CN117402880A - 一种光诱导型启动子、调控植物光敏感性的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光诱导型启动子、调控植物光敏感性的方法及应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公开了这个启动子的核苷酸序列，该诱导型启动子构建的重组表达载体进行遗传转化后，转基因植物中目的基因在高光诱导后表达量大幅上调。因此，本发明的高光诱导型启动子ELIP1 PRO 在应用基因工程技术调控植物的高光敏感性进行抗高光育种中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种光诱导型启动子、调控植物光敏感性的方法及应用。
背景技术
植物生长和发育过程中受到环境因素的影响较大。其中，光是植物生长和发育的重要环境因素之一，因此在植物研究中，光周期调控是非常关键的一部分。植物对于不同波长和强度的光具有不同的反应，可以导致不同的生长和发育变化。高光会引起植物叶绿体中活性氧的爆发，造成胞内氧化胁迫的产生，损伤叶绿体DNA、导致转录及翻译紊乱、进而破坏类囊体膜结构、光系统核心蛋白降解，严重抑制光合作用(Nishiyamaet al., 2011；Takahashiet al., 2011; Andersonet al., 2021.)。因此，如何保护植物的光系统，使其能在高光逆境下高效运行光合作用是一个亟待解决的问题。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种常用的模式植物，广泛应用于植物遗传学和分子生物学等领域。在拟南芥中，有一类称为高光响应基因的基因，它们可以被强光所诱导。这些基因编码的蛋白具有不同的功能，包括抗氧化、光保护、色素合成等(Casazzaet al., 2005；Heddadet al., 2006.)。因此，高光响应基因是控制拟南芥光形态建成和光能利用的重要调节因子。
启动子是基因的重要组成部分，是调控基因表达的重要元件，其主要功能为调控基因表达(转录)的起始时间和表达程度。启动子一般结构包括核心启动子元件和上游调控元件。多数启动子位于基因转录起始点的上游，其本身不被转录。植物基因的启动子区域还包含多种重要的顺式作用元件以实现对下游基因进行特异性调控，使得基因有序表达，进而满足植物正常生长发育的需求，并帮助植物体抵御外界逆境胁迫。随着分子生物学和遗传转化技术不断发展，具有不同特性的启动子相应成为研究热点。目前，已经有许多启动子被发现，并应用于基因工程、农业等领域。其中一些可以对外界某些刺激做出响应，例如高温或低温、盐、干旱等等(Chtarto 基因表达就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子。et al., 2003; Parket al., 2013; Trassaertet al., 2017.)。在植物基因工程中，启动子的选择非常重要，高效的启动子可以提高目标基因在转基因植物中的表达水平，从而实现相应的功能性改造。目前可供选择的植物启动子繁多，但很少有用于植物高光响应的启动子(Meryet al., 2007; Parket al., 2013;Trassaertet al., 2017.)。因此，研究拟南芥高光响应基因的启动子，对于探究植物对光的响应机制、提高植物的光能利用效率等具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种光诱导型启动子、调控植物光敏感性的方法及应用。本发明提供了高光诱导型启动子ELIP1 PRO 的核苷酸序列SEQ ID NO.1，通过调节该启动子诱导目的基因表达，可以改变植物对光的敏感性，这对于探究植物对光的响应机制、提高植物的光能利用效率、保护植物的光系统，实现作物在逆境条件下光合功能的高效运行具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种光诱导型启动子，所述的光诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供所述的光诱导型启动子在如下i)~ii)任一项中的应用：
i)植物的光敏感性调控；
ii) 植物遗传转化和/或育种。
本发明的第三方面，提供一种调控植物光敏感性的方法，包括以下步骤：
构建包含所述的光诱导型启动子和目的基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转入农杆菌，再侵染植物的外植体，得到高光诱导后目的基因表达量大幅上调的植物转基因株系。
进一步的，光诱导型启动子扩增时，所用引物对核苷酸序列为SEQ ID NO.2和SEQID NO.3。
进一步的，所述植物为水稻。
本发明的有益效果：
本发明利用ELIP1 PRO 进行高光诱导型的基因表达研究，深入地探究目的基因参与植物生长发育和环境适应的相关机制。ELIP1 PRO 在植物对高光的响应中起到了重要的作用，它的发现对于应用基因工程技术调控植物的高光敏感性进行抗高光育种具有重要作用。使用该启动子进行育种，有利于提高目的植物对逆境胁迫的响应，对于抗高光植物新品种的繁育具有重要作用。
附图说明
图1为部分拟南芥高光响应基因在高光(1200μmol photons m-2s-1)处理前后表达量变化，图1中(a)为ELIP2基因表达量，图1中(b)为APX2基因表达量，图1中(c)为ELIP1基因表达量，图1中(d)为SEP1基因表达量。
图2为含ELIP1启动子的pYLTAC380H表达载体转化大肠杆菌的菌液PCR检测结果图，M为Marker对照。
图3为转基因阳性苗的鉴定结果图，其中，泳道1-泳道23是转化成功的阳性苗，泳道24为野生型阴性对照，M为Marker对照。
图4为本发明公开的启动子启动的转基因阳性苗中目的基因(VTE2基因)在高光(1200μmol photons m-2s-1)处理前后表达量变化。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：高光诱导型启动子的筛选和克隆
(1)拟南芥高光响应基因的筛选及验证
本申请所用实验材料为生长三周拟南芥(Col-0)，取生长状态良好、同一时期的高光(1200μmol photons m-2s-1)处理前后的叶片样品分别提取RNA。
本实验使用的RNA抽提法为Trizol一步法，具体步骤如下：
①在DEPC处理后的1.5mL离心管中加入2枚180℃高温处理后的小钢珠，取50mg-100mg拟南芥叶片组织，液氮冷冻后，磨样器快速粉碎。
②加入1ml Trizol室温放置5min，轻轻摇动，使细胞完全溶解。
③加入200μL氯仿，颠倒混匀15s -30s,室温放置10min -15min。在4℃、12000g条件下离心15min -20min。
④将水相部分转移至预先经DEPC处理的新离心管中，加入0.5ml异丙醇，充分震荡混匀，-20℃放置10min。
⑤在4℃、12000g条件下离心15min -20min。凝胶样沉淀物即为RNA。
⑥弃上清液，加入500μL无水乙醇去除DNA。
⑦用500μL的75％v/v乙醇(使用DEPC处理的水配置)洗涤，震荡混匀，在4℃、12000g条件下离心5min。
⑧弃去上清液，瞬时离心，吸干离心管中液体，室温放置5min-10min直至晾干。
⑨加入50μL DEPC处理的ddH2O，保存于-80℃冰箱。
选用全式金生物技术股份有限公司提供的反转录试剂盒TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，于-80℃保存。由RNA反转录来的cDNA为双链稳定的结构，是一段没有内含子而只有外显子的序列。cDNA文库特异地反映了某种组织或细胞中在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。
根据拟南芥参考基因组中基因序列设计qRT-PCR引物并将序列BLAST-Search网站上做对比，，确定引物的特异性，将设计引物序列的GC含量控制在40％-60％。以高光处理前后的8个叶片样品的cDNA分别为模板，对筛选出的基因以及Actin内参基因进行后续qRT-PCR。选用全式金生物技术股份有限公司提供的PerfectStart® Green qPCR SuperMix实时荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR。qPCR反应体系见表1，引物序列如下所示：
qRT-ELIP2-F：5’-GCGATCCTATCAAGGAAGATCC-3’(SEQ ID NO.2)；
qRT-ELIP2-R：5’-ACTCACCTTAGGCTTGCTAAC-3’(SEQ ID NO.3)；
qRT-ELIP 1-F：5’-ATTATCCGGTGGGAGTGAGA -3’(SEQ ID NO.4)；
qRT-ELIP 1-R：5’-TTCATAGGAGGAGGAGGAGATG-3’(SEQ ID NO.5)；
qRT-SEP1-F：5’-GCTTCTGGTTCTCCTCTCTTG-3’(SEQ ID NO.6)；
qRT-SEP1-R：5’-CCACTGCTTCCTTCTGTACTT-3’(SEQ ID NO.7)；
qRT-APX2-F：5’-GGAAGCTCCGTGGTCTTATT-3’(SEQ ID NO.8)；
qRT-APX2-R：5’-CTCCTGTCTTCGTCTTCACATC-3’(SEQ ID NO.9)；
qRT-Actin2-F：5’-GACCTTTAACTCTCCCGCTATG-3’(SEQ ID NO.10)；
qRT- Actin2-R：5’-GAGACACACCATCACCAGAAT -3’(SEQ ID NO.11)；
表1 qPCR反应体系
扩增程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃延伸30s，45个循环。
通过qRT-PCR定量相对表达量计算，即可确定拟南芥高光响应基因高光处理前后的表达模式。
结果如图1所示，可见本发明筛选出的部分候选基因高光处理前后表达量的变化，其中ELIP1基因表达量上调幅度最大，选为目的基因。
(2)ELIP1目的基因启动子的克隆
引物设计：首先在CDS数据库里找到目的基因编码区上游一段紧挨ATG(起始密码子)的20bp左右长度序列作为启动子下游引物，从下游引物最左端开始，选择2kb左右长度的序列作为启动子片段，再在启动子片段左端选择一段20bp左右长度的序列作为启动子上游引物，其引物序列如下所示：
ELIP1-Pro-F：5’-AAGTTACCGGAAACAGTGTCG-3’(SEQ ID NO.12)；
ELIP1-Pro-R：5’-TTCTAAAGCTTAGAACTACTAGTGTGAG-3’(SEQ ID NO.13)。
DNA提取：使用的DNA抽提法为SDS法，具体步骤如下：
①取50mg～100mg拟南芥叶片组织于1.5mL离心管中。
②用磨样器将样品磨碎。
③加入400μL SDS提取buffer，上下震荡混匀。
④室温，13000g，离心3min。
⑤吸取上层溶液250μL移入新的1.5mL离心管中，并加入250μL异丙醇，上下颠倒混匀。
⑥室温，13000g，离心5min。
⑦倒掉上清，加入200μL 70%v/v乙醇。
⑧将沉淀轻轻弹起后，室温，13000g，离心2min。
⑨倒掉上清，倒扣到卫生纸上直至干燥。
⑩加入适量ddH2O回溶，13000g，离心2min，-20℃保存备用。
以拟南芥叶片组织的gDNA为模板，进行25μL体系的高保真酶PCR扩增，高保真酶为诺唯赞生物科技股份有限公司提供的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，扩增体系如下：
表2 PCR反应体系
扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s；58℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸5min。
通过琼脂糖凝胶电泳，将符合要求的扩增产物送测序，将测序结果导入BLAST-Search网站上进行比对进行验证，获得ELIP1目的基因启动子。具体的，ELIP1的启动子ELIP1 PRO 的片段长度为2085bp，序列如SEQ ID NO.1所示（请见本申请核苷酸序列表）。
实施例2：构建重组表达载体和重组菌
本实施例以实验室前期构建的包含ELIP1启动子片段、拟南芥维生素E合成相关基因（VTE2基因)、Tnos终止子片段载体为例。
本实施例构建了包含实施例1所得启动子的重组表达载体和重组菌。用2×ClonExpress Mix，50℃反应5-15 min，进行重组。重组产物直接转化感受态细胞。
将实施例1扩增出的启动子片段，设计带接头的上游/下游引物，其序列具体为：
PELIP1--CE-F：
5’-gcatgcggccgctagggcgcgccAAGTTACCGGAAACAGTGTCGC-3’ (SEQ ID NO.14);
PELIP1--CE-R：
5’-gccgctagctcgagaggcgcgccTTCTAAAGCTTAGAACTACTA-3’ (SEQ ID NO.15)。
采用上述引物，同样以拟南芥叶片组织的gDNA为模板进行50μL体系的高保真酶PCR扩增，通过PCR扩增，使插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15bp -20bp)，除所用引物外，扩增体系及扩增程序与实施例1一致。
通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在紫外灯下切下目的条带，用诺唯赞生物科技股份有限公司提供的FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行胶回收得到目的片段(步骤见试剂盒说明书)，保存在-20℃冰箱。
利用无缝克隆技术，用诺唯赞生物科技股份有限公司提供的ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit一步法克隆试剂盒将上述启动子片段、基因片段(拟南芥VTE2基因：NC_003071.7)及终止子片段同时重组到表达载体上。
反应体系如下：
表3重组反应体系
反应程序为：50℃，15min；降至4℃或立即置于冰上冷却。待反应结束后，进行大肠杆菌转化，具体步骤如下：
冰上融化一管50μL DH5α感受态细胞，加入10μL重组反应液至感受态中，轻弹管壁数下，随即置于冰上，静置30min。
42℃水浴中热激60s后立即缓慢置于冰上静置2min。
加入950μL的LB液体培养基，37℃,200r/min摇床培养1h。
5000r/min离心2min，弃上清，重悬剩余菌体涂布于含有25μg/ml卡那霉素LB固体培养基，平板吹干，37℃倒置培养12h～16h。
挑取8个～16个大小正常的菌斑，在含有25μg/ml卡那霉素LB液体培养基中，37℃,200r/min振荡培养12h～16h。
菌液PCR阳性检测，即以37℃培养的菌液作为PCR检测的模板，利用目的基因特异性引物(即SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.5所示的引物对)进行PCR检测。
图2为含ELIP1启动子的pYLTAC380H表达载体转化大肠杆菌的菌液PCR检测结果图。其中，琼脂糖凝胶电泳检测出现正确的条带位置(在2000bp左右)即视为转化成功，泳道2-泳道9，泳道11，泳道15，泳道21-泳道24为转化成功的包含重组表达载体的重组菌。
实施例3：重组表达载体转化水稻、目的基因的表达
(1)采用电击转化法将按照实施例2方法构建的载体转入农杆菌感受态细胞EHA105，步骤如下：
冰上融化一管50μL EHA105感受态，加入5μL重组质粒至感受态中，吹打混匀，随即置于冰上，静置5min。液氮速冻5min。37℃水浴中热激5min后立即缓慢置于冰上静置5min。30℃，200r/min孵育3h。5000 r/min离心5 min，弃上清，重悬剩余菌体后涂布于含有25μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEB固体培养基，待平板吹干，置于30℃恒温培养箱中倒置培养36h～48h。挑取10个～20个大小适宜的菌斑，在含有25μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEB液体培养基中，30℃，200r/min振荡培养12h～16h。菌液PCR检测同实施例2中的大肠杆菌，保存阳性菌液(50％甘油：菌液＝1:1)于-80℃冰箱。
(2)农杆菌介导的水稻遗传转化：
农杆菌体内有Ti质粒，由于植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质能吸引根癌农杆菌向受伤组织集中，把自己Ti质粒上的T-DNA转移并整合到植物的DNA上去，从而完成了植物侵染过程。
本实施例使用的是原始野生型材料为“中花11”粳稻品种。水稻遗传转化后的阳性苗由伯远生物科技有限公司提供。
(3)转基因苗的阳性鉴定：
取T0代水稻转基因植株的叶片组织，通过SDS法提取DNA(提取方法参照实施例1)，并以该DNA为模板。pYLTAC380H表达载体带有潮霉素筛选标签，用hyg501-J-F和hyg501-J-R引物组合进行PCR扩增，所用引物组合序列如下：
hyg501-J-F：5’-GAGCATATACGCCCGGAGTC-3’(SEQ ID NO.16)
hyg501-J-R：5’-CAAGACCCTGCCTGAAACCGA-3’，(SEQ ID NO.17)
转基因阳性苗的鉴定结果如图3所示，琼脂糖凝胶电泳检测出现正确的条带位置(在500bp左右)即视为DNA水平验证成功，泳道1-泳道23是转化成功的阳性苗，泳道24为野生型阴性对照。
为了检测水稻阳性苗中转入的拟南芥VTE2基因的表达量是否受到高光诱导。以鉴定成功的水稻阳性苗为实验材料，取生长状态良好、同一时期的高光处理（1200μmolphotons m-2s-1）后0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时的叶片样品分别提取RNA，使用的RNA抽提法为Trizol一步法，(提取方法参考实施例1)，然后选用全式金生物技术股份有限公司提供的反转录试剂盒TransScript® One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒(步骤见说明书)将RNA反转录成cDNA，保存于-80℃。
根据参考基因组中基因序列设计目的基因qRT-PCR引物并将序列BLAST-Search网站上做对比，确定引物的特异性。以高光处理前后的叶片样品的cDNA分别为模板对目的基因以及Actin内参基因进行后续qRT-PCR。选用全式金生物技术股份有限公司提供的PerfectStart® Green qPCR SuperMix实时荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR(步骤参考实施例1)。通过qRT-PCR定量相对表达量计算，即可确定转化成功的外源基因高光处理前后的表达模式。引物序列如下所示：
qRT-VTE2-F：5’- TTGGAGCCACATCTCCATTC -3’(SEQ ID NO.18)
qRT-VTE2-R：5’- GCTACTCAGATCAACGGACTTAG -3’（SEQ ID NO.19)
结果如图4所示，即本发明公开的启动子启动的转基因阳性苗中目的基因在高光处理前后表达量变化。高光处理（1200μmol photons m-2s-1）后1小时-8小时，水稻叶片中转入拟南芥VTE2基因的表达量随着高光处理时间的增长不断增加，表明转基因植物中目的基因表达量在高光诱导后显著上调，说明ELIP1 PRO 是可用的高光诱导型启动子。
综上所述，本发明开发的来自于拟南芥的ELIP1启动子ELIP1 PRO 能够调控目的基因在高光诱导后表达量大幅上调，其在植物抗高光品种培育、提高植物的光能利用效率等领域具有巨大的应用潜力。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种光诱导型启动子，其特征在于，所述的光诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述的光诱导型启动子在如下i)~ii)任一项中的应用：
i)植物的光敏感性调控；
ii) 植物遗传转化和/或育种。
3.一种调控植物光敏感性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建包含权利要求1所述的光诱导型启动子和目的基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转入农杆菌，再侵染植物的外植体，得到高光诱导后目的基因表达量大幅上调的植物转基因株系。
4.根据权利要求3所述的调控植物光敏感性的方法，其特征在于，光诱导型启动子扩增时，所用引物对核苷酸序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
5.根据权利要求4所述的调控植物光敏感性的方法，其特征在于，所述植物为水稻。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002176983A (ja) * | 2000-12-13 | 2002-06-25 | Inst Of Physical & Chemical Res | 刺激誘導性プロモーター |
| CN110317827A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-10-11 | 中国科学院新疆生态与地理研究所 | 齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANA M. RUS ALVAREZ-CANTERBURY ET AL.: "A double SORLIP1 element is required for high light induction of ELIP genes in Arabidopsis thaliana", PLANT MOL BIOL, vol. 84, 27 September 2013 (2013-09-27), pages 260 - 262 * |
| 李燕等: "细胞与分子生物学常用实验技术", vol. 1, 31 July 2009, 第四军医大学出版社, pages: 200 - 203 * |
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