JP2023518464A

JP2023518464A - 植物から目的タンパク質を大量生産する方法

Info

Publication number: JP2023518464A
Application number: JP2022556552A
Authority: JP
Inventors: ファン，インファン; カン，ヒャンジュ; イ，ジュンホ; ソン，シジャン; ムタミル，セルヴァン・タンガラス
Original assignee: Bioapplications Inc
Current assignee: Bioapplications Inc
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2023-05-01
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: US20230113417A1; CN115461464A; KR102643810B1; WO2021187750A1; JP7491517B2; EP4123027A4; EP4123027A1; KR20210117808A

Abstract

本発明は、植物から目的タンパク質を大量生産する方法に関し、より詳しくは目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ）の高発現用発現カセットコンストラクト及び遺伝子サイレンシング抑制因子（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）であるｐ３８の高発現用発現カセットコンストラクトを製造した後、前記コンストラクトを共に有する植物細胞における一過性発現用（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）バイナリーベクターを製造した後、前記バイナリーベクターを単一のアグロバクテリウム培養を用い、アグロバクテリウム－媒介形質転換を用いて目的タンパク質を植物の葉細胞から高レベルのタンパク質を生産する方法に関する。

Description

本出願は、２０２０年０３月２０日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００３４５７６号を優先権として主張し、上記明細書全体は本出願の参考文献である。

本発明は、植物から目的タンパク質を大量生産する方法に関し、より詳しくは目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ）の高発現用発現カセットコンストラクト、及び遺伝子サイレンシング抑制因子（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）であるｐ３８の高発現用発現カセットコンストラクトを製造した後、前記コンストラクトを共に有する植物細胞における一過性発現用（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のバイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒ）を製造した後、前記バイナリーベクターを単一のアグロバクテリウム培養により、アグロバクテリウム－媒介形質転換を用いることで、目的タンパク質を植物の葉から高レベルのタンパク質を生産する方法に関する。

最近、植物から組換えタンパク質を低コストで生産できる可能性が提案されており、これによって様々な試みが進められている（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇｅｔａｌ．、２００３；Ｈｏｌｔｚｅｔａｌ．、２０１５；Ｍａｒｕｓｉｃｅｔａｌ．、２０１６）。特に、様々な医療用タンパク質の生産可能性などを確認する研究が進行されている。植物から組換えタンパク質を生産する場合は様々な長所があり、その１つは大腸菌など微生物に存在する内毒素のような毒素がほぼ存在しないという点と、人体に感染する病原体がないという点である。また、プリオンのような有害なタンパク質もないことが知られていおり、動物細胞や微生物に比べて安全な組換えタンパク質を生産することができる。また製造コストも、動物細胞より非常に安価であり、植物を栽培する方法によって、大規模生産においては大腸菌などのような微生物よりさらに経済的である。このような可能性を実現するためにはいくつかの必須な技術の開発が必要である。そのうち最も重要な技術が、植物において遺伝子の高発現を誘導できる発現ベクターの開発である（Ｓｔａｕｂｅｔａｌ、２０００；Ｒｅｇｎａｒｄｅｔａｌ．、２０１０）。植物においては様々な方法により遺伝子の発現を誘導することができる。組換え遺伝子を植物体のゲノムに組み込む（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）方法、葉緑体のゲノムに組み込む方法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いて一過性に遺伝子を発現させる方法など様々な方法が可能である（Ａｒｚｏｌａｅｔａｌ．、２０１１；Ｗｅｒｎｅｒｅｔａｌ．、２０１１）。核ゲノム（Ｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｏｍｅ）や葉緑体ゲノムに組換え遺伝子を組み込む方法は、基本的に形質転換体を確保する過程を通じて植物からタンパク質を生産することになる。一方、アグロバクテリウムを植物組織に浸透させて遺伝子の一過性発現を誘導することによりタンパク質を生産する場合は、形質転換体の製造過程が含まれていないのでタンパク質の生産期間が短く、概して形質転換体を通じるタンパク質生産に比べてタンパク質の生産レベルが著しく高いという長所がある（Ａｒｚｏｌａｅｔａｌ．、２０１１）。また、植物が有している他の遺伝子の発現抑制機構を、遺伝子サイレンシング抑制因子を共浸潤（ｃｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）することで抑制することができるので、タンパク質の発現レベルをさらに高く誘導することができる（Ｇａｒａｂａｇｉｅｔａｌ．、２０１１）。しかし、一過性発現をしようとする度に、目的タンパク質を含むバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム培養と、ｐ３８遺伝子サイレンシング抑制因子を発現するバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム培養とを別に製作し、これらを適切な比率で混ぜて共浸潤する過程を行わなければならないという短所がある。特に２つの種類のアグロバクテリウムを培養する場合は時間及び経済的な面で限界がある。

本発明は、目的遺伝子の高発現用発現カセットを製造し、これを、目的タンパク質の発現阻害を抑制するｐ３８である遺伝子サイレンシング抑制因子（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）を１つのバイナリーベクターに導入することで、植物体における一過性発現によりタンパク質を高レベルで生産する発現ベクターに関する。

［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
本発明は、植物から目的タンパク質を大量発現する方法に関し、植物における一過性発現を用いて目的タンパク質を植物に形質転換することで、目的遺伝子のタンパク質を高レベルで生産する目的タンパク質の発現用バイナリーベクター、及びこれを用いた植物から目的タンパク質を大量発現する方法に関する。上述した課題を解決するため、本発明者らは、目的タンパク質の高発現用発現カセット、及び遺伝子サイレンシング抑制因子であるｐ３８の高発現用発現カセットを開発し、前記２つの高発現用発現カセット（目的タンパク質及びｐ３８高発現カセット）を共に有するバイナリーベクターを開発した。前記バイナリーベクターを用いて目的タンパク質とｐ３８遺伝子とを１つのアグロバクテリウム培養を用いて植物細胞に伝達することで、目的遺伝子のタンパク質の高レベルの生産を確認した。詳しくは、目的タンパク質の高発現カセットを構築するために、Ｍａｃプロモーターの３’末端に一塩基多型（ＡをＴ塩基に置換）を導入することにより、元のＭａｃプロモーターより転写レベルの高いＭａｃＴプロモーターを製造し、シロイヌナズナの様々なターミネーターのシーケンスを実験した結果、ＲＤ２９Ｂのターミネーターが高効率のターミネーターであることを確認し、前記ＭａｃＴプロモーター及びＲＤ２９Ｂのターミネーターを構成要素として用いて高発現用発現カセットを製造した。また、これに加え、高効率翻訳を誘導する２１塩基対長の翻訳の効率を高める翻訳増強配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）を目的タンパク質ＡＵＧコドン（ＡＵＧｃｏｄｏｎ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅｕｐｓｔｒｅａｍに５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）で用いることで、目的タンパク質のタンパク質の生産レベルを高めるようにした。目的タンパク質と共にアグロバクテリウムによって植物細胞に導入されるｐ３８遺伝子の発現レベルを高めるために、転写効率の高い２１－塩基対長の翻訳増強配列を５’－ＵＴＲに導入することによりｐ３８の発現を高めることで、遺伝子サイレンシング抑制因子の効率を高めた。前記２つの発現カセット（目的タンパク質とｐ３８遺伝子）をｐＣＡＭＢＩＡ１３００のオリジナル遺伝子発現カセット（ｏｒｉｇｉｎａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）とハイグロマイシン発現カセット（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）を置換する方法で導入してｐＴＥＸ１Ｌベクターを完成した。このｐＴＥＸ１Ｌを用いると、Ｐ３８発現用ベクターを有するアグロバクテリウムと目的タンパク質を含むアグロバクテリウムと混合し、２つの種類のアグロバクテリウムを用いて共浸潤することなく、ｐＴＥＸ１Ｌバイナリーベクターを有する１つの種類のアグロバクテリウムによって、目的タンパク質とｐ３８を同時に伝達し、これによって目的遺伝子のタンパク質レベルの高発現を誘導し、これによって高効率のタンパク質の生産を誘導できる効果を確認した。これによって、１つのバイナリーベクターが目的タンパク質及び遺伝子サイレンシング抑制因子であるｐ３８を同時に伝達できる二重伝達用発現ベクターを完成した。

本発明は、植物から目的タンパク質を大量生産するための組換えベクターを提供することを目的とする。

本発明の他の目的は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することである。

本発明のまた他の目的は、下記のステップを含む、植物から目的タンパク質を大量生産するための方法を提供することである：
（ａ）上述の組換えベクターを構築すること；
（ｂ）前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造すること；
（ｃ）前記形質転換体を培養すること；
（ｄ）前記培養物を植物に浸潤させること；及び
（ｅ）前記植物を粉砕して目的タンパク質を抽出すること。

［技術的解決方法］
上述した課題を解決するため、本発明は、（ｉ）Ｍａｃプロモーター（Ｍａｃｐｒｏｍｏｔｅｒ）；（ｉｉ）目的タンパク質をコードする遺伝子；及び（ｉｉｉ）ＲＤ２９Ｂ－ｔターミネーターを含む、植物から目的タンパク質を大量生産するための組換えベクターを製造してもよい。

本発明の好ましい一実施例によると、前記Ｍａｃプロモーターの遺伝子配列は、配列番号１の塩基配列を含んでもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によると、Ｍａｃプロモーターの３’末端塩基であるＡをＴに置換したＭａｃＴプロモーターであってもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によると、前記ＭａｃＴプロモーターは、配列番号２の塩基配列を含んでもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によると、前記ＲＤ２９Ｂ－ｔターミネーターは、配列番号３の塩基配列を含んでもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によると、前記目的タンパク質は、水溶性緑色蛍光タンパク質（Ｓｏｌｕｂｌｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）、エクスプロイティブプロテイン（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ）、成長因子及びリポータータンパク質からからなる群より選択されるいずれか１つ以上のタンパク質であってもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によると、前記ベクターは、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００であってもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によると、前記組換えベクターは、遺伝子サイレンシング抑制因子（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）遺伝子をさらに含んでもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によると、前記遺伝子サイレンシング抑制遺伝子は、ｐ３８、Ｐ１９、ＨＣ－Ｐｒｏ及びＴＶＡ２ｂからからなる群より選択されるいずれか１つであってもよい。

さらに本発明は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供してもよい。

本発明の好ましい一実施例によると、前記形質転換体は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であってもよい。

さらに本発明は、下記のステップを含む、植物から目的タンパク質を生産する方法を提供してもよい：
（ａ）上述の組換えベクターを構築すること；
（ｂ）前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造すること；
（ｃ）前記形質転換体を培養すること；
（ｄ）前記培養物を植物に浸潤させること；及び
（ｅ）前記植物を粉砕して目的タンパク質を抽出すること。

本発明の好ましい一実施例によると、前記（ｄ）工程に、ｐ３８を含む組換えベクターを細胞に導入した形質転換体をさらに植物に浸潤させることを追加してもよい。
[発明の概要]

本発明によるベクターは、目的遺伝子のタンパク質の発現レベルを高めることができるという効果がある。より詳しくは、Ｍａｃプロモーターの３’末端に一塩基多型（ＡをＴ塩基に置換）を導入することで、元のＭａｃプロモーターより転写レベルの高いＭａｃＴプロモーター、タンパク質の発現を高めるＭドメイン、ＥＲの高い蓄積を誘導するＢｉＰ、ＥＲに高い蓄積率を誘導するＨＤＥＬ、ＲＤ２９Ｂのターミネーター、遺伝子サイレンシング抑制因子であるｐ３８、翻訳増強配列である５’－ＵＴＲを順に連結して製造したベクターである。前記組換えベクターをアグロバクテリウムに形質転換した後に培養し、真空浸潤法で植物から目的タンパク質を低コストかつ高効率で生産できるという効果がある。

図１は、３種のプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｍａｃ又はＭａｃＴ（Ｍａｃプロモーターの３’末端に一塩基であるＡからＴに置換））の効率を比較分析した結果であって、（ａ）は、実験に用いられたコンストラクトの開裂地図であり、（ｂ）は、前記プラスミドコンストラクトをプロトプラストに導入してからタンパク質を抽出した後、前記タンパク質とａｎｔｉ－ＧＦＰとを反応させてウエスタンブロット分析を行った結果であり、（ｃ）は、前記メンブレンをクーマシーブルー染色ダイで染色した結果である。（ＮＴ、ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ、タンパク質の大きさ（ｓｔａｎｄａｒｄ））図２は、３種の３’末端のターミネーター（ＨＳＰ－ｔ、ＡｔＥｘｔ４－ｔ又はＲＤ２９Ｂ－ｔ）によるタンパク質の生産レベルを比較分析した結果であって、（ａ）は、実験に用いられたコンストラクトの開裂地図であり、（ｂ）は、前記プラスミドコンストラクトをプロトプラストに導入してからタンパク質を抽出した後、前記タンパク質とａｎｔｉ－ＧＦＰとを反応させてウエスタンブロット分析を行った結果であり、（ｃ）は、前記メンブレンをクーマシーブルー染色ダイで染色した結果である。（ＮＴ、ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ、タンパク質の大きさ（ｓｔａｎｄａｒｄ））図３は、２種のプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ又はＭａｃＴ）及び３種のターミネーター（Ｎｏｓ－ｔ、ＨＳＰ－ｔ又はＲＤ２９Ｂ－ｔ）の組み合わせによるタンパク質の生産レベルを比較分析した結果であって、（ａ）は、実験に用いられたコンストラクトの開裂地図であり、（ｂ）は、前記プラスミドコンストラクトをプロトプラストに導入してからタンパク質を抽出した後、前記タンパク質とａｎｔｉ－ＧＦＰとを反応させてウエスタンブロット分析を行った結果であり、（ｃ）は、メンブレンをクーマシーブルー染色ダイで染色した結果である。（ＮＴ、ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ、タンパク質の大きさ（ｓｔａｎｄａｒｄ））図４は、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００からハイグロマイシン遺伝子を除去すると共に、Ａｃｃ６５ＩとＳａｌＩ制限部位（ＳａｌＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ）を導入し、ｄｏｕｂｌｅ３５Ｓプロモーターの５’末端にＢｓｒＧＩｓｉｔｅを導入してｐＭ３５Ｍを製作し、前記ｐＭ３５ＭにＡｃｃ６５ＩとＳａｌＩを用いてＰ３８遺伝子を導入してｐＴＥＸ０を製造し、ｐＴＥＸ０にまたＭａｃＴ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔをＰｓｔＩとＥｃｏＲＩとを用いて導入してｐＴＥＸ１：ＧＦＰを製造した、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００からｐＴＥＸ１を製作する過程を整理した模式図である。図５は、ｐｍＥＧＲ又はｐＴＥＸ１：ＧＦＰのＰ３８によるタンパク質の生産レベルを比較分析した結果であって、（ａ）は、実験に用いられたコンストラクトの開裂地図であり、（ｂ）は、ｐＭＥＧＲ又はｐＴＥＸ１：ＧＦＰをアグロバクテリウムを用いて単独で、又はＰ３８を発現するバイナリーベクターを含むアグロバクテリウムを混ぜて共浸潤することで、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉の組織でＧＦＰの発現を誘導し、浸潤（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）した後から５日目にタンパク質を抽出し、ＳＤＳ－ページ（ＳＤＳ－ｐａｇｅ）を用いて展開した後、メンブレンをクーマシーブルー染色ダイで染色した結果であり、（ｃ）は、前記タンパク質を、ａｎｔｉ－ＧＦＰを反応させてウエスタンブロット分析を行った結果である。図６は、ｐＴＥＸ１、ｐＴＥＸ１Ｎ又はｐＴＥＸ１Ｌを用いてＰ３８タンパク質の発現レベルを比較分析した結果であって、ｐＴＥＸ１はｃｏＰ３８を有しており、ｐＴＥＸ１ＮとｐＴＥＸ１Ｌは、ｏｒｉｇｉｎａｌＰ３８遺伝子を有しており、またｐＴＥＸ１Ｌは、Ｐ３８の前にＬ配列を有する２１塩基対の５’ＵＴＲを含ませ、（ａ）は、前記ｐＴＥＸ１、ｐＴＥＸ１Ｎ又はｐＴＥＸ１Ｌの開裂地図であり、（ｂ）は、ｐＴＥＸ１、ｐＴＥＸＮ１及びｐＴＥＸ１Ｌをシロイヌナズナのプロトプラストに形質転換してＰ３８の発現を誘導し、これを抗Ｐ３８抗体を用いてウェスタンブロット分析でＰ３８タンパク質の発現レベルを確認した結果である。（ＮＴ、ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ；ＲｂｃＬ、タンパク質ローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌ）として用いた。）図７は、ｐＴＥＸ１Ｌによって誘導される目的タンパク質の発現レベルを比較分析した結果であって、（Ａ）ｐＴＥＸ１Ｌの目的タンパク質の発現レベルを比較した結果であり、ｐＴＥＸ１Ｌ、ｐＭＥＲＧ、１３００－ＢｉＰ－ＧＦＰ－ＨＤＥＬをアグロバクテリウム浸潤法でＮ．ベンサミアナ導入して発現レベルを比較し、Ｐ３８を共形質転換（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の有（＋）、無（－）によって、目的タンパク質のＥＲｔａｒｇｅｔｅｄＧＦＰタンパク質の発現レベルを抗ＧＦＰ抗体を用いて比較分析した結果であり、（Ｂ）は、Ｐ３８の発現レベルを比較分析した結果であって、Ｎ．ベンサミアナ葉エキスを用いて、Ｐ３８の発現レベルを抗Ｐ３８抗体を用いてウェスタンブロット分析で比較分析した結果であり、（Ｃ）クマシーブルー染色Ｐ３８及びＲｂｃＬのレベルを比較した結果であって、ウェスタンブロット分析後にメンブレンをクーマシーブルーで染色して、Ｐ３８のレベルとローディングコントロールとして用いるためにＲｂｃＬのレベルを確認した結果である。

［発明の実施のための形態］
以下で本発明をさらに詳しく説明する。

上述したように、動物細胞又は微生物を用いてタンパク質を生産することは、ウイルス、がん遺伝子、腸毒素のような様々な汚染源のような問題を引き起こし、大量生産時に期間及びコストが多くかかるという限界を有する。これを克服するために植物からタンパク質を生産する方法が開発されているが、これもタンパク質の発現が低いという限界がある。

このため、本発明者らは植物から目的タンパク質の発現量を増加させるための組換えベクターを製作した。本発明の組換えベクターは目的タンパク質を含み、前記目的タンパク質を含む組換えベクターを培養した後、前記培養液を植物に浸潤した後、前記植物から目的遺伝子のタンパク質の発現が高いレベルに増加するということを確認した。

以下、添付した図面を参照として、本発明の実施例について本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように詳しく説明する。本発明は様々な異なる形態で具現でき、ここで説明する実施例に限定されない。

本願発明は、（ｉ）Ｍａｃプロモーター（Ｍａｃｐｒｏｍｏｔｅｒ）；（ｉｉ）目的タンパク質をコードする遺伝子；及び（ｉｉｉ）ＲＤ２９Ｂ－ｔターミネーター；を含む、植物から目的タンパク質を大量生産するための組換えベクターを提供することができる。

本願発明者らは、高発現バイナリーベクターが含んでいる、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又はダブルエンハンサー（ｄｏｕｂｌｅｅｎｈａｎｃｅｒ）を有する３５Ｓプロモーターよりさらに発現の高い高発現プロモーターを開発しようとした。これによって、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｍａｃプロモーター（配列番号１）、Ｍａｃプロモーター塩基配列の３’末端塩基であるＡをＴに置換したＭａｃＴプロモーター（配列番号２）を含むベクターをデザインした後、ＧＦＰを発現させた結果、ＭａｃＴプロモーターが約５０％程度の発現効率が高いことを確認した（図１）。

前記Ｍａｃプロモーターの遺伝子配列は、配列番号１の塩基配列を含むことができ、具体的に前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された２つの配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参照配列（追加又は削除を含まない）と比較して追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。

前記Ｍａｃプロモーターは、Ｍａｃプロモーターの３’末端塩基であるＡをＴに置換したＭａｃＴであってもよく、前記ＭａｃＴプロモーターは、配列番号２の塩基配列を含んでもよく、具体的に前記遺伝子は、配列番号２の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された２つの配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参照配列（追加又は削除を含まない）と比較して追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。

遺伝子の発現にはターミネーターの種類による発現レベルを確認した。シロイヌナズナの遺伝子のうちＲＤ２９Ｂの発現が普段は非常に低く維持されるが、植物が日照りのような非生物的ストレス（ａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ）を受けると、ＡＢＡのような物質によって発現が高くかつ迅速に誘導されると知られている。これによって、ＲＤ２９Ｂが転写レベルを迅速に高く誘導するためには、転写のターミネーターも高効率で起きると仮定して、ＲＤ２９Ｂのターミネーターが（ＲＤ２９Ｂ－ｔ；配列番号３）が遺伝子の発現レベルを高めるかを確認した。シロイヌナズナのＡｔＥｘｔ４ターミネーター（ＡｔＥｘｔ４－ｔ）、及び高発現を誘導すると知られたＨＳＰターミネーターターミネーター（ＨＳＰ－ｔ）を参照ターミネーター（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）として用いて図２でのような発現ベクターを製作した後、これをシロイヌナズナのプロトプラストに導入してｓＧＦＰの発現レベルを確認した（図２）。その結果、ＲＤ２９Ｂのターミネーターが２つの参照ターミネーターよりｓＧＦＰの発現を５０％以上高く誘導することが確認された。

前記ＲＤ２９Ｂ－ｔターミネーターは、配列番号３の塩基配列を含んでもよく、具体的に前記遺伝子は、配列番号３の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された２つの配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参照配列（追加又は削除を含まない）と比較して追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。

本願発明者らは、図１及び図２のように、ＭａｃＴプロモーター及びＲＤ２９Ｂのターミネーター（ＲＤ２９Ｂ－ｔ）がそれぞれ遺伝子のタンパク質の発現レベルを増加させるということを独立に確認した。これに、前記構成要素の組み合わせが依然として遺伝子のタンパク質の発現レベルを高めるかを確認した。前記ＭａｃＴプロモーターとＲＤ２９Ｂ－ｔをプロモーターとターミネーターとして用い、それらの間にＢｉＰ－ｓＧＦＰ－ＨＤＥＬ遺伝子（配列番号４）を挿入して発現カセットを製作した。ＢｉＰ（配列番号５）は、小胞体ターゲティングのための配列であり、ＧＦＰ（配列番号６）は、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）の塩基配列であり、ＨＤＥＬ（配列番号７）は、タンパク質を小胞体とどめるための小胞体保留塩基配列として用いた。参照コンストラクト（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、図３のように、３５Ｓ：：Ｎｏｓ－ｔ、ＭａｃＴ：：Ｎｏｓ－ｔ、３５Ｓ：：ＨＳＰ－ｔ、ＭａｃＴ：：ＨＳＰ－ｔ、３５Ｓ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔを製作した。これに、ＢｉＰ－ｓＧＦＰ－ＨＤＥＬをレポーター遺伝子にして発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を完成した。これらをＭａｃＴ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔと比較するために、シロイヌナズナのプロトプラストを用いてＧＦＰの発現を誘導して発現レベルを確認した結果、予想したように、ＭａｃＴ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔが最も高いタンパク質レベルを有することを確認した。ＭａｃＴとＲＤ２９Ｂ－ｔを新しい高発現用発現カセットのプロモーター及びターミネーターの配列と確立した。

前記「目的タンパク質」は、発現しようとする外来産物をコードする遺伝子であり、組換えタンパク質で発現可能なあらゆる種類のタンパク質をコードする遺伝子である。代表的に、インスリン、サイトカイン（インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、ケモカインなど）、エリスロポエチン、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター（例えば、チロシンキナーゼ受容体など）、レセプターの断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）、エクスプロイティブプロテイン（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ）、リポータータンパク質、成長因子、ワクチンを生産するためのウイルス遺伝子（ｖｉｒａｌｇｅｎｅｓ）、バクテリア遺伝子などがあり、このような目的タンパク質は、前記ベクターに挿入できるように制限酵素認識又は切断部位が導入されている核酸配列である「クローニング部位」を含んでもよい。

組換えタンパク質の遺伝子のＮ－とＣ－の末端にそれぞれＢｉＰのシグナルシーケンス（ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）と小胞体保留シグナル（ＥＲｒｅｔｅｎｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）であるＨＤＥＬとを含むことで、ＥＲ（小胞体）に高濃度で蓄積を誘導する効果を有することができる。前記組換えベクターは、ＢｉＰ（チャペロン結合タンパク質；ｃｈａｐｅｒｏｎｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）及びＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドからなる群より選択されるいずれか１つをさらに含んでもよく、前記ＢｉＰは配列番号５の塩基配列を含んでもよく、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）は配列番号７の塩基配列を含んでもよい。

また、前記組換えベクターに翻訳増強配列である５’－ＵＴＲをさらに含んでもよく、前記５’－ＵＴＲは配列番号６又は配列番号９の塩基配列を含んでもよい。

前記組換えは、細胞が異種核酸を複製し、前記核酸を発現し、又はペプチド、異種ペプチド又は異種核酸によってコードされたタンパク質を発現する細胞を示す。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では見出されない遺伝子又は遺伝子断片をセンス又はアンチセンス形態のいずれかとして発現してもよい。また、組換え細胞は、天然形態の細胞で見出される遺伝子を発現することができ、しかし前記遺伝子は変形されたものであり、人工的手段により細胞内に再導入されたものである。

用語「組換え発現ベクター」は、細菌性プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルス又は他のベクターを意味する。概して、任意のプラスミド及びベクターは、宿主中で複製及び安定化できる限り用いられてもよい。前記発現ベクターの重要な特性は、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子及び翻訳調節要素（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｅｌｅｍｅｎｔ）を有することである。前記組換え発現ベクター及び適当な転写／翻訳調節信号を含む発現ベクターは当業者に周知の方法によって構築することができる。上記方法は、試験管内組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術及び生体内組換え技術などを含む。

本発明の組換えベクターの好ましい例としては、適当な宿主に存在するとき、それ自体の一部、いわゆるＴ－領域を植物細胞に転移させることができるＴｉ－プラスミドベクターである。他の類型のＴｉ－プラスミドベクターは、現在、植物細胞、又は雑種ＤＮＡ植物のゲノム内に適宜挿入させる新しい植物が生産できるプロトプラストであって、雑種ＤＮＡ配列を転移させるのに利用されている。Ｔｉ－プラスミドベクターの特に好ましい形態は、ＥＰ０１２０５１６Ｂ１号及び米国特許第４，９４０，８３８号に請求されたような、いわゆるバイナリ（ｂｉｎａｒｙ）ベクターである。本発明によるＤＮＡを植物宿主に導入させるときに利用できる他の適合したベクターは、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）及び一本鎖ウイルス、ジェミニウイルス来由のウイルスベクター、例えば非完全性植物ウイルスベクターから選択できる。このようなベクターの使用は、特に植物宿主を適切に形質転換することが困難であるときに有利である。

遺伝子サイレンシング抑制因子の発現と目的タンパク質の発現を誘導する２つのバイナリーベクターを用いて目的タンパク質の高発現を誘導する。一過性発現を用いてタンパク質を発現する場合は、遺伝子サイレンシング抑制因子の共発現（ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が目的タンパク質の高発現に必須である。これによって、２つのバイナリーベクターは、それぞれがアグロバクテリウムに形質転換された後、それぞれアグロバクテリウム培養を製作し、これを、前記目的タンパク質及び遺伝子サイレンシング抑制因子をそれぞれ含むベクターを形質転換したアグロバクテリウム培養物を適当な比率で混合して共浸潤する。これには二倍の努力と二倍のコストがかかる。したがって、１つのバイナリーベクターが目的タンパク質と遺伝子サイレンシング抑制因子であるｐ３８とを同時に伝達するように発現ベクターを製作した。図４のように、手順にしたがってｔｏｂａｃｃｏｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐ３８（ｃｏＰ３８）遺伝子を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００のハイグロマイシン遺伝子を置換する方法で導入した。これによってｐＴＥＸ０を構築し、これにＭａｃＴ：：Ｍ：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬ：ＲＤ２９Ｂ－ｔを導入してｐＴＥＸ１：ＧＦＰを構築した。このとき、ＢｉＰのｉｍｍｅｄｉａｔｅｕｐｓｔｒｅａｍｒｅｇｉｏｎの５’－ＵＴＲで５’－ｇｇｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｔａａａｇａ－３’（Ｍ５’－ＵＴＲ、配列番号６）を有するようにして翻訳効率を高く誘導した。このように構築した発現ベクター用の二重伝達用バイナリーベクターを用いて発現を確認しようとした。参照コンストラクトとして、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００にＭａｃＴ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬ：ＲＤ２９Ｂ－ｔを有する発現ベクター（ｐＭＥＧＲ）を構築した。前記２つのコンストラクトを単独で又はｐ３８を有するアグロバクテリウムを混ぜて共浸潤することで、ｓＧＦＰの発現レベルを確認した（図５）。ｐＭＥＧＲの場合は、ｐ３８の共浸潤によってｓＧＦＰの発現が高く誘導されることを確認した。同様に、ｐＴＥＸ１の場合も、ｐ３８のさらなる共浸潤によって発現が高まった（図５）。これによって、ｐＴＥＸ１：ＧＦＰの場合、ｐ３８を内在的に有していても、依然として別にｐ３８を共浸潤したときにｓＧＦＰの発現が高くなることから、ｐＴＥＸ１によって発現されるｐ３８の量が十分でないと結論を下した。これは、１つのアグロバクテリウムによって導入したＴ－ＤＮＡにこの２つの遺伝子を同時に有するようになり、ｐ３８の発現量が十分でない可能性かあると推正した。したがって、ｐＴＥＸ１に含まれたｐ３８の発現を高めるコンストラクトを再構築した。ＯｒｉｇｉｎａｌＴＣＶ－ＣＰの塩基配列を含むｐＢＩＮベースのバイナリーベクター（ｐＢＩＮｂａｓｅｄｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒ）（韓国公開特許１０－２０１２－００５５８３１の３５Ｓ：ＣＰ）からＰＣＲによって３５Ｓプロモーター－Ｐ３８－３５Ｓターミネーターを確保し、ｐＴＥＸ１－ＥＭＣＣでＢｓｒＧＩとＡｃｃ６５Ｉを用いて該当フラグメントを置換した。これによって、ｐＴＥＸ１Ｎ－ＥＭＣＣを構築した。またＰ３８の発現レベルをさらに高めるために、翻訳効率（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を高める方法を採択した。これは、タンパク質の生産レベルを高める多くの方法のうちで細胞エネルギー（ｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｅｒｇｙ）の面で最も効率的であると思われる。Ｐ３８の５’－ＵＴＲに高効率の翻訳を誘導できる塩基配列である５’－ａｔｔａｔｔａｃａｔｃａａａａｃａａａａａ－３’（配列番号９）を含むＬ：Ｐ３８を導入してＰ３８発現カセットを構築した（ｐＴＥＸ１Ｌ）（図６）。これによってＰ３８の発現レベルを高めようとした。ｐＴＥＸ１、ｐＴＥＸ１Ｎ及びｐＴＥＸ１Ｌをシロイヌナズナのプロトプラストに形質転換した後、Ｐ３８の発現レベルを比較した結果、ｐＴＥＸ１が最も低い発現レベルを示し、ｐＴＥＸ１ＮはｐＴＥＸ１よりは２倍程度高く発現することが確認された。一方、ｐＴＥＸ１Ｌは、またこれらｐＴＥＸ１Ｎよりも２倍程度高い発現を示した（図６Ｄ）。最終的に、このｐＴＥＸ１ＬにＭ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬを含むコンストラクト（ｐＴＥＸ１Ｌ：ｓＧＦＰ）を構築し、これによって発現のレベルを確認した。対照群として、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターに３５Ｓプロモーター－ｓＧＦＰ－ＨＳＰターミネーターが含まれているベクターとｐＭＥＧＲを用い、同時にそれぞれＰ３８共浸潤する場合と比較した。その結果、先ずタバコでアグロ浸潤（ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による一過性発現も、シロイヌナズナのプロトプラストの形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と同様に、ＭａｃＴプロモーター－ＲＤ２９ＢのターミネーターによるｓＧＦＰの発現が、３５Ｓプロモーター－ＨＳＰターミネーターの組み合わせによる発現よりも２－３倍高いレベルと確認された（図７）。また、Ｐ３８共浸潤したｐＭＥＧＲと、Ｐ３８共浸潤していないｐＴＥＸ１Ｌ：ｓＧＦＰのｓＧＦＰの発現で大きい差がなく、ｐＴＥＸ１Ｌ：ｓＧＦＰをＰ３８と共形質転換する場合も、ｓＧＦＰの発現にほぼ差がないことを確認した。これによって、１つのバイナリーベクターが目的タンパク質及び遺伝子サイレンシング抑制因子であるｐ３８を同時に伝達できる二重伝達用発現ベクターを完成した。

前記ベクターはｐＣＡＭＢＩＡ１３００であってもよく、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００からハイグロマイシン遺伝子を除去すると共に、Ａｃｃ６５ＩとＳａｌＩ制限部位を導入してもよく、ｄｏｕｂｌｅ３５Ｓプロモーターの５’末端にＢｓｒＧＩｓｉｔｅを導入して製作してもよい（図４のｐＭ３５Ｍ）。前記ベクター（図４のｐＭ３５Ｍ）にＡｃｃ６５ＩとＳａｌＩを用いてＰ３８遺伝子を導入して製作してもよい（図４のｐＴＥＸ０）。前記ベクターに（図４のｐＴＥＸ０）にまたＭａｃＴ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔを、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩを用いて導入して製作してもよい（図４のｐＴＥＸ１）

前記組換えベクターは、遺伝子サイレンシング抑制遺伝子をさらに含んでもよく、前記遺伝子サイレンシング抑制遺伝子は、ｐ３８、Ｐ１９、ＨＣ－Ｐｒｏ及びＴＶＡ２ｂからからなる群より選択されるいずれか１つ以上であってもよく、好ましくはｐ３８をさらに含んでもよく、前記ｐ３８は配列番号９の塩基配列を含んでもよく、具体的に前記遺伝子は、配列番号９の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された２つの配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参照配列（追加又は削除を含まない）と比較して追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。

また、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することができる。

さらに、本発明のベクターを真核細胞に形質転換する場合は、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）及び植物細胞などを用いることができ、好ましくはアグロバクテリウムであってもよい。

本発明のベクターを宿主細胞内に運搬する方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２法、ハナハン法（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６：５５７－５８０（１９８３））、及び電気穿孔法などによって行うことができる。また、宿主細胞が真核細胞である場合は、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介トランスフェクション法、ＤＥＡＥ－デキストラン処理法、及び遺伝子バンバードメントなどによってベクターを宿主細胞内に注入することができる。

また、本発明は、（ａ）上述の組換えベクターを構築すること；（ｂ）前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造すること；（ｃ）前記形質転換体を培養すること；（ｄ）前記培養物を植物に浸潤させること；及び（ｅ）前記植物を粉砕して目的タンパク質を抽出すること；を含む、植物から目的タンパク質を生産する方法を提供することができる。

前記形質転換された植物から目的タンパク質を生産する方法は、本発明による組換えベクターで植物細胞を形質転換させた後、目的タンパク質が発現されるように適当な時間培養した後、形質転換された細胞から得ることができる。このとき、前記目的タンパク質を発現させる方法は当業界で公知の方法であればいずれも可能である。

本発明は、（ｄ）前記培養物を植物に浸潤させることに、本発明の炭酸無水化酵素を生産するための組換えベクター培養物に加えてＰ３８を含む組換えベクターの培養物を同時に浸潤することができる。ｐ３８は、遺伝子サイレンシング抑制因子である。他にも遺伝子サイレンシング抑制因子Ｐ１９、ＨＣ－Ｐｒｏ、ＴＶＡ２ｂなどであってもよい。

前記植物に浸潤する方法は、化学電池法、真空又はシリンジ浸潤法があり、最も好ましくはシリンジ浸潤法であってもよいが、これらに制限されるのではない。

前記植物は、稲、小麦、麦、とうもろこし、大豆、じゃがいも、小麦、小豆、オート麦、きびを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、いちご、トマト、すいか、きゅうり、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、たまねぎ、にんじんを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、ワタ、胡麻、砂糖黍、砂糖大根、えごま、ピーナッツ、菜の花を含む特用作物類；りんごの木、梨の木、なつめの木、桃、ぶどう、蜜柑、柿、スモモ、アンズ、バナナを含む果樹類；バラ、カーネーション、菊、ユリ、チューリップを含む花卉類から選択されるものであってもよい。

以上で本発明の一実施例について説明したが、本発明の思想は本明細書に提示される実施例に制限されず、本発明の思想を理解する当業者は同一の思想の範囲内で、構成要素の付加、変更、削除、追加などによって他の実施例を容易に提案することができ、これも本発明の思想範囲内に含まれると言えるであろう。

［実施例１］最適の発現レベルを有するプロモーターの確認
図１に開示されたように、発現ベクターを製造した（図１Ａ）。プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｍａｃ、又はＭａｃＴを導入した。上記３種のそれぞれのプロモーター、水溶性緑色蛍光タンパク質（ｓｏｌｕｂｌｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ｓＧＦＰ）、Ｎｏｓターミネーターを連結して発現用バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒ）を完成した。バイナリ（Ｂｉｎａｒｙ）の基本構造（ｂａｃｋｂｏｎｅ）としてはｐＣＡＭＢＩＡ１３００を用いた（図１Ａ）。上記のようにデザインされたバイナリーベクターをオーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ）によって製作した。これらそれぞれのコンストラクトを電気穿孔法でシロイヌナズナ葉の組織から得られたプロトプラストに導入して発現を誘導した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン（それぞれ５０ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレート（ＬＢｐｌａｔｅ）に２８℃で２日間培養した。１つのコロニーを選択した後、５ｍＬのカナマイシンとリファンピシンを含むＬＢメディア（ＬＢｍｅｄｉａ）で一晩培養した。２４時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、２ｍＭＤＴＴ及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ））を用いて製造し、これに５Хサンプルバッファー（ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ）（２５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロールｖ／ｖ、及び５００ｍＭＤＴＴ）を最終１Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプル（ｓａｍｐｌｅ）を製作した。タンパク質抽出物サンプルを５分間沸かしてから、１０％ＳＤＳ－ページによって分離した後、抗ＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。これによって、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｍａｃ、又はＭａｃの各プロモーターの発現レベルを比較分析した。これによって、ＭａｃＴプロモーターがＣａＭＶ３５Ｓよりは遥かに高く、Ｍａｃプロモーターより少なくとも５０％高いプロモーター強度（ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｔｒｅｎｇｔｈ）を示した（図１）。

［実施例２］最適の発現レベルを有するターミネーターの確認
図２の図式で見られるような発現コンストラクトを製作した。プロモーターはＣａＭＶ３５Ｓと固定し、ターミネーターとしては、効率の高いと知られたＨＳＰターミネーター、シロイヌナズナのＡｔＥｘｔ４遺伝子のターミネーター又はＲＤ２９Ｂのターミネーターを製作した。それらの間にＥＲに発現を誘導して高いレベルで蓄積されるように、ＥＲ目的信号（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｉｇｎａｌ）であるＢｉＰ、水溶性ＧＦＰ及びＥＲ保留シグナル（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）であるＨＤＥＬを含むＢｉＰ－ｓＧＦＰ－ＨＤＥＬ遺伝子を挿入して発現カセットを製作した。上記のようにデザインされたバイナリーベクターをオーバーラッピングＰＣＲによって製作した。これらそれぞれのコンストラクトを電気穿孔法でシロイヌナズナ葉の組織から得られたプロトプラストに導入して発現を誘導した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン（それぞれ５０ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートに２８℃で２日間培養した。１つのコロニーを選択した後、５ｍＬのカナマイシンとリファンピシンを含むＬＢメディアで一晩培養した。２４時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、２ｍＭＤＴＴ及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて製造し、これに５Хサンプルバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロールｖ／ｖ、及び５００ｍＭＤＴＴ）を最終１Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプルを５分間沸かしてから、１０％ＳＤＳ－ページによって分離した後、抗ＧＦＰ抗体でウェスタンブロット分析を行った。その後、前記メンブレンをクーマシーブルーで染色した。これによって、ＲＤ２９Ｂのターミネーターが、前記３つの種類のターミネーターのうち最も発現レベルが高いことを確認した（図２）。

［実施例３］
図３に見られるように様々な組み合わせのプロモーター及びターミネーターを発現コンストラクト（３５Ｓ：：Ｎｏｓ－ｔ、ＭａｃＴ：：Ｎｏｓ－ｔ、３５Ｓ：：ＨＳＰ－ｔ、ＭａｃＴ：：ＨＳＰ－ｔ、３５Ｓ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔ、ＭａｃＴ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔ）を製作した。それらの間にＢｉＰ－ｓＧＦＰ－ＨＤＥＬ遺伝子（配列番号４）を挿入して発現カセットを製作した。それらの間にＥＲに発現を誘導して高いレベルで蓄積されるようにＥＲ目的信号であるＢｉＰ、ｓＧＦＰ及びＥＲ保留シグナルであるＨＤＥＬを含むＢｉＰ－ｓＧＦＰ－ＨＤＥＬ遺伝子を挿入して発現カセットを製作した。上記のようにデザインされたバイナリーベクターをオーバーラッピングＰＣＲによって製作した。これらそれぞれのコンストラクトを電気穿孔法でシロイヌナズナ葉の組織から得られたプロトプラストに導入して発現を誘導した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン（それぞれ５０ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートに２８℃で２日間培養した。１つのコロニーを選択した後、５ｍＬのカナマイシンとリファンピシンを含むＬＢメディアで一晩培養した。２４時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、２ｍＭＤＴＴ及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて製造し、これに５Хサンプルバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロールｖ／ｖ、及び５００ｍＭＤＴＴ）を最終１Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプルを５分間沸かしてから、１０％ＳＤＳ－ページによって分離した後、抗ＧＦＰ抗体でウェスタンブロット分析を行ってｓＧＦＰのレベルを確認した。その結果、これらの６つのコンストラクトのうちＭａｃＴとＲＤ２９Ｂ－ｔをプロモーターと結晶部位として有する場合にｓＧＦＰの発現が最も高いことが確認された（図３）。これによって、ＭａｃＴプロモーターとＲＤ２９Ｂ－ｔターミネーターを有する発現カセットが目的遺伝子のタンパク質の発現を増加させるということを確認した。

［実施例４］ｐＣＡＭＢＩＡ１３００からｐＴＥＸ１：ＧＦＰの構築過程
１つのバイナリーベクターが目的タンパク質と遺伝子サイレンシング抑制因子であるｐ３８を同時に伝達するように発現ベクターを製作した。図４のように、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００からハイグロマイシン遺伝子を除去すると共に、Ａｃｃ６５ＩとＳａｌＩ制限部位を導入し、ｄｏｕｂｌｅ３５Ｓプロモーターの５’末端にＢｓｒＧＩｓｉｔｅを導入してｐＭ３５Ｍを製作し、前記ｐＭ３５ＭにＡｃｃ６５ＩとＳａｌＩを用いて、ｔｏｂａｃｃｏｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐ３８（ｃｏＰ３８）遺伝子を導入してｐＴＥＸ０を製造し、ｐＴＥＸ０にまたＭａｃＴ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬ：：ＲＤ２９Ｂ－ｔをＰｓｔＩとＥｃｏＲＩを用いて導入してｐＴＥＸ１：ＧＦＰを構築した。このとき、ＢｉＰのｉｍｍｅｄｉａｔｅｕｐｓｔｒｅａｍｒｅｇｉｏｎの５’－ＵＴＲで５’－ｇｇｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｔａａａｇａ－３’（Ｍ５’－ＵＴＲ、配列番号６）を有するようにして翻訳効率を高く誘導した。

［実施例５］ｐＭＥＧＲのベクターマップ（ｖｅｃｔｏｒｍａｐ）と、これを用いた発現レベルの比較
上記実施例４に構築した発現ベクター用の二重伝達用バイナリーベクター（ｐＴＥＸ１：ＧＦＰ）を用いて発現を確認しようとした。参照コンストラクトとしてｐＣＡＭＢＩＡ１３００にＭａｃＴ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬ：ＲＤ２９Ｂ－ｔを有する発現ベクター（ｐＭＥＧＲ）を構築した。前記２種の発現ベクター（ｐＴＥＸ１：ＧＦＰ又はｐＭＥＧＲ）のそれぞれをアグロバクテリウムに導入して培養した。ｍＬのアグロバクテリウム培養液をカナマイシン及びリファンピシン（５０ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌ）を含む５０ｍｌＬＢ培養液に添加した。１６時間培養した後、アクロバクテリウムを８分間２８℃で４０００ｘｇの条件で遠心分離して回収した。上澄み液は捨て、アクロバクテリウムの沈殿物は浸潤バッファー（１０ｍＭＭＥＳ、１０ｍＭＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；ｐＨ５．７）に溶解した。細胞の濃度は浸潤バッファーを用いてＯＤ６００で０．８になるようにした。その後、４００μＭアセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）をアグロバクテリウム溶液に添加し、室温に２時間置いた。アグロバクテリウム－媒介浸潤のために、野生種のＮ．ベンサミアナを栽培した。植物は、種子を用いて２４℃、４０－６５％相対湿度、長日条件（１４ｈ光／１０ｈ暗状態）で光強度が１３０－１５０μＥｍ－２ｓｅｃ－１の条件で栽培した。６株間育てた植物をアグロバクテリウム－媒介浸潤に用いた。シリンジを用いた浸潤は、注射針のない１ｍＬサイズのシリンジを用いた。同時に遺伝子サイレンシング抑制（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）遺伝子であるカブクリンクルウイルス（ｔｕｒｎｉｐｃｒｉｎｋｌｅｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質（ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子であるＰ３８が入っているバイナリベクター（ｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒ）を同時－浸潤した。このために２種の発現ベクター（ｐＴＥＸ１：ｓＧＦＰ又はｐＭＥＧＲ）とＰ３８をそれぞれのアグロバクテリウムに導入した後、適切な濃度のアグロバクテリウム培養液を１：１の比率で混ぜてＮ．ベンサミアナ葉に浸潤した。浸潤後３日目に総タンパク質抽出物をＮ．ベンサミアナ葉の組織から確保してウエスタンブロット分析を行って発現レベルを確認した。総タンパク質抽出物は、抽出用バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、２ｍＭＤＴＴ及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて製造し、これに５Хサンプルバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロールｖ／ｖ、及び５００ｍＭＤＴＴ）を最終１Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプル（５０μｇ）を５分間沸かしてから、１２．５％ＳＤＳ－ページによって展開した後、クーマシーブルーで染色した。また抗ＧＦＰ抗体でウェスタンブロット分析を行ってｓＧＦＰのレベルを確認した。その結果、前記発現ベクター（ｐＭＥＧＲとｐＴＥＸ１：ｓＧＦＰ）はいずれも、Ｐ３８を別に共浸潤しなくてもｓＧＦＰの発現を誘導した。しかし、Ｐ３８をさらに共浸潤すると、さらに高いｓＧＦＰの発現を示した。また２つの発現ベクターはほぼ同じレベルのｓＧＦＰの発現を示した。これによって、Ｐ３８を自体で有しているが、十分に高いレベルの遺伝子サイレンシング抑制因子のためには、Ｐ３８がさらに必要であることが確認された。したがって、ｐＴＥＸ１に含まれたｐ３８の発現を高めるコンストラクトを再構築した。

［実施例６］ｐＴＥＸ１、ｐＴＥＸ１ＮとｐＴＥＸ１Ｌの発現ベクターマップ
ｐＴＥＸ１が有しているＰ３８の発現が十分な遺伝子サイレンシング抑制因子を与えていないため、Ｐ３８の発現レベルを高めるコンストラクトを構築しようとした。ＯｒｉｇｉｎａｌＴＣＶ－ＣＰの塩基配列を含むｐＢＩＮベースのバイナリーベクターから、ＰＣＲによって３５Ｓプロモーター－Ｐ３８－３５Ｓターミネーターを確保し、ｐＴＥＸ１－ＥＭＣＣでＢｓｒＧＩとＡｃｃ６５Ｉを用いて該当ｆｒａｇｍｅｎｔを置換してｐＴＥＸ１Ｎを構築した。Ｐ３８の５’－ＵＴＲに高効率の翻訳を誘導できる塩基配列である５’－ａｔｔａｔｔａｃａｔｃａａａａｃａａａａａ－３’（配列番号９）を含むＬ：Ｐ３８を導入してｐＴＥＸ１Ｌを構築した。ｐＴＥＸ１、ｐＴＥＸ１Ｎ及びｐＴＥＸ１Ｌを用いてシロイヌナズナのプロトプラストに形質転換して発現を確認した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン（それぞれ５０ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートに２８℃で２日間培養した。１つのコロニーを選択した後、５ｍＬのカナマイシンとリファンピシンを含むＬＢメディアで一晩培養した。２４時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、２ｍＭＤＴＴ及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて製造し、これに５Хサンプルバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロールｖ／ｖ、及び５００ｍＭＤＴＴ）を最終１Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプルを５分間沸かしてから、１０％ＳＤＳ－ページによって分離した後、抗ＴＣＰ－ＣＰ（Ｐ３８）抗体でウェスタンブロット分析を行った。また、メンブレンをクーマシーブルーで染色した。ｐＴＥＸ１、ｐＴＥＸ１Ｎ及びｐＴＥＸ１Ｌをシロイヌナズナのプロトプラストに形質転換した後、Ｐ３８の発現レベルを比較した結果、ｐＴＥＸ１が最も低い発現レベルを示し、ｐＴＥＸ１ＮはｐＴＥＸ１よりは２倍程度高く発現することが確認された。一方、ｐＴＥＸ１ＬはまたこれらｐＴＥＸ１Ｎよりも２倍程度高い発現を示した（図６Ｄ）。これによって、ｐＴＥＸ１Ｌの翻訳エンハンサー（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｅｎｈａｎｃｅｒ）を有する発現ベクターのＰ３８発現レベルが最も高いことが確認された。

［実施例７］
ｐＴＥＸ１ＬにＭ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬを含むコンストラクト（ｐＴＥＸ１Ｌ：ｓＧＦＰ）を構築し、これによって発現のレベルを確認した。ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターに３５Ｓプロモーター－ｓＧＦＰ－ＨＳＰターミネーターが入っているベクター、ｐＭＥＧＲベクターとｐＴＥＸ１Ｌベクターを運搬するアグロバクテリウムをタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉にシリンジで単独浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、同時にｐ３８と共浸潤させた後５日目、タバコ葉からタンパク質を抽出してＧＦＰ抗体とＴＣＶＣＰ抗体を用いてウエスタンブロット方法でＢｉＰ－ｓＧＦＰ－ＨＤＥＬとＰ３８タンパク質の発現を確認した（図７Ｂ）。その結果、先ず、タバコでアグロ浸潤による一過性発現もシロイヌナズナのプロトプラスト形質転換と同様に、ＭａｃＴプロモーター－ＲＤ２９ＢターミネーターによるｓＧＦＰの発現が、３５Ｓプロモーター－ＨＳＰターミネーターの組み合わせによる発現より２－３倍高レベルと確認された（図７）。また、Ｐ３８と共浸潤したｐＭＥＧＲとＰ３８と共浸潤しないｐＴＥＸ１Ｌ：ｓＧＦＰのｓＧＦＰの発現で大きな差がなく、ｐＴＥＸ１Ｌ：ｓＧＦＰをＰ３８と共形質転換する場合も、ｓＧＦＰの発現にほぼ差がないことを確認した。これによって、１つのバイナリーベクターが目的タンパク質及び遺伝子サイレンシング抑制因子であるｐ３８を同時に伝達できる二重伝達用発現ベクターを完成した。

［実施例８］
ｐＴＥＸ１Ｌに、Ｍ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬでｓＧＦＰの代わりにｔａｒｇｅｔ遺伝子としてヒトフリン（ｈｕｍａｎＦｕｒｉｎ）遺伝子を置換し、ｐＴＥＸ１ＬにＭ：：ＢｉＰ：ｈＦｕｒｉｎ：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬコンストラクトを導入したコンストラクトを構築し、これをアグロバクテリウムに導入した後、Ｎ．ベンサミアナに発現を誘導してＦｕｒｉｎ：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬを高レベルで生産した。

［実施例９］
ｐＴＥＸ１Ｌに、Ｍ：：ＢｉＰ：ｓＧＦＰ：ＨＤＥＬでｓＧＦＰの代わりにｔａｒｇｅｔ遺伝子としてＴｒｙｏｓｉｎｏｇｅｎ遺伝子を置換し、ｐＴＥＸ１ＬにＭ：：ＢｉＰ：Ｔｒｙｓｉｎｏｇｅｎ：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬコンストラクトを導入したコンストラクトを構築し、これをアグロバクテリウムに導入した後、Ｎ．ベンサミアナに発現を誘導してＴｒｙｓｉｎｏｇｅｎ：Ｈｉｓｘ５：ＨＤＥＬを高レベルで生産した。

Claims

（ｉ）Ｍａｃプロモーター；
（ｉｉ）目的タンパク質をコードする遺伝子；
（ｉｉｉ）ＲＤ２９Ｂ－ｔターミネーター；
を含む、植物から目的タンパク質を大量生産するための組換えベクター。
前記Ｍａｃプロモーターの遺伝子配列は、配列番号１の塩基配列を含む、請求項１に記載の組換えベクター。
前記Ｍａｃプロモーターは、Ｍａｃプロモーターの３’末端塩基であるＡをＴに置換したＭａｃＴプロモーターである、請求項１に記載の組換えベクター。
前記ＭａｃＴプロモーターは、配列番号２の塩基配列を含む、請求項３に記載の組換えベクター。
前記ＲＤ２９Ｂ－ｔターミネーターは、配列番号３の塩基配列を含む、請求項１に記載の組換えベクター。
前記目的タンパク質は、水溶性緑色蛍光タンパク質、抗原、抗体、抗体断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、レセプターの断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質、エクスプロイティブタンパク質、成長因子及びリポータータンパク質からからなる群より選択されるいずれか１つ以上のタンパク質である、請求項１に記載の組換えベクター。
前記ベクターは、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００である、請求項１に記載の組換えベクター。
前記組換えベクターは、遺伝子サイレンシング抑制遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の組換えベクター。
前記遺伝子サイレンシング抑制遺伝子は、ｐ３８、Ｐ１９、ＨＣ－Ｐｒｏ及びＴＶＡ２ｂからからなる群より選択されるいずれか１つ以上のタンパク質である、請求項８に記載の組換えベクター。
請求項１に記載の組換えベクターで形質転換された、形質転換体。
前記形質転換体は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である、請求項１０に記載の形質転換体。
（ａ）請求項１による組換えベクターを構築すること；
（ｂ）前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造すること；
（ｃ）前記形質転換体を培養すること；
（ｄ）前記培養物を植物に浸潤させること；及び
（ｅ）前記植物を粉砕して目的タンパク質を抽出すること；
を含む、植物から目的タンパク質を生産する方法。
前記（ｄ）工程に、ｐ３８を含む組換えベクターを細胞に導入した形質転換体をさらに植物に浸潤させることを含む、請求項１２に記載の方法。