CN108165552B - 一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro及其应用 - Google Patents

一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1‑pro及其应用，该启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样具有启动功能的DNA分子。本发明的干旱诱导型启动子PvHVA1‑pro可以启动干旱调控相关目的基因的表达，可以培育抗干旱的植物品种，可以应用于植物遗传改良，对干旱调控研究也具有重要的意义。

Description

一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro及其应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro及其应用。
背景技术
启动子是能够调控其自身基因表达的一段DNA序列，通过被转录因子和RNA聚合酶识别，起始由RNA聚合酶催化的基因转录。启动子能够控制基因的表达水平、表达部位及表达方式。启动子主要分为组成型启动子，组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子、激动蛋白启动子和玉米泛素启动子等，这类启动子在植物体内持续、高效表达时，会对植物生长发育造成不利影响。
诱导表达或组织特异性启动子可启动基因在特定环境下或植物组织的特定部位表达，避免外源基因的不必要表达，从而节约植物体的整体能量消耗。诱导型启动子在植物的正常适宜生长条件下启动活性很低甚至不启动下游转录，但受到外界胁迫时，又可高效地启动转录。因此，诱导型启动子对植物更好地适应自然环境并保持正常生长至关重要。其中，干旱诱导型启动子是指在水分缺乏时，可以诱导干旱相关基因在短时间内得到大量表达，从而去适应环境中出现的缺水状况的启动子。因此，启动子作为转录水平上重要的调控元件，在基因工程领域开发和利用高效特异的启动子具有重要的应用价值。
我国水资源时空分布不平衡，提高植物耐旱性和水分利用效率对于作物育种具有重要意义。虽然许多基因能够有助于植物的耐旱性，但过量表达这些抗旱基因，容易导致植株矮化、生物产量降低等问题。因此，如何能够有效提高植物的耐旱性，且对植物在水分充足时的生长发育没有不利影响是目前提高植物耐旱性要解决的重要问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种干旱诱导型启动子，可使外源目的基因只在干旱诱导下特异表达，对于植物在水分充足时的生长发育没有不利影响，具有非常重要的应用潜力。
为达到以上目的，本发明提供了一种柳枝稷干旱诱导表达的启动子。
本发明所提供的干旱诱导型启动子，名称为PvHVA1-pro。该启动子具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，或与SEQ IDNO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样具有启动功能的DNA分子。
优选的，该启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且同样具有启动功能的DNA分子。
该启动子是从柳枝稷中克隆得到，也可通过人工合成方法获得，由1821个核苷酸组成。
凡是经过人工修饰的，与本发明分离得到SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且具有启动功能的DNA分子，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列。
本发明还提供一种包括所述启动子PvHVA1-pro的重组表达载体。
本发明所述重组表达载体为在原始载体的多克隆位点引入干旱调控相关基因，并在干旱调控相关基因前插入启动子PvHVA1-pro。例如在原始载体的多克隆位点引入水通道蛋白基因PvPIP2，并在基因PvPIP2前插入启动子PvHVA1-pro，由该干旱诱导型启动子PvHVA1-pro驱动水通道蛋白基因PvPIP2的植物表达载体。该水通道蛋白被证明在柳枝稷中过量表达可以显著提高其耐旱性。
本发明提供的重组表达载体优选是一种植物表达载体，该植物表达载体含有上述干旱诱导表达启动子。更优选的，所述植物表达载体是将上述干旱诱导型启动子用EcoRⅠ和KpnI双酶切后连接在改造的植物双元表达载体pCAMBIA1302上，命名为pCAM-PvHVA1-Pro，驱动下游报告基因GUS基因表达。载体改造主要为：在原始载体的多克隆位点除引入β-葡萄糖苷酶基因(β-glucuronidase,GUS)，并在该基因前插入启动子序列。
本发明还提供了一种遗传工程转化的宿主细胞，该宿主细胞含有上述干旱诱导型启动子PvHVA1-pro，或含有上述构建好的重组表达载体。所述宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，更优选为根癌农杆菌细胞。
本发明还提供上述启动子PvHVA1-pro或表达载体或宿主细胞在基因工程中的应用。
本发明还提供上述启动子PvHVA1-pro或表达载体或宿主细胞在提高植物耐旱性的基因工程中的应用。上述PvHVA-pro作为启动子的应用和启动目的基因表达的应用均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述干旱诱导表达载体在调控植物基因表达中的应用。所述应用包括用构建好的植物表达载体转化柳枝稷、并通过干旱处理来鉴定该启动子的调控机制，为干旱诱导型启动子的应用奠定了基础。
本发明还提供了上述启动子PvHVA1-pro或表达载体或宿主细胞在植物育种中的应用。
本发明还提供了上述启动子PvHVA1-pro或表达载体或宿主细胞在抗干旱植物育种中的应用。
本发明所述植物可以包含单子叶植物或双子叶植物，如柳枝稷、拟南芥等。
有益效果：
本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro。本发明的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro可以启动干旱调控相关目的基因的表达，可以培育抗干旱的植物品种，可以应用于植物遗传改良，对干旱调控研究也具有重要的意义。
附图说明：
图1为Q5高保真DNA聚合酶扩增所得PvHVA1-pro片段。
图2为PvHVA1基因在PEG处理下的相对定量表达。
图3为PvHVA1-pro转基因柳枝稷的PCR验证。
图4为PvHVA1-pro转基因柳枝稷在干旱诱导下各组织部位的GUS化学染色。
图5为启动子驱动与干旱相关的水通道蛋白基因PvPIP2；1的耐旱生理表型。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，在本发明的保护范围但不限于下述的实施例。若未特殊说明，本实施例所用方法均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，均为市售购买产品。
实施例1
1材料
1.1植物材料
本发明启动子克隆以柳枝稷Alamo品种为材料，遗传转化材料所用品种为HR8，均取自南京农业大学草业学院草种质资源圃。
2方法
2.1PvHVA1基因在干旱诱导下的相对定量表达
水培柳枝稷约30cm高时，将其放入含有20％PEG6000(W/V)的1/2Hogland营养液中进行处理，分别在0.5,1,2,4,8,12h时进行取样，取其从上往下展开的第2-3片叶片。之后，提取植物总RNA，反转录后，进行qRT-PCR。内参基因为PvFTSH4。所用引物如下表所示：
PvHVA1上游引物 AGCTACCTGGGCCAGAAGAC
PvHVA1下游引物 GCTCTCCTTGGCGTACTCG
PvFTSH4上游引物 TGGATGGCTTTAAGCAGAATGA
PvFTSH4下游引物 CAAAACGCCCAGGTCTGACT
2.2干旱诱导型启动子的获得
根据PvHVA1基因序列在柳枝稷基因组数据库(www.phytozome.org)中进行比对，找到PvHVA1的启动子序列，在上下游分别设计引物，上游添加酶切位点EcoRⅠ,下游添加酶切位点KpnⅠ和SalⅠ，引物序列如下(下划线为酶切位点序列)：
Figure BDA0001566400160000041
取柳枝稷的新鲜叶片，提取基因组DNA，作为模板，用Q5高保真DNA聚合酶扩增目的片段。反应体系和程序如下:
PCR反应体系：
Figure BDA0001566400160000042
PCR反应条件：
Figure BDA0001566400160000043
通过1％低熔点琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，并切胶回收，回收产物链接至pEntry-D入门载体，送公司测序。测序序列为SEQ NO.1，共由1821个核苷酸组成。
2.3启动子序列比对及表达载体构建
将测序所得的启动子序列进行比对后，挑选正确的克隆提取质粒，进行双酶切，通过T4链接酶链接至改造的线性化pCAMBIA1301-GUS载体中，电转入大肠杆菌T1，进行菌液PCR验证，正确的单克隆提取质粒，电转入根癌农杆菌AGL1中，-80℃保存。
2.4启动子信息分析
通过在线分析软件PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)对干旱诱导表达启动子中的顺式作用元件进行分析。
2.5柳枝稷的遗传转化和PCR验证
将上述含有植物表达载体的农杆菌通过侵染愈伤组织的方法，对柳枝稷株系HR8进行遗传转化，至分化出苗时，将其转移至基质中进行扩繁。之后，提取基因组DNA进行PCR鉴定。
2.6PvHVA1pro转基因植株对干旱诱导的响应
在正常浇水，干旱和干旱后复水的情况下，分别对转基因和野生型柳枝稷的叶片、茎和根三个组织部位进行GUS染色，观察该启动子在干旱诱导下启动下游基因的表达情况。2.7PvHVA1pro::PIP2；1转基因植株的耐旱性分析
构建PvHVA1pro驱动一个水通道蛋白基因PvPIP2；1(被证明具有耐旱功能)的植物表达载体，对柳枝稷进行遗传转化。对获得的转基因株系进行干旱处理，观察其生理表型，判断该启动子在提高植物的耐旱性方面是否具有实际应用价值。
3结果与分析
3.1干旱诱导下PvHVA1的表达分析
为判断该启动子是否为干旱诱导型启动子，对柳枝稷进行了短期干旱处理，如图2(注：以对应时间点正常生长的基因表达作为对照)所示，qRT-PCR结果显示，在干旱处理4h时，该基因被上调表达近5000倍，8h时被上调表达近3000倍。结果表明，该基因在短时间的干旱诱导下，即可得到明显的上调表达，说明该基因的启动子可能为干旱诱导型。
3.2干旱诱导型启动子PvHVA1-pro的克隆
以柳枝稷Alamo的基因组DNA为模板，通过Q5高保真DNA聚合酶进行扩增，获得基因上游约1821bp的启动子区段，如图1所示(注:M：DNA marker DL5000)。通过分析其顺式作用元件，我们发现其包含9个正向(+)和4个反向(-)ABRE顺式作用元件，还有多个DRE、MYC、MYB和WYKY顺式作用元件，这些顺式作用元件均是干旱响应顺式作用元件。
3.3启动子表达载体构建
将测序正确的启动子序列从入门载体pEntry-D上用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切后，链接至相同酶切位点线性化的植物表达载体pCAMBIA1302-GUS中。将构建好的载体转化至农杆菌AGL1中，以用于观察该启动子驱动下游GUS基因的表达。
3.4柳枝稷的遗传转化与鉴定
挑取上述转化的农杆菌阳性克隆，侵染柳枝稷愈伤组织，待分化成完整的植株后，提取基因组DNA进行PCR鉴定。鉴定结果如图3(注：M：DNA marker DL5000；PCK表示载体扩增；WT表示野生型；Line2和Line3:表示转基因株系)所示，用于GUS组织化学染色的两个转基因株系均为阳性。
3.5转基因株系在干旱诱导下的GUS组织化学染色
选取二个阳性株系，分别在正常浇水，干旱处理以及干旱后复水的情况下，对转基因和野生型柳枝稷进行叶片、茎和根三个部位的GUS组织化学染色。如图4(注:图中每个处理的组织部位依次为叶片、茎和根；WT表示野生型柳枝稷扩增；Line2和Line3:表示转基因株系)所示，在对照情况下，HVA1pro::GUS转基因株系仅在茎部有少量的表达，而在干旱处理下，转基因株系的叶片、茎和根三个部位均表现出明显的GUS活性。在复水之后，转基因株系的GUS染色消失。而无论在对照，干旱处理还是复水后，野生型植株的各组织部位均未表现出GUS活性。以上结果表明，在水分充足的条件下，PvHVA1pro没有或仅有较低的表达活性，而在干旱诱导下，在叶片、茎和根三个部位均有较强的表达活性，证明该启动子在干旱诱导下具有较强的启动活性，为干旱诱导型启动子。
3.6PvHVA1pro::PIP2；1转基因植株的耐旱性分析
为验证该启动子是否可作为植株耐旱育种的候选启动子，本发明构建了一个由PvHVA1pro驱动下游耐旱基因PvPIP2；1的植物表达载体，其中，该基因为一个水通道蛋白基因，已被本发明的申请人经试验证明具有耐旱功能。将上述植物表达载体转化柳枝稷，观察转基因株系的耐旱表型。如图5(WT表示野生型；Line1和Line6表示转基因株系)所示，在水分充足的条件下，野生型和转基因株系生长状态无明显差异。在干旱处理下，野生型植株表现为叶片更为卷曲，且有部分叶片已经枯黄。而转基因株系仅有少量的叶片末梢开始卷曲，枯黄。结果表明，转基因植株具有更好的耐旱性。因此，PvHVA1pro启动子作为一个干旱诱导型启动子，可以在干旱条件下诱导下游耐旱基因大量表达，从而提高植株的耐旱性，可以成为植物耐旱分子育种的候选启动子。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种植物的干旱诱导型启动子PvHVA1-pro及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1821
<212> DNA
<213> 柳枝稷(Panicum virgatum)
<400> 1
ccttctgacg atggcgatgg aacggggagc agggcagagg gcacgacgca cgacgaggac 60
cagactgccc gacgagaggt gattggtcaa ctcgggatga ggagctggac ctgttgagga 120
agaagctgcg cactcggacg gaggaaaata tcatcatcgg cggcggcggc ggtgctgcag 180
ggcggggcgg ggaggcagtc acggagcaga ggagggagaa ggaagagagt ggaatgagtg 240
tgttgggcgt cggggctgga caaaggcctt gtttggatgc gcgctaggat tctagcgcta 300
gtgaatagtg ccactttgac cgttaattac ggtgtcaaac aaaaccagtt tacaaaacca 360
acttcagaac ccctgcgcta gtgaccctga agaatctaat gaggtctttg accgcgcgat 420
tagaggatag ttactgtagt atcactgtag caaatcatca attaattacc gtcattagat 480
tcgtcgcgaa aagttacacc catccctaaa aaggttttgc aaatagactt catttagtgc 540
tttatgcatg cgagattatt ttttcgggaa ttgtgcgcgc tagaattgta gcattgccaa 600
acaaggccaa aagcgctcag gttgggcgcg ggggagggca gctcacgtgg agactgctgg 660
accgtcgcgt tggcatccaa aaggataaga gtggtaaaaa tgtaaatatt ttttttttcg 720
attctgtaat tgcaaaaata ctatctcagt gccagttcac agttctgtgc ggcagctagc 780
ggcctgtcat cctcctcacc aagctcgcgc gaccacgtca cgaaccgaaa cgcaacacgt 840
ccgtcgaagc tcccccgcgc gcgcacatga ccgcacgccg cgaggtcagg cgacctcgcc 900
accgcaccac ccaccaagtg taaggccccg tttagttctc aaaaattttc acctcccctt 960
taaaacacat gtatgaagta ctaaatataa ttaaataata aaactaatta cacagtttgg 1020
atgtacacga cgagacgaat cttttgagtc taattaggac atgattagcc ataagtgcta 1080
cagtaaccca catgtgctaa tgatgcggtc aaaggcctca aaatattcgt ctcgcggttt 1140
ccaagtgagt tctgaaatta gttttttaat tagtgttcga aaagccctcc cgacatctag 1200
tcaaacgaca agacacccaa aatttttgat tttgggaact aaacgctccc taaattcacg 1260
tcggcgtcac ttacccgagg cggaaaaggc gcacgcatcc aacttgtcct cccctcctcg 1320
ccaccaccac cattttcata tctagctatc gtgatgatga tcatcatcgg gtgggtacac 1380
cgagccgcgc gcgctcggct gtgcccctgt acttgtgttt aagttgttta tggccctccg 1440
cccctcccgc tttgcttttc tcgtcggcac atgccgatcg ggcgaccggc gtctgcgcgc 1500
gcgaatcagc ttccgcctac atggccaggc ttcgcgaagg tacggacccg cggcgcaacg 1560
cgtgtcctgt ctacgtggcc gtcatgtacg agcccccggg cgcgacgtgt cccggggcgc 1620
gtctcgcggc cgcggcttat aaaaacggcc tgcagcgagg gccctagaca tcggtagtgt 1680
tgaggttcct gcaggctttc agctgagcgt tcgtcagtag tagccaagtg ttcatcgctg 1740
ctttcatttc ctgagagtga ttcgagcgat cgatctctgt tcgtgtgttt ttagttagct 1800
cgagggtgag agatcgtcgt c 1821

Claims (10)

1.启动子PvHVA1-pro，其特征在于所述启动子PvHVA1-pro的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种包含权利要求1所述启动子PvHVA1-pro的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在原始载体的多克隆位点引入干旱调控相关基因，并在干旱调控相关基因前插入启动子PvHVA1-pro。
4.一种包含权利要求1所述启动子PvHVA1-pro或权利要求2或3所述重组表达载体的宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为根癌农杆菌细胞。
7.权利要求1所述PvHVA1-pro、权利要求2或3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞在基因工程中的应用。
8.权利要求1所述PvHVA1-pro、权利要求2或3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞在提高植物耐旱性的基因工程中的应用。
9.权利要求1所述PvHVA1-pro、权利要求2或3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞在植物育种中的应用。
10.权利要求1所述PvHVA1-pro、权利要求2或3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞在抗干旱植物育种中的应用。
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