ES2254235T3 - Promotor para regular la expresion de genes foraneos. - Google Patents

Abstract

Un promotor para regular la expresión de un gen foráneo en una planta transgénica, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las secuencias identificadas en SEQ ID NO:1 a 3.

Description

Promotor para regular la expresión de genes foráneos.

Antecedentes de la invención (a) Campo de la invención

La invención se refiere a un promotor para regular la expresión de genes foráneos en un organismo transgénico, más específicamente, de una manera específica de hoja en plantas transgénicas.

(b) Descripción de la técnica anterior

Durante más de 15 años se han utilizado las transformaciones genéticas de microbios para producir moléculas recombinantes útiles y, en la actualidad, las aplicaciones se aprovechan en las industrias farmacéutica, cosmacéutica y dermacéutica. En los últimos diez años, esta tecnología se ha expandido desde los microbios hasta las plantas y animales, con el desarrollo de las técnicas requeridas para adaptar este concepto general a organismos eucariotas complejos. Básicamente, un gen que codifica una proteína de interés, o un gen que codifica una enzima responsable de la modificación de una vía metabólica que conduce a una molécula de interés, se une de una manera apropiada a secuencias reguladoras de acción cis y trans, y se transfiere a una célula diana en la que se incorpora en la maquinaria molecular (de una manera transitoria o estable). La célula transgénica, o un tejido u organismo regenerado a partir de la célula transgénica, entonces realizará la transcripción y traducción del transgén y, por tanto, es capaz de acumular la proteína de interés, o de realizar la nueva reacción metabólica a través de la actividad de la enzima de
interés.

La industria emergente de cultivo molecular es una de las industrias más prometedoras del siglo venidero. Su promesa consiste en proporcionar factorías moleculares seguras y renovables para la industria. Entre las aplicaciones que se han desarrollado en la actualidad se encuentran la producción de bajo coste de anticuerpos monoclonales para usos terapéuticos y de diagnóstico, la producción de cantidades ilimitadas de hormonas, citoquinas y otras moléculas bioactivas para el tratamiento de enfermedades crónicas o letales, la producción de sustitutos bioseguros para diversos componentes sanguíneos, la producción de cantidades ilimitadas de enzimas procesadoras para la industria alimentaria y de pasta de papel, la producción de bajo coste de enzimas para el tratamiento de residuos, y la producción de moléculas bioactivas seguras para la industria cosmética.

Las limitaciones a la aplicación de esta tecnología a menudo provienen de la incapacidad de los organismos transgénicos para acumular cantidades adecuadas del producto recombinante, como resultado de unas bajas velocidades de transcripción, un escisión inadecuada del mensajero, la inestabilidad del ARNm foráneo, unas velocidades de traducción deficientes, la hipersusceptibilidad de la proteína recombinante a la acción de proteasas endógenas, o la hipersusceptibilidad del organismo recombinante a la proteína extraña que produce un crecimiento inadecuado y limitado o, en el peor de los casos, unos fuertes efectos perjudiciales en el organismo hospedante. La insuficiencia del nivel de producción tiene un impacto directo sobre el desarrollo de aplicaciones en las que los márgenes de beneficio son estrechos, o cuando el tratamiento y/o eliminación de la materia residual provoca problemas medioambientales o de bioseguridad. La mejora en el nivel de acumulación del producto recombinante deseado, por tanto, parece ser un factor crítico que garantiza la comercialización de muchas aplicaciones del cultivo molecular.

La fotosíntesis es una reacción metabólica de suprema importancia en el mundo vivo. La realizan la mayoría de las plantas terrestres y algas, y algunas bacterias. La reacción global implica un ensamblaje complejo de proteínas de transferencia de electrones dispuestas espacialmente dentro del sistema de membranas tilacoides localizadas en el cloroplastos de las células de las hojas. Esta cadena de transporte de electrones está acoplada, en un extremo, con la antena fotosintética, que comprende una diversidad de macromoléculas, incluyendo una molécula común a todos los organismos fotosintéticos, la clorofila, y, en el otro extremo, a las enzimas implicadas en la síntesis de NADPH y ATP, y al ciclo de Calvin, implicado en el acoplamiento de la liberación de la energía desde el NADPH y ATP con la fijación de dióxido de carbono gaseoso en moléculas orgánicas. Entre las proteínas implicadas en la reacción fotosintética global, una, la ribulosa bifosfato carboxilasa (Rubisco), es la proteina más abundante sobre
la tierra.

Por tanto, la fotosíntesis es a lo que se dedican las células de las hojas, y existe un interés obvio en la utilización de promotores de genes implicados en esta importante actividad metabólica específica de tejido cuando se construyen módulos de expresión fuertes específicos de hoja para aplicaciones en la biotecnología vegetal.

Muchos de los constituyentes peptídicos del aparato fotosintético son codificados por genes presentes en el genoma cloroplástico; por ejemplo, la subunidad pesada de Rubisco, que porta los sitios catalíticos para la fijación de CO_{2}, está codificada por un gen cloroplástico. Sin embargo, la subunidad pequeña de esta enzima está codificada por un gen nuclear y, por tanto, la holoproteína de Rubisco está formada por subunidades codificadas por dos genomas diferentes. Por razones obvias, ha habido un gran interés en tratar de emplear promotores de Rubisco para controlar la transcripción de transgenes en hojas de plantas transgénicas. El promotor se ha caracterizado exhaustivamente y su uso en vectores de expresión está protegido por la patente de EEUU nº 4.962.028.

Keng-Hock Pwee et al. (The Plant Journal (1993), 3(3), 437-449) describen el uso de una secuencia promotora de plastocianina de guisante para la expresión de beta-glucuronidasa (GUS) en plantas de tabaco transgénicas. Una serie de deleciones 5' del gen promotor de plastocianina de guisante fusionados con el gen indicador de beta-glucuronidasa se ha estudiado para su expresión en plantas de tabaco transgénicas. No se han descrito otras modificaciones de esta secuencia promotora.

Sería muy deseable proporcionar un promotor para regular la expresión de genes foráneos en un organismo trangénico, de forma más específica en plantas transgénicas.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un promotor para regular la expresión de genes foráneos en un organismo trangénico, de forma más específica en plantas transgénicas.

Según una realización de la presente invención, se proporciona un promotor para regular la expresión de genes foráneos en organismos trangénicos, que comprende un promotor que tiene las características identificativas de un promotor que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1 a 3, y sus fragmentos funcionales o derivados, en el que dicho promotor está adaptado para estar operativamente colocado con respecto a dicho gen foráneo para la expresión de dicho gen.

El promotor preferido de la presente invención tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1 a 3.

Preferiblemente, el organismo es una planta.

Preferiblemente, el promotor de la presente invención puede modularse por la presencia o ausencia de luz.

La planta preferida es una dicotiledónea, una monocotiledónea o una gimnosperma.

Según otra realización de la presente invención, se proporciona un método para regular la expresión de genes foráneos en organismos transgénicos, que comprende las etapas de:

a) preparar un organismo trangénico utilizando un constructo de expresión que consiste en al menos un promotor de la presente invención, y un ORF ("open reading frame", marco de lectura abierto) de un gen, en el que dicho promotor está operativamente colocado con respecto a dicho gen para la expresión de dicho gen.

Para los fines de la presente invención, a continuación se definen las siguientes expresiones.

La expresión "sus fragmentos funcionales o derivados" pretende significar cualquier derivado o fragmento de las secuencias SEQ ID NO: 1-3 que permite un nivel de expresión de un gen foráneo equivalente al del promotor de la presente invención indicado en SEQ ID NO: 1-3.

Descripción detallada de la invención

A continuación se expone una descripción detallada del método utilizado para generar líneas de alfalfa trangénicas, cuya expresión puede ser regulada por un gen indicador.

En esta realización, un promotor que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1-3 se ligó a un gen indicador y a un terminador, y este constructo se insertó en vectores de expresión vegetales adecuados para el bombardeo de ADN sobre hojas de alfalfa, y para la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium como se describe en Desgagnés et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult., 42: 129-140). Estos dos métodos de transferencia de ADN se utilizaron para demostrar que la expresión del gen indicador puede modularse por la luz.

Materiales y métodos Secuenciación de ADN

La secuenciación del ADN se realizó como se describe en Sanger et al. (1997, P.N.A.S. USA, 74: 5643-5647).

Los promotores resultantes de la presente invención tienen las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 1 a 3.

Construcción de módulos de expresión y vectores

Los módulos para los análisis de expresión que utilizan el gen indicador GUS se montaron como sigue. Un módulo sin promotor GUS se digirió a partir de pBI101 con HindIII y EcoRI, y se insertó en los sitios HindIII y EcoRI del sitio de policlonación de pUC19. El plásmido resultante se denominó pBI201 y se utilizó para posteriores constructos. Las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, que son fragmentos de deleción de la SEQ ID NO: 1, se fusionaron de forma transcripcional y traduccional en el extremo 5'-terminal del gen indicador GUS en pBI201 y se utilizaron para estudios de expresión transitoria empleando bombardeo de ADN. Tras la identificación del fragmento de deleción adecuado se subclonó en un vector de expresión vegetal binario, como pBI101 (Clonetech). Estos plásmidos recombinantes se utilizaron para la integración estable a través de una infección por A. tumefaciens, como se describe a continuación.

Transferencia de ADN mediada por Agrobacterium y regeneración de las líneas transgénicas

Los plásmidos recombinantes se introdujeron en Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 mediante electroporación, como se describe en Khoudi et al. (1999, Biotechnol. Bioeng., 64: 135-143). Las cepas de Agrobacterium seleccionadas entonces se cocultivaron con discos de hojas del genotipo C5-1 durante 4 días en ausencia de presión de selección (kanamicina). Después de este periodo de incubación, los discos de hojas se lavaron y se secaron con algodón, y después se dejó que formaran callos en medio B5H. Los callos entonces se transfirieron durante 21 días a medio SH para la inducción de embriones, y durante 28 días a BOi2Y para el desarrollo de los embriones. Los embriones con forma de torpedo se retiraron de Boi2Y y se colocaron en medio MS para su regeneración. La kanamicina estaba presente en todos los medios de cultivo, excepto en el cocultivo y la regeneración en MS. Este método se describe extensamente en Desgagnés et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult., 42: 129-140). Las plántulas enraizadas se cultivaron hasta su madurez en un invernadero.

Aunque esta invención se ha descrito haciendo referencia a sus realizaciones específicas, se entenderá que es susceptible de otras modificaciones, y esta solicitud pretende cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención que siga, en general, los principios de la invención, e incluye las desviaciones de la presente descripción según la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y según puedan aplicarse a las características esenciales indicadas anteriormente, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> VÉZINA, Louis-Philippe

\hskip1,1cm

D'AOUST, Marc-André

\hskip1,1cm

MEDICAGO Inc.

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<120> PROMOTOR PARA REGULAR LA EXPRESIÓN DE GENES FORÁNEOS

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<130> 14149-4 "PCT"

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<150> documento US 60/157.129

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<151> 04-10-1999

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<160> 3

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<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1350

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia que se va a utilizar como promotor para regular la expresión

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 971

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia que se va a utilizar como promotor para regular la expresión

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 731

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia que se va a utilizar como promotor para regular la expresión

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<400> 3

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3

Claims (5)

1. Un promotor para regular la expresión de un gen foráneo en una planta transgénica, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las secuencias identificadas en SEQ ID NO:
1 a 3.

2. Un constructo que comprende un promotor según la reivindicación 1, y un gen foráneo, en el que dicho promotor está adaptado para estar operativamente colocado con respecto a dicho gen foráneo para la expresión de dicho gen.

3. El uso de un promotor según la reivindicación 1 para regular la expresión de un gen foráneo en una planta transgénica.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que dicha planta es una dicotiledónea, una monocotiledónea o una gimnosperma.

5. El uso de la reivindicación 3, en el que dicho promotor está modulado para la expresión transcripcional de dicho gen por la presencia o ausencia de luz.