líneas de alfalfa
trangénicas, cuya expresión puede ser regulada por un gen
indicador.
En esta realización, un promotor que tiene la
secuencia indicada en SEQ ID NO: 1-3 se ligó a un
gen indicador y a un terminador, y este constructo se insertó en
vectores de expresión vegetales adecuados para el bombardeo de ADN
sobre hojas de alfalfa, y para la transferencia de ADN mediada por
Agrobacterium como se describe en Desgagnés et al.
(1995, Plant Cell Tissue Organ Cult., 42:
129-140). Estos dos métodos de transferencia de ADN
se utilizaron para demostrar que la expresión del gen indicador
puede modularse por la luz.
La secuenciación del ADN se realizó como se
describe en Sanger et al. (1997, P.N.A.S. USA,
74: 5643-5647).
Los promotores resultantes de la presente
invención tienen las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1 a 3.
Los módulos para los análisis de expresión que
utilizan el gen indicador GUS se montaron como sigue. Un módulo sin
promotor GUS se digirió a partir de pBI101 con HindIII y EcoRI, y se
insertó en los sitios HindIII y EcoRI del sitio de policlonación de
pUC19. El plásmido resultante se denominó pBI201 y se utilizó para
posteriores constructos. Las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, que son
fragmentos de deleción de la SEQ ID NO: 1, se fusionaron de forma
transcripcional y traduccional en el extremo
5'-terminal del gen indicador GUS en pBI201 y se
utilizaron para estudios de expresión transitoria empleando
bombardeo de ADN. Tras la identificación del fragmento de deleción
adecuado se subclonó en un vector de expresión vegetal binario, como
pBI101 (Clonetech). Estos plásmidos recombinantes se utilizaron
para la integración estable a través de una infección por A.
tumefaciens, como se describe a continuación.
Los plásmidos recombinantes se introdujeron en
Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 mediante
electroporación, como se describe en Khoudi et al. (1999,
Biotechnol. Bioeng., 64: 135-143). Las cepas de
Agrobacterium seleccionadas entonces se cocultivaron con
discos de hojas del genotipo C5-1 durante 4 días en
ausencia de presión de selección (kanamicina). Después de este
periodo de incubación, los discos de hojas se lavaron y se secaron
con algodón, y después se dejó que formaran callos en medio B5H. Los
callos entonces se transfirieron durante 21 días a medio SH para la
inducción de embriones, y durante 28 días a BOi2Y para el
desarrollo de los embriones. Los embriones con forma de torpedo se
retiraron de Boi2Y y se colocaron en medio MS para su regeneración.
La kanamicina estaba presente en todos los medios de cultivo,
excepto en el cocultivo y la regeneración en MS. Este método se
describe extensamente en Desgagnés et al. (1995, Plant
Cell Tissue Organ Cult., 42: 129-140). Las
plántulas enraizadas se cultivaron hasta su madurez en un
invernadero.
Aunque esta invención se ha descrito haciendo
referencia a sus realizaciones específicas, se entenderá que es
susceptible de otras modificaciones, y esta solicitud pretende
cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención que
siga, en general, los principios de la invención, e incluye las
desviaciones de la presente descripción según la práctica conocida
o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y
según puedan aplicarse a las características esenciales indicadas
anteriormente, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
<110> VÉZINA,
Louis-Philippe
\hskip1,1cmD'AOUST, Marc-André
\hskip1,1cmMEDICAGO Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROMOTOR PARA REGULAR LA EXPRESIÓN DE
GENES FORÁNEOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 14149-4
"PCT"
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento US 60/157.129
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-10-1999
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que se va a utilizar como
promotor para regular la expresión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 971
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<212> ADN
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<223> Secuencia que se va a utilizar como
promotor para regular la expresión
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<210> 3
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<211> 731
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia que se va a utilizar como
promotor para regular la expresión
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<400> 3
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Claims (5)
1. Un promotor para regular la expresión de un
gen foráneo en una planta transgénica, que comprende una secuencia
de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las
secuencias identificadas en SEQ ID NO:
1 a 3.
1 a 3.
2. Un constructo que comprende un promotor según
la reivindicación 1, y un gen foráneo, en el que dicho promotor
está adaptado para estar operativamente colocado con respecto a
dicho gen foráneo para la expresión de dicho gen.
3. El uso de un promotor según la reivindicación
1 para regular la expresión de un gen foráneo en una planta
transgénica.
4. El uso de la reivindicación 3, en el que dicha
planta es una dicotiledónea, una monocotiledónea o una
gimnosperma.
5. El uso de la reivindicación 3, en el que dicho
promotor está modulado para la expresión transcripcional de dicho
gen por la presencia o ausencia de luz.
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