CN104250647A

CN104250647A - 一种干旱诱导型启动子及其应用

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Publication number: CN104250647A
Application number: CN201410442242.6A
Authority: CN
Inventors: 方正武; 刘志雄; 王彩丽; 李晓方
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2034-09-02
Also published as: CN104250647B

Abstract

本发明一种干旱诱导型启动子及其应用属于基因工程领域，具体涉及DNA重组技术中一种调节基因表达的非编码核酸。本发明提供的启动子，该启动子的核苷酸序列为SEQIDNO:1。本发明所述的启动子能够为植物生物反应器的研发提供实验和技术支撑。利用所述的干旱诱导型启动子，以植物作为生物反应器，表达疫苗、抗体及其他药用蛋白等，可突破传统农业范畴，延伸到医学领域。

Description

一种干旱诱导型启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及DNA重组技术中一种调节基因表达的非编码核酸。

背景技术

在植物基因工程研究中，使外源目的基因在受体中表达，以提高作物对干旱、低温、盐碱以及病虫害等逆境胁迫的抗性，或提高作物品质及改良作物农艺性状等，已成为目前作物育种的一种重要手段。真核生物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。其中, 转录水平的调控受顺式作用元件和转录因子协调作用，是表达调控的关键环节。因此，有关启动子的分离和研究成为国内外研究的热点之一。

使用组成型启动子驱使外源基因表达，不仅造成资源浪费，还直接影响植株的生长发育及正常的生理代谢，而使用诱导型启动子，不仅不会造成各种资源的浪费，又能增强植物体对外界的抗性，减少对植物生长发育及其他代谢途径的影响。因此，如何控制外源基因定时定量地高效表达，是基因工程技术在作物遗传改良方面有效应用的关键所在。除了寻找有效的目的基因之外，发现有效控制外源基因表达的启动子成为基因工程改良中需要解决的重要问题。启动子根据其功能和作用方式大致分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三种。组成型启动子调控的基因表达不受外界环境条件的影响，几乎在所有植物不同组织中都能表达。典型的是花椰菜花叶病毒(cauli-flower mosaic virus, CaMV) 35S 启动子，被广泛应用于双子叶植物转基因工程(Benfey等，1990，Science 250， 959-966) 。其它单子叶有玉米泛素Ubiquitin 启动子(Streatfield 等，2004，Transgenic Res 13，299-312)和水稻肌动蛋白(Actin)启动子。该类启动子活性较高，但由于其导致外源基因在转基因植物整个生长时期的不同部位表达，影响植物的生长发育和正常生理代谢，有些产物可能造成毒害作用，不利于品质和产量的提高，甚至会导致植物的死亡。Kasuga 等利用诱导型rd29A 启动子代替CaMV35S 启动子转化拟南芥，提高了转基因拟南芥的抗旱性，同时减少了组成型过表达造成的植株生长停滞或矮化现象的发生(Kasuga，2004，Plant and Cell Physiology 45, 346-350)。因此，为了更好地调控植物基因的表达，组织特异型启动子和诱导型启动子的研究和应用越来越受到人们重视。

组织特异型启动子是调控目的基因只在特定器官或组织中表达。该类启动子一般存在一些与组织特异性相关的特异基序。Nitz等从拟南芥中分离得到编码在根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因Pyk10 启动子序列,该启动子能调控目的基因在转基因拟南芥根部高水平特异表达（Nitz 等，2001，Plant Science，161，337-346）。Bate 等通过缺失突变分析马铃薯花特异表达基因LAT25 的启动子发现,调控花粉特异表达元件位于该基因启动子 -492 到 -52区段（Bate等，1998，37，859-869）。玉米叶片特异性PPCA1 启动子(Gowik 等，2004，Plant Cell 16，1077-1090)、草莓果实特异性GalUR 启动子(Agius 等，2005，J Exp Bot 56，37-46) 等。对该类启动子的深入研究有助于阐明植物生长发育和生理代谢的基础理论，而且具有广泛的应用价值。诱导型启动子是指正常状态下不表达或低表达，受到某些物理或化学信号的刺激，可以大幅度地提高基因的表达水平一类启动子。根据诱导因素，诱导型启动子可分为光诱导型启动子、温度诱导型启动子、损伤诱导型启动子、激素诱导型启动子和真菌诱导型启动子等。其特点是：受到物理或化学因素的诱导；含有多种功能元件，协同增强或降低启动子的活性；部分诱导型启动子同时具有组织特异性启动子的特点。其他诱导型启动子如水稻质膜CaATPase 启动子受干旱、寒冷、茉莉酸甲酯以及脱落酸的诱导(Huda 等, 2013, PLoS One 8)。拟南芥RBCS-1A 启动子是光诱导型启动子，同时具有组织特异性( 习雨琳等, 2012, 作物学报38, 1561-1569)；对于诱导型启动子，目的基因只有在接受诱导信号后才会表达，不仅不会造成各种资源的浪费，又能增强植物体对外界的抗性，减少对植物生长发育及其他代谢途径的影响。因此，研究和利用诱导型启动子，对于研究植物响应各种胁迫的生理机理以及研究农作物的抗逆基因工程都有重要的意义，在基础研究和植物生物技术方面也有着广阔的应用前景。然而到目前为止，能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此, 对于新的抗逆相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用, 以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能在干旱诱导时启动目的基因表达的启动子及其应用。本发明一方面提供了一种启动子，该启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明还提供了含有上述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。

所述的重组载体是在载体的多克隆位点处插入所述的启动子后得到的重组质粒。

所述表达盒由所述的启动子，该启动子表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述的启动子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

本发明有一个方面是提供了所述的启动子在启动目的基因于植物表达中的应用。优选是在干旱诱导时。

本发明还有一个方面是提供了一种利用所述的启动子培育转基因植物的方法，包括如下步骤：

1）构建目的基因重组表达载体：将目的基因插入到含有所述启动子的重组载体中，干旱诱导使所述的启动子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；

2）将步骤1）构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，干旱诱导使所述的启动子启动所述目的基因表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。

本发明还有一个方面是提供了一种使植物在干旱诱导时表达目的基因的方法，其是将目的基因插入到含有所述启动子的重组载体中，并将该重组载体导入目的植物中，然后干旱诱导目的基因在植物中进行表达。

本发明所述的启动子能够为植物生物反应器的研发提供实验和技术支撑。利用所述的干旱诱导型启动子，以植物作为生物反应器，表达疫苗、抗体及其他药用蛋白等，可突破传统农业范畴，延伸到医学领域。

附图说明

图1：本发明启动子 pCD4 构建PCR电泳图。

图2：本发明的启动子 pCD4 连接 T 载体质粒酶切鉴定电泳图。

图3：本发明的启动子 pCD4 连接pC0390GUS酶切鉴定电泳图。

图4：干旱诱导条件下，启动子 pCD4 转化烟草叶片的GUS基因组织化学染色。

图5：干旱诱导条件下，启动子 pCD4 与对照的GUS活性比较。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的方法进行详细的描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。

实施例1：本发明所述干旱诱导型启动子pCD4的分离

1.1 甜荞基因组DNA的制备

将带培养基质的甜荞苗在光照条件为8000LUX，温度为25^oC条件下生长3周。然后转入光照条件为8000LUX，接着采用北京艾德莱生物科技有限公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（目录号DN15）提取DNA。

1.2 启动子 pCD4 的克隆和序列分析

以上面提取的DNA为模板，用PCR方法扩增FeDREB1基因上游启动子序列。其扩增引物如下，其上游引物中引入HindⅢ酶切位点，下游引物中引入BamhⅠ酶切位点：

上游引物：5'- CCCAAGCTTAAGGTTCTTTGCAAGTC -3'

下游引物：5'- GCGGATCCGATCGATCCTGAATATAT -3'

PCR反应体系

PCR反应程序：94 ^OC变性5 min；94^OC变性30 s，60^OC退火30 s，72^OC延伸2 min，29个循环；72^OC 10 min,4^OC保温。

用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，见图1。

目的基因DNA 片段从琼脂糖凝胶上的回收用天根生化科技有限公司DNA回收试剂盒回收，操作按照试剂盒说明进行。

PMD19-T Simple Vector）的连接反应

连接反应按照takara公司PMD19-T Simple Vector载体试剂盒说明进行操作，连接反应体系如下：

混匀反应物，短暂离心，4 ℃过夜。

和阳性克隆的鉴定

用于转化的大肠杆菌为DH5ａ（购于天根生化科技有限公司）。感受态细胞的制备和连接产物的转化均在无菌条件下操作。挑取转化平板上的白色菌落，采用质粒少量提取试剂盒提取质粒（购于天根生化科技有限公司）作为模板，按照前面所述的PCR引物和扩增条件进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生长度为1278bp的DNA片段，命名为 pCD4 。

④测序验证

经过鉴定的 pCD4 阳性克隆，送Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核苷酸序列如序列表1所示。

实施例2:启动子pCD4植物瞬时表达载体的构建

利用Bam HI和Hind III 核酸内切酶酶切重组克隆载体（T+ pCD4 ）和pC0390::GUS 载体(图2,图3)，再将启动子pCD4 与pC0390::GUS 载体的GUS报告基因连接，构建植物瞬时表达载体。构建好的植物瞬时表达载体命名为pCD4::GUS 。pC0390::GUS 载体和pC35S::GUS 载体由宁夏大学徐伟荣博士提供，具体构建过程参照文献（Xu等, 2010，Planta，231:475–487）。采用电击法，将构建的pCD4::GUS载体、pC0390::GUS 载体（阴性对照）和pC35S::GUS 载体（阳性对照）分别导入根癌农杆菌感受态菌株GV3101中以备用。

实施例3: 鉴定干旱条件下，启动子pCD4活性

3.1

3.1.1烟草培养及瞬时转化

本氏烟草种子经4℃处理1周后，播种于营养钵的灭菌基质中，并且覆盖保鲜膜，在炼苗室生长3周出苗后移入人工智能气候培养箱。在培养箱中培养 5 周的烟草植株用于农杆菌介导的瞬时转化分析。具体转化方法如下：①接种包含启动子与GUS融合构建的农杆菌20μl于20mL新鲜的LB液体培养基，附加利福平 50mg L^-1，Kan 50mg L^-1，在28℃恒温摇床 240rpm，过夜培养；②将过夜培养的农杆菌菌液转移至50mL的灭菌离心管中，在室温6000rpm，离心10min；③弃上清，并用10mL的渗透缓冲液（10 mM MES， 10 mM MgCl₂，100 μM AS pH，5.7）重悬菌体；④取重悬后的菌液2mL，测定OD600值，用渗透缓冲液将其稀释至OD600 值约0.6的菌液用于转化；⑤在用稀释后的农杆菌菌液注射烟草叶片表皮细胞前，将烟草从气候箱中取出，并置于白炽灯光下1h，使气孔完全开放以利于注射渗透。⑥用1mL的无针头的注射器吸取准备好的农杆菌菌液，在选择好的注射点，将针头抵住，缓慢将菌液注入烟草叶片的细胞间隙，使菌液尽可能渗透到整个叶片。⑦渗透后的烟草植株覆盖保鲜膜，放回气候培养箱，恢复培养1d；⑧培养1 d后转化烟草植株用15% PEG6000的水溶液在浸泡烟草植株根部模拟干旱诱导处理；⑨上述各转化烟草植株分别在干旱胁迫处理和正常条件培养1 d后，立即剪取对照植株和干旱胁迫处理植株的叶片以进一步分析使用。

3.1.2转化烟草植株叶片 GUS 表达活性分析

GUS 组织化学染色参照 Jefferson(1987)的方案。将烟草叶片材料置于灭菌平皿中，加入GUS染色液（10 mM Na₂EDTA，100 mM NaH₂PO₄，0.5 Mm K₄Fe(CN)₆·3H₂O，0.1% Triton X-100 和 0.5 mg L^-1 X-Gluc，pH 8.0）覆盖材料；将平皿置于37 ℃的恒温培养箱中培养24h；回收染色液；给平皿中加入70%乙醇，于37℃温育5-6h；倒掉平皿中的乙醇，加入90%乙醇，在37℃继续温育10h；倒掉乙醇，进行GUS染色观察及照相。取1g左右的对照和处理烟草组织放在研钵中，用液氮研磨成粉末状，加入提取缓冲液(含50 mM L^-1 磷酸钠，10 mM L^-1 EDTA，0.1% TritonX-100， 1% Sarcosyl，10 mmol L^-1 β-巯基乙醇)，混匀，4℃，5000 rpm 离心10min后，取上清液得到GUS可溶性蛋白粗提液。取出部分加1 mM L^-1 的GUS 反应底物4-MUG，37℃保温30 min 后，加0.2 m M L^-1 Na₂CO₃ 反应终止液终止反应。利用日立850 型荧光分光光度计测定荧光值，激发光365 nm，发射光455 nm。可溶性蛋白含量参照Bradford（1976) 法测定，用UV-2102C紫外分光光度计测定GUS 蛋白含量，激发光波长595 nm。以1 min 水解4-MUG 生成 1 pM 4-MU的所需酶量为一个酶活力单位，以每毫克蛋白的酶活力表示GUS 活性。上述实验重复三次。

GUS活性很强的显示出很深的蓝色，淡蓝色表示活性较低，无蓝色表示GUS 活性较低。如图4所示，野生型（WT）和转化 pC0390::GUS 植物表达载体（阴性对照）的烟草叶片在正常生长、干旱诱导条件下不能被 X-Gluc 溶液染成蓝色，但转化pC35S::GUS 的植物表达载体的烟草叶片在各种条件下均可以被 X-Gluc 溶液染成蓝色，说明 pC0390::GUS 植物表达载体能用于本实验的启动子片段的活性分析。

在干旱诱导处理下，转化了pCD4::GUS烟草叶片中出现深蓝色，表明pCD4（-1278bp）启动子在干旱诱导条件下，可大幅度激活GUS 基因表达，说明pCD4（-1278bp）是干旱诱导型启动子。图5中的GUS的荧光定量结果表明，pCD4启动子活性是阳性对照的活性42.0%，说明该启动子是一种高效干旱诱导型的启动子。

3.2

分别选择拟南芥、水稻和甜荞，使用与3.1类似方法，分析启动子pCD4活性在上述15%的PEG6000条件下干旱模拟条件下的活性。结果发现，相比正常生长条件的对照而言，转化了pCD4::GUS 的拟南芥、水稻和甜荞叶片在低温诱导条件下均被X-Gluc染成蓝色，说明了pCD4（-1278bp）是干旱诱导型启动子。GUS的荧光定量显示，三种植物中pCD4（-1278bp）启动子区段活性分别是阳性对照的活性 38.6 %、35.4 %和 39.8%，说明该启动子是一种高效干旱诱导型的启动子。

序列表

<110>长江大学

<120>一种干旱诱导型启动子及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211> 1278

<212> DNA

<213>甜荞

<220>

<223>启动子pCD4

<400> 1

aaggttcttt gcaagtctta taatagtccg accttcctgt acttgtctta cattccatta 60

atcatcttct tatcttccat tatcatccat aattccgcat tcttagttgc gcagaatctt 120

ggcctgttct tgagtaaata ttgcccaaga gtttcttcag tttacccgag atttgctttt 180

attgatcaat ctgatgattt tcaatctaga tcgggaattg cgacatcagc cccgcatcag 240

ttagtttgaa aaacttgaaa agttatggtc ggttttacaa taaggtaagt tagattggtt 300

atcctaccaa aattttctat tttgtaatgg ttaagtttat gtttttttca aatttacata 360

tttgatattt tgggatgatc gggttgtgat actatttttt ttttttaaat aattgtttta 420

acttctcatg ggttatgtaa ataactccct ataaatattt ttcaagcaat ttttacaaac 480

ccctcaccat acgtgcatag ttaggagttt ttaacaacgt cagaactatt tttagctgta 540

gttttttgaa aagaccctga aaatatttat caaggttttt tttaaaaatt gtcatttgtt 600

gtttgtctag ggttaaaaat aactaatgag aaatatttat cagccaagcg cataaaaagt 660

aaaacaaaaa cacattctca ttcagtaaaa taaatattga gagagtttat gtgtactagt 720

gtttgtgttg ttttcggacc atggtagtcg tagttgaaga ttagtcaccc ttataaaacc 780

ggaaactaca taaacatatt tataatatag ttagtatata tattgtagta ctgagtacct 840

cccaaagttt attaattaaa tatagtgtgt caatttggat aaaaccgtgc aatatataaa 900

gttatggttt gaagttgtaa tttcgctaaa agtaagaata aaaaaataaa taaaggcaat 960

cattgtagag aaattgataa tatagtcgac gtggaaagcc tgtgaaaaat agacctagtc 1020

aggatcacga ctgtactccc ttacccagaa acctccttac gaacacttgc gccagctccc 1080

tgaatatcca atccgccaga ccgccaccag ctgtctcctc cgtgttaacc accaccacac 1140

tcttcccaca ctctatttcc tcgtccccaa ttcaaccaac actatataaa atcacaccat 1200

ccatcttaca acttaattag attaaattct taaatcttaa tcaactcaaa attacttcat 1260

atatattcag gatcgatc 1278

<210>2

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> primer 1

<400> 2

cccaagctta aggttctttg caagtc 26

<210>3

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> primer 2

<400> 3

gcggatccga tcgatcctga atatat 26

Claims

1.一种启动子，其特征在于该启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.含有如权利要求1所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。

3.如权利要求1所述的启动子在启动目的基因于植物表达中的应用。

4.如权利要求3所述的启动子在干旱诱导时启动目的基因于植物表达中的应用。

5.利用权利要求1所述的启动子培育转基因植物的方法，包括如下步骤：

6.一种使植物在干旱诱导时表达目的基因的方法，其特征在于该方法是将目的基因插入到含有如权利要求1所述启动子的重组载体中，并将该重组载体导入目的植物中，然后干旱诱导目的基因在植物中进行表达。