CN101842485A - 与玉米cbf转录因子相关的调控元件 - Google Patents

Abstract

提供了调控植物中异源多核苷酸序列表达的组合物和方法。组合物为新的核苷酸序列，包含与玉米CBF1或CBF2编码区天然连接的分离的应激诱导启动子。提供了使用本发明公开的调控序列在植物中表达异源多核苷酸序列的方法。该方法包括转化植物细胞，以包含与本发明的一或多个调控序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，并从转化的植物细胞重建稳定转化的植物。

Description

与玉米CBF转录因子相关的调控元件

发明领域

本发明涉及植物分子生物学领域，特别是植物基因表达的调控。

发明背景

植物宿主中异源DNA序列的表达依赖于在植物宿主中存在可操作地连接的功能性调控元件。调控元件的选择将决定异源DNA序列在生物体中表达的时间和位置。在植物的所有细胞和/或整个发育中期望连续表达时，利用组成型启动子。相反，在期望响应刺激表达基因时，诱导型启动子就是选择的调控元件。需要在特定组织或器官中表达时，可使用组织特异性或组织优选的启动子，驱动其优先在某些组织或器官中表达。这些组织特异性或组织优选的启动子可临时是组成型的或可诱导。在这任一情况下，核心启动子序列上游和/或下游的其他调控序列可包括于转化载体的表达构建体中，使转基因植物中异源核苷酸序列的表达水平发生变化。

随着该领域的发展以及更多基因变得容易取得，更需要具有多基因的转化植物，并且这些多外源基因通常需要受独立的调控序列控制。此外，一些基因应当组成型地受到调控，而另一些基因则应当在转基因生物中某些发育时期或位置表达。因此，需要具有不同作用的各种各样的调控序列。

由于使用同一调控序列来控制多个基因可产生不期望的生化相互作用，所以也需要不同的调控序列。例如，利用一个调控元件的多个拷贝转化可引起一些问题，以致一或多个基因的表达可能受到不利的影响。

涉及非生物应激反应的早期检测和信号基因的转基因调控需要这些转基因在接触应激时及早以中等水平表达。并且，需要这些转基因的表达在应激的后期关闭，以防继续诱导下游靶标，即容易出现产物不利的情况。本发明提供两种调控序列，可用于信号和检测基因的早期表达和紧密调控，用于植物应激耐性的调控。

发明人在本文中公开了分离和鉴定与应激相关的转录因子有关的启动子的分离和表征，转录因子可作为分离的目标核苷酸序列表达的调控元件，从而影响植物的各种性状。可选地或此外，这些启动子可用于驱动可检测标记物。

发明概述

本发明提供了植物启动子，其调控转录并对非生物应激做出反应而被诱导。

在一个实施方案中，该启动子以应激反应方式驱动转录，其中所述启动子包含选自下述的核苷酸序列：

a)与编码玉米(Zea mays)CBF1或CBF2转录因子的DNA天然相关，且调控该DNA表达的序列；

b)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出的核苷酸序列；以及

c)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出的核苷酸序列的片段的序列。

其他的实施方案涉及包括上述核苷酸序列的表达盒、转化载体、植物、植物细胞和植物部分。本发明还涉及在植物和植物细胞中使用该序列的方法。本发明的实施方案还包括上述可操作地连接到可检测标记物的核苷酸序列。

附图简要说明

图1显示ZmCBF1的调控序列(1329个碱基对)。标记了假定的顺式作用元件，包括TATA框(粗体)、CRT/DRE共有序列(双线框)、ABRE核心基序(单下划线)以及myc-结合序列(单线框)。粗体字母、双下划线和箭头显示翻译起始位点即ATG。所有特征也都显示于SEQ ID NO：1列出的序列中。

图2显示ZmCBF2的调控序列(2209个碱基对)。标记了假定的顺式作用元件，包括TATA框(粗体)、CRT/DRE共有序列(双线框)，以及myc-结合序列(单线框)。假定的转录起始位点以双下划线显示。粗体字母、双下划线和箭头显示翻译起始位点即ATG。所有特征也都显示于SEQ IDNO：2列出的序列中。

发明的详细描述

通过引用，并入本文所提及的所有公开出版物。

除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的具有相同的意思。除非另外说明，本文所用的或设想的技术为本领域普通技术人员所熟知的标准方法学。材料、方法和实例仅为阐释性而非限制性。

植物通过基因表达的调控适应环境应激，如寒冷、干旱以及盐度。应激诱导型基因的启动子区可包含顺式作用元件，其为反式作用因子所识别的DNA片段。反式作用因子包括植物激素，如已证实与ABA-反应元件(ABRE)结合的脱落酸(ABA)；例如，见Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(2005)Trends in Plant Science 10(2)：88-94。其他反式作用因子包括核蛋白，其能与调控DNA结合并能与其他分子，特别是DNA聚合酶III相互作用，引发与所述调控DNA可操作地连接的DNA转录。这些转录因子可以作为共享DNA结合结构域的相关蛋白家族存在。转录因子基因自身可被应激诱导。而且，顺式调控基因的下游靶标可为转录因子，从而产生一个基因级联反应的复杂网络。

DRE/CRT(脱水反应元件/C-重复)顺式元件响应应激发挥作用，并已在许多植物种类中被鉴定，包括拟南芥、大麦、甘蓝、柑橘、棉花、桉树、葡萄、玉米、甜瓜、胡椒、水稻、大豆、烟草、西红柿和小麦。DRE/CRT元件包含一个核心结合位点A/GCCGAC，被称为DREB1(DRE-结合)和CBF(C-重复结合因子)的反式激活因子识别。顺式元件和/或多种顺式因子附近的二级结构，似乎是其他对应激诱导型表达所必需的其他组分(参见综述Agarwal，et al.，(2006)Plant Cell Rep 25：1263-1274；Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki(2005)Trends in Plant Science10(2)：88-94)。CBF/DREB基因的启动子区可包含顺式作用元件，如ICEr1和ICEr2(Zarka，et al.，(2003)Plant Physiol.133：910-918；Massari andMurre(2000)Mol.Cell.Bio.20：429-440)。

其他转录因子包括MYC和MYC样蛋白(例如，参见Zhu，et al.，(2003)J.Biol.Chem.278(48)：47803-47811)。

根据本发明，提供了响应应激调控转录的核苷酸序列。本发明的序列包括与应激反应多核苷酸相关的调控元件。因此，本发明的组合物包含与编码ZmCBF1和ZmCBF2的核苷酸序列天然相关的植物调控元件的新型核苷酸序列。

ZmCBF1和ZmCBF2属于DREB1族的转录因子，接触非生物应激如寒冷、干旱和盐时被及早诱导。拟南芥CBF3基因的启动子已知含有5个myc结合位点，并与称为ICE1(CBF表达的诱导物)的碱性螺旋-环-螺旋蛋白结合，该蛋白是CBF的上游调控蛋白。水稻的DREB1B启动子(GenBank EF556551)已被Gutha和Reddy分离，且已证实受非生物应激诱导(Plant Molecular Biology online 10.1007/s11103-008-9391-8，28August 2008)。Badawi，et al.，(Plant Cell Physiol.49(8)：1237-1249(2008))报道了对小麦ICE(DREB1/CBF表达的诱导物)基因的分析及其对寒冷调控的拟南芥基因表达的影响。

ZmCBF1和ZmCBF2的调控区的鉴定将：(a)允许它们用于早期检测和信号基因的低水平表达和紧密调控，以及(b)有助于鉴定玉米ICE1转录因子的直系同源物，或者通过酵母单杂交筛选，或证实玉米直系同源物质的功能，直系同源用电泳迁移实验通过序列同源性鉴定。ZmCBF1和ZmCBF2先前已被公开；见美国专利7,253,000和7,317,141。如7,317,141的实施例4所述，内源ZmCBF2被冷应激迅速诱导。对ZmCBF1做的类似工作已表明，其也被寒冷诱导，在强迫接受冷应激后4小时出现表达峰。也评估了ZmCBF1在干燥应激下的表达；其在禁水的24小时内被诱导，在27小时出现表达峰。在冷应激下的基因表达中，诱导水平在峰值后减少，并且一旦在48小时内从冷应激中恢复，可回到零点。在干旱应激下的基因表达中，诱导水平在表达峰后逐渐降低并在禁水约36小时后回到零点。在两个实验中，在应激处理前都未观察到ZmCBF1表达。应激诱导的内源表达与在本发明另述的在ZmCBF启动子序列中鉴定的应激反应元件一致。

将ZmCBF调控元件可操作地与目标序列连接，调控可操作地连接的多核苷酸转录的起始，这将提供对植物表型的修饰。此类转录起始称为“启动子活性”。这些修饰包括调控内源产物的产生，如数量、相对分配等，或外源表达产物的产生，从而提供新功能或产物。例如，此类启动子可用于调控编码包括其他转录因子在内的应激反应蛋白的序列的表达。此外，将应激诱导的启动子与标记物，尤其是可见的标记物相连接，可用于跟踪连接的目标基因的表达。

提供了使用本文所公开的调控序列在植物中表达分离的核苷酸序列的方法。该方法包括以转化载体转化植物细胞，转化载体包含与本发明的一或多个植物调控序列可操作地连接的分离的核苷酸序列，以及从转化的植物细胞重建稳定转化的植物。以此方式，可使用调控序列以应激诱导的方式控制内源和外源产物的表达。

经常期望DNA序列在生物组织中，或在某种环境条件下优先表达。例如，增加植物对昆虫攻击的抵抗力可通过基因操作植物基因组来完成，使植物基因组包含与异源杀虫基因可操作地连接的组织特异性启动子，以致昆虫阻遏物在易感植物组织中特异性表达。增加对非生物应激的耐性可通过基因操作植物基因组来完成，使植物基因组包含与编码植物激素的异源基因可操作地连接的应激诱导启动子，从而使激素在应激条件下特异性表达。当组成型启动子在植物的所有细胞中启动异源核苷酸序列转录时，异源核苷酸序列在适当的组织中或在适当的条件下的优先表达会减少对植物资源的消耗。

或者，可能需要抑制天然DNA序列在植物组织中的表达，以获得需要的表型。例如，包括所有或部分各个ZmCBF启动子的发夹结构可用于下调天然应激反应的CBF1或CBF2，或下调任何其他与ZmCBF启动子连接的编码区。当适当地靶向下调应激反应的多核苷酸时，例如采用再生组织优选的启动子，某些植物组织可避免应激的有害作用。在另一实例中，将ZmCBF启动子可操作地连接于反义核苷酸序列，以致应激诱导的反义序列的表达就会产生RNA转录物，该转录物干扰部分植物细胞中第二DNA序列的mRNA翻译。

定义

为了本发明的目的，除非另外说明或根据上下文显而易见，“受试植物(subject plant)”或“受试植物细胞(subject plant cell)”为目标基因已实现遗传改变如转化的植物或植物细胞，或为从已改变的植物或植物细胞遗传下来并且包含该改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受试植物或植物细胞中的变化提供参考点。

对照植物或对照植物细胞可包括，例如：(a)野生型植物或植物细胞，即，具有与在受试植物或受试植物细胞中产生遗传改变的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料基因型相同的植物或植物细胞，但其已被无效构建体(null construct)转化(即，对目标特征没有已知影响的构建体，如包括标记物的基因；(c)从受试植物或受试植物细胞的后代非转化分离的植物或植物细胞；(d)遗传上与受试植物或受试植物细胞相同的植物或植物细胞，但未接触会诱导目标基因表达的条件或刺激物；或(e)在目标基因不表达条件下的受试植物或受试植物细胞自身。

“应激诱导的”是指植物在应激的条件下的有利表达，尤其是非生物应激，例如干燥、寒冷、高温或高盐。

“调控元件”是指负责相关编码序列表达的序列，包括，但不局限于，启动子、终止子、增强子、内含子等。

“终止子”指引起RNA聚合酶从DNA分离，从而引起转录终止的DNA调控区。

“启动子”是指能调控与其相连序列的转录的DNA调控区，即具有启动子活性的DNA区。它通常包含一个TATA框，该TATA框能够指导RNA聚合酶II在特定的编码序列的适当转录起始位点启动RNA合成。

启动子还可包含其他通常位于TATA框的上游或5’、被称作上游启动子元件的识别序列，其影响转录的起始速率，还包括影响相连核苷酸序列的空间和时间表达的元件。应当明白，已经鉴别了本文所公开的启动子区的核苷酸序列，分离和鉴定本文所鉴定的具体启动子区5’区上游中的其他调控元件在现有技术水平之内。因此，本文公开的启动子区可包括上游调控元件，如那些负责编码序列的组织和时间表达的调控元件，以及可包括增强子、转录调控蛋白的DNA反应元件、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、激活序列等。

在应激条件下能表达的启动子元件可以相同的方式鉴别、分离和与其他核心启动子使用。核心启动子是指启动转录所需的最小序列，如与编码蛋白基因的启动子相同的称为TATA框的序列。因此，ZmCBF1或ZmCBF2的上游启动子可任选地与其自身的或其他来源的核心启动子一起使用。启动子可原产于或非原产于发现其的细胞。

可修饰本发明的分离的启动子序列，以提供一系列表达水平的分离的核苷酸序列。可利用不完整的启动子区，且可保留驱动应激诱导表达的能力。应当明白，mRNA的表达水平能以启动子序列部分的特异性缺失来调控。因此，能将启动子修饰为弱或强启动子。通常，“弱启动子”是指驱动编码序列在低水平表达的启动子。“低水平”是指约1/10,000转录至约1/100,000转录至约1/500,000转录的水平。相反，强启动子驱动编码序列在高水平表达，或在约1/10转录至约1/100转录至约1/1,000转录的水平。通常，分离的启动子序列的至少约20个核苷将被用于驱动核苷酸序列的表达。

应当明白，为提高转录水平，将增强子可与本发明的启动子区相结合使用。增强子是起增加启动子区表达作用的核苷酸序列。增强子为本领域所知，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。

本发明的启动子能从其天然编码区的5’区域或5′非翻译区(5′UTR)分离。同样，终止子能从位于其终止密码子侧面的3′区域分离。术语“分离的”指材料，如核酸或蛋白：其(1)基本上或实质上不含在其自然存在的环境中与其正常伴随或相互作用的成分；或(2)如果该材料在其自然环境中，则该材料已被有意的人为干预改变组成，和/或被置于细胞中除了该材料的天然位置外的位置。分离启动子区的方法为本领域所熟知。

先前已公开了玉米ZmCBF1基因的全基因组序列(美国专利申请公开2006/0162027)。玉米CBF1启动子列于SEQ ID NO：1中，长度为1373个核苷酸。玉米CBF2启动子列于SEQ ID NO：2中，长度为2266个核苷酸。

在ZmCBF1或ZmCBF2启动子中所鉴定的基序显示于图1和序列表中。

本发明的启动子区可从任何植物分离，包括，但不局限于玉米(Zeamays)、油菜(甘蓝型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa ssp.)亚种)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotianatabacum)、小米(Panicum spp.)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、蔬菜、观赏植物，以及针叶树。优选地，植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、油菜、小麦、大麦、黑麦、紫花苜蓿和高粱。

来自其他植物的启动子序列，可根据熟知的技术基于它们与本文所列编码序列的同源编码区的序列同源性来分离。在这些技术中，所有或部分已知的编码序列被用作探针，与选定生物的一些克隆的基因组DNA片段(即，基因组文库)中存在的其他序列选择性杂交。核酸序列杂交领域的方法容易获取。核酸杂交的详细指南见Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学和分子生物学实验室技术-核酸探针杂交)，第1部分，第2章，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays(杂交通则概论与核酸探针检测策略)″，Elsevier，NewYork(1993)；以及Ausubel等编辑的Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新规程)，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。

调控序列的“功能变体”也包括在本发明的组合物中。功能变体包括，例如，具有一或多个核苷酸取代、缺失或插入的本发明的天然调控序列，并且在天然启动子具有活性的类似条件下驱动可操作地连接的序列表达。本发明的功能变体可通过定点诱变或诱导突变产生，或作为等位基因的变异体(多态形式)存在。

本文所用的“功能片段”为截短的调控序列，从更大的调控元件通过一或多次缺失形成。例如，可使靠近转录起始位点的启动子5′部分上至TATA框缺失，而不会消除启动子的活性，如Opsahl-Sorteberg，H-G.，wt al.(2004)“Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directingaleruone cell specific expression”Gene 341：49-58所述。这些片段应当保留启动子活性，尤其是驱动应激诱导表达的能力。当使用转录融合物等时，活性测定可通过RNA印迹分析(Northern blot analysis)、报告活性测定方法。参见，例如，Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，在此通过引用并入。

功能片段的获得可通过使用限制性内切酶切割本文所公开的、天然存在的调控元件核苷酸序列；通过天然存在的DNA序列合成核苷酸序列；或通过使用PCR技术获得。具体参见，Mullis et al.，(1987)MethodsEnzymol.155：335-350，以及Erlich，ed.(1989)PCR Technology(PCR技术，Stockton Press，New York)。

例如，去除部分DNA序列的常规路线是，使用核酸外切酶联合DNA扩增产生单向巢式缺失的双链DNA克隆。实现此目的的商品试剂盒以商品名Exo-SizeTM(New England Biolabs，Beverly，Mass.)出售。简言之，该程序需要将核酸外切酶III与DNA一起孵育，以在DNA模板中的5′突出端、平末端或缺口处自3′至5′方向逐渐去除核苷酸。然而，核酸外切酶III不能在3′、4碱基突出端去除核苷酸。使用此酶定时消化克隆产生单向巢式缺失。

整个启动子序列或其部分可用作能与相应启动子序列特异性杂交的探针。为实现在不同条件下的特异性杂交，这些探针包括独特的且长度为优选至少约10个，最优选至少约20个核苷酸的序列。这些探针可用于通过熟知的聚合酶链式反应(PCR)程序从所选的生物扩增相应的启动子序列。该技术可用于从所需生物分离其他启动子序列，或作为确定启动子序列在生物中存在的诊断测定。实例包括平板DNA文库的杂交筛选(菌斑或菌落；参见，例如，Innis et al.，(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications(PCR规程：方法和应用指南)，eds.，AcademicPress)。

本发明所公开的应激诱导调控元件及其变体和片段，当与分离的目标核苷酸序列可操作地连接时，可用于任何植物的基因操作，该序列的表达受到控制以实现所需的表型反应。

“可操作地连接”是指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和介导与第二序列相应的DNA序列的转录。表达盒包括与至少一个目标序列可操作地连接的本发明的调控序列。

在一个典型的实施方案中，在过度表达盒的情况下，可操作地连接指被连接的核苷酸序列是连续的，且如果必须连接两个或更多个蛋白编码区，则在同一个阅读框中是连续的。如果在同一个阅读框中，表达盒含有两个或多个以连续方式连接的蛋白编码区，则编码的多肽在本文中被定义为“异源多肽”或“嵌合肽”或“融合多肽”。该盒可另外含有至少一个额外的待转化入生物的编码序列。或者，可在多个表达盒上提供额外的编码序列。

采用本领域技术人员已知的任何一种途径，可将本发明的调控序列可操作地连接至分离的目标核苷酸序列上。使用美国专利6,187,994所述的位点特异性整合，可将分离的目标核苷酸序列插入基因组的一个位点上，该位点位于本发明启动子的3′端，在此通过引用，将该美国专利的全文并入。

可将本发明的调控元件与用于在植物中表达的分离的目标多核苷酸序列可操作地连接在表达盒上。在调控元件的转录调控下，这样的表达盒提供有多个供目标核苷酸序列插入的限制性位点。

本发明的调控元件可用于指导植物组织中序列的表达。这可通过增加内源或外源产物的表达完成。或者，该结果也可通过降低一或多个内源产物，特别是酶和辅因子的表达完成。该下调可通过本领域技术人员已知的许多途径完成，包括反义、共抑制、利用发夹结构形成或其他途径，并在后文讨论。应当明白，调控元件可与其天然的或其他编码序列一起使用，以增加或降低转化植物或种子中可操作地连接的序列的表达。

本发明目的的目标基因的总类包括，例如，那些涉及信息，如锌指的基因；那些涉及通讯，如激酶的基因；以及那些涉及看家，例如热激蛋白的基因。转基因的更多具体种类，包括编码重要农业经济学性状、抗虫、抗病、抗除草剂及粮食作物特征的基因。另外的转基因种类包括自植物和其他真核生物以及原核生物中诱导外源性产物，如酶、辅因子及激素的基因。

影响粮食作物性状的修饰包括，增加油酸含量，或改变饱及不饱和脂肪酸的水平。同样，可增加蛋白质，特别是提高植物营养价值的修饰的蛋白的水平。这可通过表达氨基酸含量提高的蛋白质完成。

增加种子中赖氨酸和含硫氨基酸的水平，以及改变淀粉类型和含量是期望的。Hordothionin蛋白的修饰描述于1997年4月10日提交的WO9416078、1997年3月26日提交的WO 9638562、1997年3月26日提交的WO 9638563及1997年12月30日授权的美国专利5,703,409号。另一个实例是大豆2S白蛋白编码的富赖氨酸和/或硫根蛋白，其描述于1996年3月20日提交的WO 9735023，及来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106。

农业经济学性状可通过一下来改善：改变在环境应激中影响根、植物或种子生长及发育反应的基因的表达，Cheikh-N，et al.，(1994)PlantPhysiol.106(1)：45-51，以及控制糖代谢降低玉米粒减产的基因的表达，Zinselmeier，et al.，(1995)Plant Physiol.107(2)：385-391。

应当明白，可将任何目标基因，包括天然编码序列，可操作地连接于本发明的调控元件，并在植物中表达。

可与本发明调控元件联合使用的基因类型的实例意在阐释，而非限制。

1.赋予抗虫或抗病的转基因，其编码：

(A)植物抗病基因。植物防御通常被植物抗病基因(R)的产物与病原体中相应的无毒(AVR)基因的产物的相互作用激活。植物品种可以被克隆的抗性基因转化，以便人工改造抵抗特定病原体菌株的植物。参见，例如Jones，et al.，(1994)Science 266：789(克隆抗番茄叶霉(Cladosporiumfulvum)的番茄Cf-9基因)；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432(克隆抗番茄丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)的Pto基因编码蛋白激酶)；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089(抗丁香假单胞菌的拟南芥RSP2基因)；McDowell and Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.21(4)：178-83，以及Toyoda，et al.，(2002)Transgenic Res.11(6)：567-82。抗病植物是一种比野生型植物更耐病原体的植物。

(B)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白，其衍生物或模拟的合成多肽。参见，例如，Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。而且，编码δ-内毒素基因的DNA分子可自美国菌种保藏中心(Rockville，MD)购买，例如，ATCC登录号40098、67136，31995及31998。其他基因工程苏云金芽孢杆菌转基因的实例参见下列专利或专利申请，且为了本发明的目的，将其在此通过引用并入：美国专利5,188,960、5,689,052、5,880,275、PCT申请WO 91/14778、WO99/31248、WO 01/12731、WO 99/24581、WO 97/40162及美国专利申请系列10/032,717、10/414,637及10/606,320。

(C)昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮激素、保幼激素、其变体、其类似物，或其拮抗剂或激动剂。参见，例如，Hammock，et al.，(1990)Nature344：458公开了杆状病毒表达的克隆保幼激素酯酶，其是保幼激素灭活剂。

(D)表达时破坏了受影响的害虫的生理学的昆虫特异肽。例如，参见公开的Regan，(1994)J.Biol.Chem.269：9(表达克隆产出编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt，et al.，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243(an allostatin is identified in Diploptera puntata)；Chattopadhyay，et al.，(2004)Critical Reviews in Microbiology 30(1)：33-54；Zjawiony，(2004)J NatProd 67(2)：300-310；Carlini and Grossi-de-Sa，(2002)Toxicon 40(11)：1515-1539；Ussuf，et al.，(2001)Curr Sci.80(7)：847-853；以及Vasconcelosand Oliveira(2004)Toxicon 44(4)：385-403。也可参见Tomalski等的美国专利5,266,317，其公开了编码昆虫特异性毒素的基因。

(E)负责单萜、倍半萜、类固醇、桂皮酸、苯丙型衍生物或另一个具有杀虫活性的非蛋白分子的超积累的酶。

(F)与生物活性分子的修饰有关的酶，包括翻译后修饰；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂解酶、核酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶，几丁质酶或葡聚糖酶，无论是天然的或合成的。参见，Scott等的PCT申请WO 93/02197，公开了过氧化氢酶基因的核苷酸序列。可以获得含有编码几丁质酶序列的DNA分子，例如，从ATCC登录号39637和67152获得。也可参见，Kramer，et al.，(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.23：691，其讲解了编码钩虫烟草几丁质酶的cDNA的核苷酸序列；以及Kawalleck，et al.，(1993)Plant Molec.Biol.21：673；Kawalleck et al.，(1993)Plant Molec.Biol.21：673，其提供了香菜ubi4-2多聚遍在蛋白基因的核苷酸序；美国专利申请系列10/389,432、10/692,367及美国专利6,563,020。

(G)刺激信号转导的分子。例如，参见Botella，et al.，(1994)PlantMolec.Biol.24：757公开的绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列；及Griess，et al.，(1994)Plant Physiol.104：1467，其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。

(H)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。参见，PCT申请WO95/16776及美国专利5,580,852(公开了抑制植物真菌病原体的鲎素肽衍生物)及PCT申请WO 95/18855和美国专利5,607,914(讲述了赋予抗病性的合成抗微生物肽)。

(I)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂。例如，参见Jaynes，et al.，(1993)Plant Sci.89：43，其公开了抗菌肽-β溶肽类似物的异源表达，产生抗青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)的转基因烟草植物。

(J)病毒侵袭蛋白或由其衍生的复合毒素。例如，通过，在转化的植物细胞中积累病毒外壳蛋白赋予对衍生外壳蛋白基因的病毒以及相关病毒的所招致的抗病毒感染和/或疾病发生。参见，Beachy，et al.，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28：451。赋予转化植物对抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒，烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒外壳蛋白介导的抗性。

(K)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，定向于昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将灭活受影响的酶，杀死昆虫。Cf.，Taylor，et al.，#497摘要，Seventh Int′l Symposium on Molecular Plant-microbe Interactions(第七届国际分子植物微生物相互作用研讨会，Edinburgh，Scotland，1994)(转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶促失活)。

(L)病毒特异性抗体。参见，例如，Tavladoraki，et al.，(1993)，Nature366：469，其证明，表达重组抗体基因的转基因植物免受病毒攻击。

(M)由病原体或寄生虫自发产生的发育抑制蛋白(developmental-arrestive protein)。因此，真菌内切α-1，4D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁高-α-1，4D-半乳糖醛酸酶促进真菌建群和植物营养释放。参见，Lamb，et al.，(1992)Bio/Technology 10：1436。编码抑制豆多聚半乳糖醛酸内切酶蛋白的基因的克隆和表征，由Toubart，et al.，(1992)Plant J.2：367做了描述。

(N)由植物自发产生的发育抑制蛋白。例如，Logemann，et al.，(1992)Bio/Technology 10：305已证明，表达灭活大麦核糖体基因的转基因植物增加了抗真菌病的抗性。

(O)与系统获得性抗性(SAR)反应相关基因和/或发病相关的基因。Briggs，(1995)Current Biology，5(2)：128-131；Pieterse and Van Loon(2004)Curr.Opin.Plant Bio.7(4)：456-64，以及Somssich，(2003)Cell 113(7)：815-6。

(P)抗真菌基因(Cornelissen and Melchers，(1993)Pl.Physiol.101：709-712；Parijs，et al.，(1991)Planta 183：258-264；以及Bushnell，et al.，(1998)Can.J.of Plant Path.20(2)：137-149。也可参见美国专利申请09/950,933。

(Q)脱毒基因，如伏马毒素、白僵菌素、串珠镰刀菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关衍生物的脱毒基因。例如，参见美国专利5,792,931。

(R)半胱氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。参见，美国专利申请10/947,979。

(S)防卫素基因。参见，PCT申请WO 03/000863及美国专利申请系列10/178,213。

(T)赋予线虫抗性的基因。参见，PCT申请WO 03/033651及Urwin，et al.，(1998)Planta 204：472-479；Williamson(1999)Curr Opin Plant Bio.2(4)：327-31。

(U)赋予疫霉根腐病(Phytophthora Root Rot)抗性的基因，如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7及其他Rps基因。参见，例如，Shoemaker，et al.，Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping inSoybean(在大豆中定位的抗疫霉根腐病基因)，Plant Genome IVConference(植物基因组第四次大会)，San Diego，CA(1995)。

(V)赋予大豆茎褐腐病(Brown Stem Rot)抗性的基因，如美国专利5,689,035所述。

2.具有抗除草剂的转基因，如：

(A)能抑制生长点或分生组织的除草剂，如咪唑啉酮类或磺脲类。这类基因的实例编码突变的ALS和果酸类酶，例如，分别参见Lee，et al.，(1988)EMBO J.7：1241；及Miki，et al.，(1990)Theor.Appl.Genet.80：449分别所述。也可参见美国专利5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937及5,378,824；以及PCT申请WO 96/33270。

(B)草甘膦(分别由突变的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物，如草胺磷(草胺膦乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)草胺磷乙酰转移酶(bar)基因)，以及吡啶氧基或苯氧丙酸和环异己酮(cycloshexones)(ACC酶抑制剂编码基因)。参见，例如，Shah等美国专利4,940,835，其公开了一种EPSPS形式的赋予草甘膦抗性的核苷酸序列。Barry等美国专利5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。也可参见，美国专利6,566,587、6,338,961、6,248,876B1、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、；6,225,114、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE 37,287E及5,491,288；以及国际公开EP1173580、WO01/66704、EP1173581及EP1173582。还可将草甘膦抗性赋予表达编码草甘膦氧化还原酶基因的植物，更详细描述于美国专利5,776,760及5,463,175中。此外，可通超过表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因，将草甘膦抗性赋予植物。参见，例如，美国专利申请序号10/427,692。可获取编码突变的aroA基因的DNA分子，为ATCC登录号39256，突变基因的核苷酸序列公开于Comai的美国专利4,769,061。Kumada等的欧洲专利申请0 333 033，及Goodman等的美国专利4,975,374，公开了谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，赋予除草剂如L-草胺磷抗性。草胺磷乙酰转移酶基因的核苷酸序列提供在Leemans等的欧洲专利0242246及0242 236中。De Greef，et al.，(1989)Bio/Technology 7：61，描述了表达嵌合的bar基因的转基因植物产生，该基因编码草胺磷乙酰转移酶活性。也可参见美国专利5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616及5,879,903。赋予苯氧丙酸类及环异己酮抗性，如稀禾定和氟吡甲禾灵的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2及Acc1-S3基因，Marshall，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.83：435对其做了描述。

(C)抑制光合作用的除草剂，如三嗪(psbA和gs+基因)及苯腈(腈水解酶基因)。Przibilla，et al.，(1991)Plant Cell 3：169，描述了以编码突变的psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列公开于Stalker的美国专利4,810,648中，含有这些基因的DNA可以根据ATCC登录号53435、67441及67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达，描述于Hayes，et al.，(1992)Biochem.J.285：173中。

(D)乙酰羟酸合酶，已发现其产生表达该酶的多种除草剂抗性的植物，已被引入多种植物(参见，例如，Hattori，et al.，(1995)Mol Gen Genet246：419)。赋予除草剂抗性的其他基因包括，编码鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota，etal.，(1994)Plant Physiol.106：17)，谷胱甘肽还原酶及超氧化物歧化酶的基因(Aono，et al.，(1995)Plant Cell Physiol 36：1687，以及各种磷酸转移酶的基因(Datta，et al.，(1992)Plant Mol Biol 20：619)。

(E)原卟啉原氧化酶(protox)对叶绿素的产生是必要的，是所有植物生存所必需的。protox酶为各种除草剂化合物的靶标。这些除草剂也抑制所有不同品种植物质的生长，造成其彻底摧毁。开发含有改变的protox活性的植物，其能抗这些除草剂，描述于美国专利6,288,306、6,282,837及5,767,373及国际申请WO 01/12825中。

3.赋予或有助于改变的粮食作物特征的转基因，如：

(A)改变的脂肪酸，例如，通过

(1)下调硬酯酰-ACP去饱和酶，增加植物的硬脂酸含量。参见，Knultzon，et al.，(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89：2624及PCT申请WO 99/64579(改变谷物脂质特征的去饱和酶基因)，

(2)通过FAD-2基因修饰增加油酸和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸。(参见美国专利6,063,947、6,323,392、6,372,965及PCT申请WO 93/11245)，

(3)改变共轭的亚麻酸或亚油酸的含量，如PCT申请WO01/12800，

(4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1ps，各种lpa基因，如lpa1、lpa3，hpt或hggt。例如，参见PCT申请WO 02/42424，WO98/22604、WO 03/011015、美国专利6,423,886、美国专利6,197,561、美国专利6,825,397、美国专利申请公开2003/0079247、美国专利申请公开2003/0204870、PCT申请WO 02/057439、WO 03/011015及Rivera-Madrid，et al.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：5620-5624。

(B)改变的磷含量，例如，通过

(1)引入植酸酶编码基因。这将增加植酸裂解，使转化的植物增加更多的游离磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt，et al.，(1993)Gene 127：87，其公开了黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因的核苷酸序列。

(2)上调降低植酸含量的基因。在玉米中，例如，这一点的完成可通过克隆，然后重新引入与一个或多个在玉米突变体中所鉴定的等位基因如LPA有关的DNA，所述玉米突变体的特征是低水平的植酸，如在Raboy，et al.，(1990)Maydica 35：383中，和/或通过改变肌醇激酶活性，如PCT申请WO 02/059324、美国专利申请公开2003/0009011、PCT申请WO 03/027243、美国专利申请公开2003/0079247、PCT申请WO99/05298、美国专利6,197,561、美国专利6,291,224、美国专利6,391,348、PCT申请WO 2002/059324、美国专利申请公开2003/0079247、PCT申请WO 98/45448、WO 99/55882、WO 01/04147。

(C)改变的糖，例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因或硫氧还蛋白的基因所致。(参见美国专利6,531,648)。参见，Shiroza，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：810(变形链球菌(Streptococcus mutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz，et al.，(1985)Mol.Gen.Genet.200：220(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen，et al.，(1992)Bio/Technology 10：292(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的产生)；Elliot，et al.，(1993)Plant Physiol.102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)；

et al.，(1993)J.Biol.Chem.268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点突变)；及Fisher，et al.，(1993)PlantPhysiol.102：1045(胚乳玉米淀粉分支酶II)，WO申请99/10498(通过改性UDP-D-木糖4-异构酶、Fragile 1及2、Ref1、HCHL和C4H提高消化率和/或淀粉提取)；美国专利6,232,529(通过改变淀粉水平生产高油种子的方法(AGP))。通过淀粉和油的通路的相互关系，上述脂肪酸修饰基因也可用于影响淀粉含量和/或组成。

(D)改变的抗氧化剂含量或组成，如维生素E或生育三烯酚的改变。例如，参见美国专利6,787,683、美国专利申请公开2004/0034886及PCT申请WO 00/68393，涉及通过改变phytl异戊二烯基转移酶(ppt)操作抗氧化剂水平，WO申请03/082899通过改变尿黑酸香叶基转移酶(hggt)。

(E)改变的必需的种子氨基酸。例如，参见美国专利6,127,600(在种子中增加必需氨基酸累积的方法)、美国专利6,080,913(在种子中增加必需氨基酸累积的二元方法)、美国专利5,990,389(高赖氨酸)、PCT申请WO 99/40209(改变种子中氨基酸的组成)、PCT申请WO 99/29882(改变蛋白中氨基酸含量的方法)、美国专利5,850,016(改变种子中氨基酸的组成)、PCT申请WO 98/20133(具有高水平必需氨基酸的蛋白质)、美国专利5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利5,885,801(高苏氨酸)、美国专利6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利6459019(增加的赖氨酸和苏氨酸)、美国专利6,441,274(植物色氨酸合成酶β亚基)、美国专利6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利5,939,599(高硫)、美国专利5,912,414(增加的甲硫氨酸)、PCT申请WO 98/56935(植物氨基酸生物合成酶)、PCT申请WO 98/45458(具有较高必需氨基酸比例的工程种子蛋白)、PCT申请WO 98/42831(增加的赖氨酸)、美国专利5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利5,559,223(有明确结构的合成贮藏蛋白，其中含有程控水平的改善植物营养价值的必需氨基酸)、PCT申请WO96/01905(增加的苏氨酸)、PCT申请WO 95/15392(增加的赖氨酸)、美国专利申请公开2003/0163838、美国专利申请公开2003/0150014、美国专利申请公开2004/0068767、美国专利6,803,498、PCT申请WO 01/79516以及PCT申请WO 00/09706(Ces A：纤维素酶)，美国专利6,194,638(半纤维素)、美国专利6,399,859及美国专利申请公开2004/0025203(UDPGdH)、美国专利6,194,638(RGP)。

4.控制雄性不育的基因

有几种可用的赋予遗传性雄性不育的方法，例如在基因组中的分离位点处的赋予雄性不育特性的多重突变基因，如Brar等公开的美国专利4,654,465与4,727,219，以及如Patterson在美国专利3,861,709与3,710,511号中所描述的染色体易位。除了这些方法之外，Albertsen等的美国专利5,432,068，描述了细胞核雄性不育系统，其包括确定雄性不育的关键基因；使此对雄性不育关键的天然基因沉默；从必要的雄性不育基因中除去天然启动子并以诱导型启动子取代它；将此基因工程基因插回植物中；这样就因为诱导型启动子未“开启”，导致雄性不育基因不被转录。通过诱导或开启启动子恢复生育能力，相应地，允许雄性不育的基因被转录。

(A)在绒毡层特异性表达启动子控制下及应用化学的N-Ac-PPT(PCT申请WO 01/29237)下引入脱乙酰基酶基因。

(B)引入雄蕊特异性启动子(PCT申请WO 92/13956、WO 92/13957)。

(C)引入barnase及barstar基因(Paul，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.19：611-622)。

关于细胞核雄性不育及雌性不育系统及基因的其他实例，也可参见美国专利5,859,341、美国专利6,297,426、美国专利5,478,369、美国专利5,824,524、美国专利5,850,014及美国专利6,265,640。

5.为位点特异性DNA整合创建位点的基因

这包括引入FRT位点，其可用于FLP/FRT系统，和/或Lox位点，其可用于Cre/Loxp系统。例如，参见Lyznik，et al.，(2003)Plant Cell Rep 21：925-932及PCT申请WO 99/25821，在此将其通过引用并入。其他可用的系统，包括在Mu噬菌体的Gin重组酶(Maeser，et al.，(1991)Mol Gen Genet.230(1-2)：170-6)；Vicki Chandler，The Maize Handbook(玉米手册)ch.118(Springer-Verlag 1994)，大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto，et al.，1983)及pSR1质粒的R/RS系统(Araki，et al.，(1992)J Mol Biol.225(1)：25-37)。

6.影响抗非生物应激的基因(包括但不限于调控开花、抽穗和种子发育，提高氮的利用效率，改变的氮反应，抗旱性和耐旱性，抗寒性或耐寒性，和抗盐性或耐盐性)和在应激之下增加产量。

例如，参见PCT申请WO 00/73475，其中通过改变苹果酸盐改变水的利用效率；美国专利5,892,009、美国专利5,965,705、美国专利5,929,305、美国专利5,891,859、美国专利6,417,428、美国专利6,664,446、美国专利6,706,866、美国专利6,717,034、美国专利6,801,104、PCT申请WO2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 98/09521及WO 99/38977描述的基因，包括CBF基因及有效地缓解冰冻、高盐度和干旱对植物的负面影响以及对植物表型赋予其他积极影响的转录因子；美国专利申请公开2004/0148654及PCT申请WO 01/36596，其中脱落酸在植物中的改变，导致植物表型改善，如增加产量和/或增加非生物应激耐性；PCT申请WO 2000/006341、WO 04/090143、美国专利申请系列10/817483及09/545,334，其中细胞分裂素的表达被改变导致植物增加应激耐性，如耐旱性和/或增加产量。也可参见，PCT申请WO 02/02776、WO 2003/052063、JP 2002281975、美国专利6,084,153、PCT申请WO 0164898、美国专利6,177,275及美国专利6,107,547(增加氮利用和改变氮反应)。关于乙烯改变，参见美国专利申请公开2004/0128719、美国专利申请公开2003/0166197及PCT申请WO 2000/32761。关于非生物应激的植物转录因子或转录调控子，参见，例如，美国专利申请公开2004/0098764或美国专利申请公开2004/0078852.

可以向植物引入或导入影响植物生长和农艺性状的其他基因和转录因子，所述农艺性状如产量、开花、植物生长和/或植物的结构、植物养分的吸收，特别是植物氮的吸收，氮的利用效率；耐旱性和水分利用效率；根强度，根的抗倒性；土壤虫害控制，玉米根虫抗性，参见，例如，PCT申请WO 97/49811(LHY)、WO 98/56918(ESD4)、WO 97/10339及美国专利6,573,430(TFL)、美国专利6,713,663(FT)、PCT申请WO96/14414(CON)、WO 96/38560、WO 01/21822(VRN1)、WO00/44918(VRN2)、WO 99/49064(GI)、WO 00/46358(FRI)、WO 97/29123、美国专利6,794,560，6,307,126(GAI)、PCT申请WO 99/09174(D8及Rht)，以及WO 2004/076638及WO 2004/031349(转录因子)。

通过基因表达可以创建植物的商业性状，所述基因改变用于产生纸张、纺织品、乙醇，聚合物或其他工业用途材料的淀粉或蛋白质。

增加或抑制蛋白的手段为本领域技术人员众所周知，例如，可包括，转基因表达；反义抑制；共抑制方法，包括但不限于：RNA干扰、使用转录因子和/或阻遏物激活或抑制基因；诱变包括转座子标签，定向和定点突变；染色体工程(参见Nobrega，et.al.，(2004)Nature 431：988-993)，同源重组；TILLING(靶向诱导的基因组局部病变；McCallum，et al.，(2000)Nature Biotechnol.18：455-457)，操作蛋白表达的生物合成竞争。

基因沉默的许多技术为本领域技术人员众所周知，包括但不限于敲除，如插入转座子元件如Mu，Vicki Chandler，The Maize Handbook(玉米 手册)ch.118(Springer-Verlag 1994)或其他遗传元件，如FRT、Lox或其他位点特异性整合位点；RNA干扰(Napoli，et al.，(1990)Plant Cell 2：279-289；美国专利5,034,323，Sharp(1999)Genes Dev.13：139-141，Zamore，et al.，(2000)Cell 101：25-33；及Montgomery，et al.，(1998)PNAS USA 95：15502-15507)；病毒诱导的基因沉默(Burton，et al.，(2000)Plant Cell 12：691-705，以及Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.2：109-113)；靶向RNA特异性核酶(Haseloff，et al.，(1988)Nature 334：585-591)；发夹结构(Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320；PCT申请WO 99/53050；及WO 98/53083)；小分子核糖核酸Micro RNA(Aukerman and Sakai(2003)Plant Cell15：2730-2741)；核酶(Steinecke，et al.，(1992)EMBO J.11：1525，以及Perriman，et al.，(1993)Antisense Res.Dev.3：253)；寡核苷酸介导的定向修饰(例如，PCT申请WO 03/076574及WO 99/25853)；锌指纹定向分子(例如，PCT申请WO 01/52620、WO 03/048345及WO 00/42219)；及本领域技术人员所知的其他方法或上述方法的组合。

任何增加或抑制蛋白的方法可用于本发明。下面详细说明的实施例仅为阐释的目的。

此处公开的与调控元件可操作地连接的核苷酸序列可为定向基因的反义序列。(参见例如，Sheehy，et al.，(1988)PNAS USA 85：8805-8809；及美国专利5,107,065、5,453,566及5,759,829)。所谓“反义序列”是指与该核苷酸序列的5′至3′正常方向反向的序列。当送递入植物细胞时，反义DNA序列的表达阻止定向基因的DNA核苷酸序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的RNA转录物可与定向基因的DNA核苷酸序列转录所产生的内源信使RNA(mRNA)互补并能杂交。在这种情况下，抑制定向基因所编码的天然蛋白的产生，达到所需的表型反应。因此，本文所公开的调控序列可与反义DNA序列可操作地连接，以减少或抑制植物中天然蛋白的表达。

如上所述，影响植物中蛋白表达的其他潜在方法包括，传统的共抑制，即通过表达转化引入的相同结构的基因或基因片段，抑制内源基因的表达(Goring，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad Sci.USA 88：1770-1774共抑制；Taylor(1997)Plant Cell 9：1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12)：340-344；Flavell(1994)PNAS USA 91：3490-3496；Finnegan，et al.，(1994)Bio/Technology 12：883-888；及Neuhuber，et al.，(1994)Mol.Gen.Genet.244：230-241)。在一个实例中，共抑制的完成可通过将启动子连接至DNA片段，以致片段的转录产物沿正义方向，其中，转录产物与内源目标基因的转录产物至少有65％序列同一性，由此抑制内源基因在所述植物细胞的表达(参见美国专利5,283,184)。靶向共抑制的内源基因可为编码目标植物品种中累积的任何蛋白的基因。例如，其中，靶向共抑制的内源基因可为50kDγ-玉米醇溶蛋白基因，共抑制是使用包含50kD的γ-玉米醇溶蛋白基因序列或其变体或片段的表达盒完成的。

其他的抑制方法为本领域已知，也同样可用于本发明。这些方法包括使用剪接的发夹RNA沉默定向基因，类似的方法也称为RNA干扰及启动子沉默(参见Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320，Waterhouse andHelliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Waterhouse，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964；Chuang and Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Phystiol.129：1723-1731；及PCT申请WO 99/53050、WO 99/49029、WO 99/61631、WO 00/49035及美国专利6,506,559)。

对于miRNA干扰，将表达盒设计为表达以内源基因为模板的RNA分子。该miRNA分子编码能够形成发夹结构的RNA，该RNA含有与内源基因(靶序列)互补的22个核苷酸的序列。miRNA分子高效抑制内源基因的表达，且它们诱导的RNA干扰为后代植物继承。

在一个实施方案中，待引入植物的核苷酸包含抑制序列，该抑制序列编码与基因接合的锌指纹蛋白，导致基因表达降低。在具体实施方案中，锌指纹蛋白与本发明的调控区结合。在其他实施方案中，锌指纹蛋白与编码蛋白的信使RNA结合，并阻止其翻译。选择锌指蛋白所靶向的位点的方法描述于，例如，美国专利号6453242中，使用锌指蛋白抑制植物基因表达的方法描述于，例如，美国专利申请公开2003/0037355中。

表达盒也可包括在分离的目标核苷酸序列的3’端，即在植物中起作用的转录和翻译终止区。该终止区与本发明的启动子核苷酸序列同源，可与目标DNA序列同源，或者为其他来源。

任何方便的终止区可与本发明的启动子结合使用，并可从农杆菌(A.tumefaciens)Ti-质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也可参见Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon，et al.，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen，etal.，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151-158；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

该表达盒可另行含有5′前导序列。这些前导序列可提高翻译。翻译前导序列在本领域内是已知的，包括：细小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)，Elroy-Stein，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130；马铃薯Y病毒属(potyvirus)前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)，Allison，et al.，(1986)″The NucleotideSequence of the Coding Region of Tobacco Etch Virus Genomic RNA：Evidence for the Synthesis of a Single Polyprotein″，Virology 154：9-20；MDMV leader(玉米矮化花叶病毒(Dwarf Mosaic Virus))；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak，et al.，(1991)Nature 353：90-94；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV RNA 4)，Jobling，et al.，(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，Gallie，et al.，(1989)Molecular Biology of RNA，237-256；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)，Lommel，et al.，(1991)Virology 81：382-385。也可参见Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiology 84：965-968。表达盒也可含有提高翻译和/或mRNA稳定性的序列，如内含子。

在期望具有针对特定细胞器，特别是质体(plastid)，淀粉质体，或针对内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的分离核苷酸的表达产物的情况下，表达盒还可包含转运肽的编码序列。这些转运肽为本领域众所周知，包括但不限于：酰基载体蛋白转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶等。

在制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以提供合适方向的DNA序列，如果合适，提供于合适阅读框中。为此，可采用接头或连接子连接DNA片段，或伴随其他操作提供方便的限制位点，去除多余的DNA，去除限制位点等。为此，可涉及体外诱变、引物修复、限制消化、退火，及置换如转换和颠换。

如此处所述，本发明提供了能在本发明调控元件的控制下，表达目标基因的载体。一般而言，载体应该在植物细胞中起作用。有时，可优选在大肠杆菌中起作用的载体(如生成提高抗体的蛋白、DNA序列分析、构建插入片段，获取大量核酸)。在大肠杆菌中克隆和表达的载体和方法讨论于Sambrook等所述(同上)。

包含与表达盒中分离的核苷酸序列可操作地连接的本发明调控序列的转化载体，也可含有至少一个待转化入生物的基因的其他核苷酸序列。或者，将另外的序列提供给另一个转化载体。

在植物中起作用的载体可以是来自农杆菌(Agrobacterium)的二元质粒。这些载体能够转化植物细胞。这些载体包括为整合入宿主(植物)染色体所要求的左右边界序列(border sequence)。至少，在本发明调控元件的控制下的待表达的基因位于这些边界序列之间。在一个实施方案中，也包括可选择标记物和报告基因。为便利地获得足够量的载体，可使用允许在E.coli中复制的细菌来源。

报告基因可包括于转化载体中。本领域已知的适宜的报告基因的实例可见于，例如，Jefferson等(1991)在Gelvin等编辑的Plant Molecular Biology Manual(植物分子生物学手册)(Kluwer Academic Publishers)中，页码1-33；DeWet，et al.，(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737；Goff，et al.，(1990)EMBO J.9：2517-2522；Kain，et al.，(1995)BioTechniques 19：650-655；以及Chiu，et al.，(1996)Current Biology 6：325-330。

选择转化细胞或组织的可选择标记基因可包括于转化载体中。这些可包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的可选择标记基因的实例包括但不限于编码下述物质抗性的基因：氯霉素，Herrera Estrella，etal.，(1983)EMBO J.2：987-992；甲氨蝶呤，Herrera Estrella，et al.，(1983)Nature 303：209-213；Meijer，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820；潮霉素，Waldron，et al.，(1985)Plant Mol.Biol.5：103-108；Zhijian，et al.，(1995)Plant Science 108：219-227；链霉素，Jones，et al.，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91；大观霉素，Bretagne-Sagnard，et al.，(1996)TransgenicRes.5：131-137；博莱霉素，Hille，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176；磺酰胺，Guerineau，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136；溴苯腈，Stalker，et al.，(1988)Science 242：419-423；草甘膦，Shaw，et al.，(1986)Science 233：478-481；草胺膦，DeBlock，et al.，(1987)EMBO J.6：2513-2518。

此外，当将本发明的启动子与编码可检测蛋白的核苷酸连接时，连接序列的应激诱导表达可被示踪，从而提供有用的所谓可筛选的或可检测的标记物。无需破坏组织即可检测到连接蛋白的表达。最近，使用可筛选的或可检测的标记物的兴趣增加了。举实例而非限制，启动子可与可检测的标记物连接，标记物包括β-葡糖醛酸糖苷酶，或uidA基因(GUS)，多种生色物质因其编码的酶而知名(Jefferson，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8447-8451)；氯霉素乙酰转移酶；碱性磷酸酶；R-locus基因，其编码的产物调控植物中花色苷色素(红色)的生成(Dellaporta等(1988)在Appels及Gustafson编辑的Chromosome Structure and Function(染色体结构与功能)，Kluwer Academic Publishers中，页码263-282；Ludwig，et al.，(1990)Science 247：449)；p-内酰胺酶基因(Sutcliffe，(1978)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.75：3737)，多种生色物质因其编码的酶而知名(例如，PADAC，一种生色的头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky，et al.，(1983)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.80：1101)，其编码可转化生色的邻苯二酚的邻苯二酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta，et al.，(1990)Biotech.8：241)；酪氨酸酶基因(Katz，et al.，(1983)J.Gen.Microbiol.129：2703)，其编码能够氧化酪氨酸为DOPA及多巴醌的酶，多巴醌随后缩合形成易于检测的化合物黑色素，绿色荧光蛋白(GFP)基因(Sheen，et al.，(1995)PlantJ.8(5)：777-84)；lux基因，其编码荧光素酶，荧光素酶的存在可使用，例如，X光片、闪烁计数、荧光光度法、低光摄像机、光子计数相机或多孔发光测定(Teeri，et al.，(1989)EMBO J.8：343)；DS-RED EXPRESS(Matz，et al.，(1999)Nature Biotech.17：969-973，Bevis，et al.，(2002)NatureBiotech 20：83-87，Haas，et al.，(1996)Curr.Biol.6：315-324)；显更亮荧光的工程棕绿纽扣珊瑚(Zoanthus sp.)黄色荧光蛋白(ZsYellow)(Matz，et al.，(1999)Nature Biotech.17：969-973，可购于BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA，USA，catalog no.K6100-1)；及青色荧光蛋白(CYP)(Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117：943-54及Kato，et al.，(2002)Plant Physiol 129：913-42)。

包括本发明具体调控序列的转化载体，可用于转化任何植物，所述调控序列在表达盒中可操作地连接于分离的目标多核苷酸序列。转基因植物、植物细胞及植物组织等可以这种方式获得。转化规程依赖于靶向转化的植物或植物细胞类型即单子叶植物或双子叶植物而不同。合适的转化植物细胞的方法包括显微注射，Crossway，et al.，(1986)Biotechniques4：320-334；电击，Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606；农杆菌介导的转化，参见例如，Townsend等，美国专利5,563,055；直接的基因转移，Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722；及弹道粒子加速，参见例如，Sanford等，美国专利4,945,050，Tomes等，(1995)在Gamborg和Phillips编辑的Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods(植物细胞，组织及器官培养基：基本方法)(Springer-Verlag，Berlin)中；及McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926。也可参见，Weissinger，et al.，(1988)Annual Rev.Genet.22：421-477；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Datta，et al.，(1990)Bio/Technology 8：736-740(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839；Hooydaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Liliaceae)；De Wet等(1985)在G.P.Chapman等编辑的The Experimental Manipulation of Ovule Tissues(胚珠组织实验操作)(Longman，New York)，页码197-209(pollen)中；Kaeppler，et al.(1990)Plant Cell，Reports 9：415-418；及Kaeppler，et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；D.Halluin，et al.(1992)Plant Cell，4：1495-1505(电击)；Li，et al.(1993)Plant Cell，Reports 12：250-255及Christou，et al.(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda，et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米经由农杆菌)。

已转化的细胞可根据传统的方法生长于植物中。参见，例如McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可将这些植物生长，并以同样转化株或不同株授粉。然后鉴定生成的具有应激诱导表达的期望表型特征的植物。可生长二代或多代以确保应激诱导表达的期望表型特征是稳定地保持和继承。

下述实施例用于阐释而非以任何方式进行限制。

实施例

因为ZmCBF1和ZmCBF2编码区先前已经分离，5’调控区经由GenomeWalker^TM(Clontech)自玉米中分离并克隆。分离的启动子区域的顺式元件分析并与拟南芥及水稻CBF启动子比较。

以粒子轰击转化玉米

以质粒轰击来自温室供体植物的不成熟玉米胚，该质粒含有表达盒，表达盒包含与目标基因可操作地连接的ZmCBF1或ZmCBF2启动子。质粒还包含可选择的赋予抗双丙氨磷的标记基因，例如PAT(Wohlleben，etal.，(1988)Gene 70：25-37)。或者，将该可选择标记物基因提供在不同的质粒上。转化操作进行如下。培养基配方如下。

去除穗，表面以30％漂白剂+0.5％Micro洗涤剂洗涤20分钟消毒，以无菌水漂洗2次。切除不成熟胚，将胚轴向下(胚盘向上)，25个胚置于一平板，置于560Y培养基5小时，然后排列在2.5cm靶区内准备轰击。

制备质粒载体，其包含与目标基因可操作连接的ZmCBF1或ZmCBF2启动子序列。将该质粒DNA及含有PAT可选择标记物的质粒DNA沉淀在1.1μm(平均直径)小钨球上，使用如下的CaCl₂沉淀方法：100μl制备的钨颗粒水悬液、10μl(1μg)DNA Tris EDTA缓冲液(1μg总DNA)、100μl 2.5M CaCl₂和10μl 0.1M亚精胺。

在多试管涡旋器保持涡旋时，顺序地将各试剂加入至钨颗粒悬液中。将最终混合物简单超声，并在保持涡旋下孵育10分钟。沉淀完毕后，将离心管简单离心，去除液体，以500ml 100％乙醇洗涤，并离心30秒。再去除液体，将105μl 100％乙醇添加到最终的小钨球上。为了粒子枪轰击，将钨/DNA颗粒简单超声，然后取10μl涂到每个大载体中心，在轰击前干燥约2分钟。

将样品平板接受HE35-1或HE35-2号粒子枪的5级水平轰击。所有样本在650PSI接受一次射击，制备的每管颗粒/DNA共计10份等分试样。

轰炸后，将胚置于560Y培养基2天，然后转移至含有3毫克/升除草剂的选择培养基560R，且每2周传代培养。经过大约10周的选择，将耐选择愈伤组织克隆转移到288J培养基中开始植株再生。体细胞胚成熟后(2-5周)，将发育良好的体细胞胚转移至发芽培养基中，并转移光照培养室。大约7-10天后，将发育苗转移至272V中无激素培养基管中7-10天，直到幼苗长定。然后将植物转移至包含盆栽土壤的平板窝中(相当于2.5“盆)，并在生长室中生长一周，随后再在温室中生长1-2周，然后转移至标准的600盆(1.6加仑)并长至成熟。在不同条件下监测植物并评分，并与对照组植物比较。观察标记基因表达以确认转化。监测表型变化，反映目标基因的表达。

轰击培养基(560Y)包含5.0克/升N6碱式盐(SIGMA C-1516)、1.0毫升/升Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5毫克/升盐酸硫胺素、120.0克/升蔗糖、1.0毫克/升2，5-D及2.88克/升L-脯氨酸(以KOH将pH值调5.8后使用D-I水定容)；2.0克/升

胶凝剂(使用D-I水定容后加入)；和8.5毫克/升硝酸银(将培养基灭菌并冷至室温后加入)。选择培养基(560R)包含5.0克/升N6碱性盐(SIGMA C-1516)、1.0毫升/升Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5毫克/升盐酸硫胺素、30.0克/升蔗糖和2.0毫克/升2，5-D(以KOH将pH值调至5.8后使用D-I水定容)；3.0克/升胶凝剂(使用D-I水定容后加入)和0.85毫克/升硝酸银和3.0毫克/升除草剂双丙氨磷(将培养基灭菌并冷至室温后加入)。

植物再生培养基(288J)包含5.3克/升MS盐(GIBCO 11117-075)、5.0毫升/升MS维生素储备液(0.100克烟酸、0.02克/升盐酸硫胺素、0.10克/升盐酸吡哆醇和0.50克/升甘氨酸，以精制的D-I水定容)(Murashige andSkoog(1962)Physiol.Plant.15：573)、100毫克/升肌醇、0.5毫克/升玉米素、60克/升蔗糖和1.0毫升/0.1mM脱落酸(调pH值5.6后使用精制D-I水定容)；3.0克/升

胶凝剂(使用D-I水定容后加入)；和1.0毫克/升吲哚乙酸和3.0毫克/升除草剂双丙氨磷(灭菌培养基并冷至60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含5.3克/升MS盐(GIBCO 11117-075)、5.0毫升/升MS维生素储备液(0.100/升烟酸、0.02克/升盐酸硫胺素、0.10克/升盐酸吡哆醇，和0.50克/升甘氨酸，以精制D-I水定容)、0.1克/升肌醇，和50.0克/升蔗糖(将pH值调至5.6后使用精制D-I水定容)；和6克/升BactoTMAgar琼脂固化剂(使用D-I水定容后加入)，灭菌并冷却到60℃。

实施例2：通过农杆菌转化及再生玉米愈伤组织

用可操作地连接至目标基因的ZmCBF1或ZmCBF2启动子序列(SEQID NO：1或2)进行玉米的农杆菌介导转化，采用赵(Zhao)的方法(美国专利5981840、PCT专利公开WO98/32326，在此将其通过引用并入)。将不成熟的胚培养在带有选择试剂的固体培养基上，导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生为植物，并将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上培养，再生为植物。

与合适的对照植物对比，监测植物调控表型。

农杆菌转化的细节载于下文，或为本领域技术人员已知。

农杆菌悬液的制备

从-80℃冷冻的等分试样中将农杆菌移取至含有PHI-L培养基的平板上，在黑暗中28℃培养3天。PHI-L培养基包含25毫升/升储备液A、25毫升/升储备液B、450.9毫升/升储备液C和大观霉素(Sigma Chemicals)，将其无菌ddH2O中加至50毫克/升的浓度(储备液A：K₂HPO₄ 60.0克/升，NaH₂PO₄ 20.0克/升，以KOH水溶液将pH值调至7.0，高压灭菌；储备液B：NH₄Cl 20.0克/升，MgSO₄.7H₂O 6.0克/升，KCl 3.0克/升，CaCl₂ 0.20克/升，FeSO₄.7H₂O 50.0毫克/升，高压灭菌；储备液C：葡萄糖5.56克/升，琼脂16.67克/升(#A-7049，Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，高压灭菌)。

该平板可存放在4℃，通常使用约1个月。从主平板挑选单个菌落，移取至含有PHI-M培养基[酵母提取物(Difco)5.0克/升、蛋白胨(Difco)10.0克/升；氯化钠5.0克/升；琼脂(Difco)15.0克/升，pH值6.8，含有50毫克/升大观霉素]的平板上，在黑暗中28℃孵育2天。

将5毫升PHI的碱性培养基PHI-A[CHU(N6)碱式盐(Sigma C-1416)4.0克/升，Eriksson维生素组合物(1000X，Sigma-1511)1.0ml/l；盐酸硫胺素0.5毫克/升(Sigma)；2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D，Sigma)1.5毫克/升；L-脯氨酸(Sigma)0.69克/升；蔗糖(Mallinckrodt)68.5克/升；葡萄糖(Mallinckrodt)36.0克/升；pH 5.2]，或PHI的组合培养基体系PHI-I[MS盐(GIBCO BRL)4.3克/升；烟酸(Sigma)0.5毫克/升；盐酸吡哆醇(Sigma)0.5毫克/升；盐酸硫胺素1.0毫克/升；肌醇(Sigma)0.10克/升；维生素分析酪蛋白水解物(Difco Lab)1克/升；2，4-D 1.5毫克/升；蔗糖68.50克/升；葡萄糖36.0克/升；以KOH水溶液将pH值调至5.2，然后过滤灭菌]，以及5ml 100mM(3′-5′-二甲氧基-4′-羟基乙酰苯酮，Aldrich chemicals)加入至14毫升带帽锥形管(Falcon tube)。从平板上收集约3满环(环为5毫米大小)的农杆菌，悬浮于管中，然后将管涡旋得均匀悬液。将1毫升悬液转移到分光光度管中，在550nm下，对于农杆菌的浓度为约0.5×10⁹个/毫升浓度至1×10⁹个/毫升而言，通过多加农杆菌或多加相同的培养基悬液，将悬液的OD值调整为0.72。将最终的农杆菌悬液等分至2毫升微量离心管中，每个离心管含有1毫升悬液。然后将悬液尽快使用。

胚分离、感染及共培养

将约2毫升用于农杆菌悬液的相同培养基(这里指PHI-A或PHI-I)，加入至2毫升的微量离心管中。将未成熟胚使用无菌刮刀(Baxter ScientificProducts S1565)自灭菌穗中分离，并直接滴入管内的培养基中。将共计约100个胚置于管中。胚的最佳大小约为1.0-1.2毫米。然后关上管盖，使用涡旋搅拌器(Baxter Scientific Products S8223-1)将管以最大的速度涡旋5秒钟。去除培养基，加入2毫升新鲜培养基并重复涡旋。吸出所有的培养基，将1毫升农杆菌悬液加入至胚中，将管涡旋30秒。将管带盖静置5分钟。将农杆菌悬液和胚倒入皮氏平板(Petri plate)中，该平板中含有PHI的碱性培养基PHI-B[CHU(N6)碱式盐(Sigma C-1416)4.0克/升；Eriksson维生素混合物(1000X，Sigma-1511)1.0ml/l；盐酸硫胺素0.5毫克/升；2.4-D1.5毫克/升；L-脯氨酸0.69克/升；硝酸银0.85毫克/升；

胶凝剂(Sigma)3.0克/升；蔗糖30.0克/升；乙酰丁香酮100mM；pH 5.8]，或者PHI的组合培养基体系PHI-J[MS盐4.3克/升；烟酸0.50毫克/升；盐酸吡哆醇0.50毫克/升；盐酸硫胺素1.0毫克/升；肌醇100.0毫克/升；2，4-D1.5毫克/升；蔗糖20.0克/升；葡萄糖10.0克/升；L-脯氨酸0.70克/升；MES(Sigma)0.50克/升；8.0克/升琼脂(Sigma A-7049，纯化)以及100mM乙酰丁香酮，最终pH为5.8。使用无菌刮刀将任何留在管中的胚转移至平板上。将农杆菌悬液抽出，使胚轴在培养基中向下。使用封口膜或Pylon植物组合带Vegetative Combine Tape(产品命名为“E.G.CUT”，每部分可用长度18毫米×50米；Kyowa Ltd.，Japan)，将平板封口，在黑暗中23-25℃孵育约3天，进行共培养。

过渡、选择和再生步骤

对于过渡步骤，将所有胚转移至一个新平板中，其中含有PHI-C培养基[CHU(N6)碱式盐(Sigma C-1416)4.0克/升；Eriksson维生素混合物(1000X Sigma-1511)1.0ml/l；盐酸硫胺0.5毫克/升；2.4-D 1.5毫克/升；L-脯氨酸0.69克/升；蔗糖30.0克/升；MES缓冲液(Sigma)0.5克/升；琼脂(Sigma A-7049，纯化)8.0克/升；硝酸盐0.85毫克/升；青霉素100毫克/升；pH 5.8]，将平板以

带或Pylon带封口，在黑暗中28℃培养约3-5天。

缺少过渡步骤可能需要较长的共培养期，因为过渡步骤，类似共培养步骤，为胚胎提供一段时间的无选择试剂培养。本领域一般技术人员可容易地测试共培养和过渡次数的组合，以优化或改善转化。

为了选择，然后将所有的胚胎从PHI-C培养基中转移至新平板中，该新的平板含有作为选择培养基的PHI-D培养基[CHU(N6)碱式盐(SIGMAC-1416)4.0克/升；Eriksson维生素混合物(1000X，Sigma-1511)1.0ml/l；盐酸硫胺0.5毫克/升；2.4-D 1.5毫克/升；L-脯氨酸0.69克/升；蔗糖30.0克/升；MES缓冲液0.5克/升；琼脂(Sigma A-7049，purified)8.0克/升；硝酸盐0.85毫克/升；青霉素(ICN，Costa Mesa，CA)100毫克/升；双丙氨磷(Meiji Seika K.K.，Tokyo，Japan)1.5毫克/升培养最初两周，然后剩余时间以3毫克/升培养；pH值5.8]，每个平板约20个胚。

将平板如上述密封，并在黑暗中28℃培养前两周的选择。以两周的时间间隔，将胚转移至新的选择培养基上。将组织转移至新鲜的选择培养基中进行共约2个月传代培养。然后将该抗除草剂的愈伤组织在同样培养基上再培养2周使体积变大，直至愈伤组织的直径为约1.5厘米。

为了再生，然后将愈伤组织在PHI-E培养基[MS盐4.3克/升；肌醇0.1克/升；烟酸0.5毫克/升，盐酸硫胺0.1毫克/升，烟酸吡哆醇0.5毫克/升，甘氨酸2.0毫克/升，玉米素0.5毫克/升，蔗糖60.0克/升，琼脂(Sigma，A-7049)8.0克/升，吲哚乙酸(IAA，Sigma)1.0毫克/升，脱落酸(ABA，Sigma)0.1mM，双丙氨磷3毫克/升，青霉素100毫克/升，将pH值调至5.6]黑暗中28℃培养1-3周，使体细胞胚成熟。然后将愈伤组织在PHI-F培养基(MS盐4.3克/升；肌醇0.1克/升；盐酸硫胺0.1毫克/升，烟酸吡哆醇0.5毫克/升，甘氨酸2.0毫克/升，烟酸0.5毫克/升；蔗糖40.0克/升；

胶凝剂1.5克/升；pH 5.6]中日光(270uE m-2sec-1)下25℃培养16小时，再在黑暗中8小时，直到芽和根茎发育出来。然后将每个小植株转移到含有PHI-F培养基的25×150毫米管内，然后在相同条件下再生长约一个周。将植物移植到温室中装有土壤混合物的盆中。在愈伤组织阶段或再生植物阶段，确定转化事件。

通过在植物组织中检测标记物基因证实ZmCBF1或ZmCBF2启动能够驱动玉米表达。

尽管为了清楚理解本发明的目的，已经通过说明和实施例的方式详细描述了上述发明，但应当明白，可以在后述权利要求的范围内进行一定的变化和修改。所有提到的参考文献在此通过引用并入。

序列表

<110>先锋高级育种国际公司

 

<120>与玉米CBF转录因子相关的调控元件

 

<130>1873-PCT

 

<150>US 60/971,278

<151>2007-09-11

 

<160>2

 

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

 

<210>1

<211>1373

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(634)...(638)

<223>CRT/DRE共有序列

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(680)...(685)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(707)...(712)

<223>ABRE核心基序

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(898)...(903)

<223>ABRE核心基序

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1015)...(1019)

<223>CRT/DRE共有序列

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1087)...(1091)

<223>CRT/DRE consensus

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1144)...(1149)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>TATA_信号

<222>(1213)...(1218)

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1233)...(1237)

<223>CRT/DRE共有序列

<220>

<221>misc_binding

<222>(1327)...(1332)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1330)...(1332)

<223>translation start site

 

<400>1

ccatatcgaa tccgaatcca aagttgtact attttactac tatctatcta ttaacctata   60

tccatcacga atataaaagt atctaagtta ttagtgaaaa aatgtattta tttatagtat  120

ctatatccgg taccctcgcc cctatctata tctcatccac gacacgagcg gtggaccaca  180

cacgacactg gggaaactgg aaaatttccg cattttcatc ccggcttctg ctggaactga  240

aagtactagt aagtaagcta cggcggttcg tcctggatgt ggatgggcgg cccacgcgtg  300

cagtgcttgt gcttcttgat cactgacgac ccggtcgcct ggcccaaccc gggcaggcca  360

cgtcgaaccc cgtctccatc ccctcggcgg gtgatggatt cggtggggcc ggggcgggag  420

gagatcgagt agcagacggc gacacccgat catcaagcgt tgagcgcgga ggacgcaagg  480

gcggacgcgc ggctacatcg aaacgagtcc ggacgaggag gagcggaggc aggcgcctcc  540

ggtcggtgtc gggggcggcg gcaggcaggt agccccacgc gtttccgcgg gcggcgccac  600

ggccctgtct ccgagctgga aatgatcaac aagccgacgg aaaaccagtg gcctgccgcc  660

gccgccgcac cgcatggcgc atgtgccgaa gcccaccggc cgccgtcacg tgccctgccc  720

acggctctga tatttttttt attattgatt ctattctacg ttgccctgct agattttttt  780

cttcttcctt tttagagatt ctctgtgtgc cctgctgatt ctcggtgttg tcagtgaagc  840

gagcgaaaga ccgaagaggt ctgccgccgc ccaaaagcca gccgttgtcg ccatctccac  900

gtggccatct cctgatcctc tgtcgctgcc atggcggggg ccctgccgca tgtcagtccg  960

cgcgactttc cttaacggcg actgctaagc aatgggaatg ggatgggagt ggagccgacg 1020

acgccacgct gacgccaacg cgtcttcccc cgccgcctcg ccaccgtccc gcacgcagca 1080

ctgtccccga ctcccccagc cagtctccag ctcacacctc ccaagtcccg ccacgcgccc 1140

gcccaactga ctgactcccg ccttcaaact tctcccgctc ctcctgatcc acgtaccacc 1200

aaatcctata tatataaacc agaccacaac tcccgactcc atccatcgcc agccacgcca 1260

tcagccatcg cgttccgcat cgaaccagca catcgcaaga caagcagcag cagccaccac 1320

tgccatcaca tggagtacgc cgccgtcggc tacggctacg ggtacgggta cga        1373

<210>2

<211>2266

<212>DNA

<213>玉米

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(64)...(68)

<223>CRT/DRE consensus

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(318)...(323)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(442)...(447)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(873)...(877)

<223>CRT/DRE consensus

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1160)...(1164)

<223>CRT/DRE consensus

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1179)...(1184)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1209)...(1214)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1264)...(1269)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1483)...(1488)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1598)...(1603)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1721)...(1726)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1746)...(1751)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>misc_binding

<222>(1957)...(1962)

<223>假定的myc结合位点

 

<220>

<221>TATA_信号

<222>(2081)...(2086)

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(2190)...(2196)

<223>假定的转录起始位点

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(2210)...(2212)

<223>翻译起始位点

 

<400>2

aacttcttgt ctggtcattt aggattctga acactcatac gtcagctcac atcggtttgg  60

acgccgactg tacggatgtg agcagacgct ggtcgatctc cttttcctat actagctctt 120

atataaatac caccttttcg cattgattgg tggccgccgc tgagttctct actcgggtga 180

acggagggga ggagcaggag acagggggga agcacctccc acgactttgg caggccgaac 240

cgaacgccac aaaagtagga tttttctccg gttccccggg aacagtcttt ttcttctact 300

ggcagaaacg gacggttcag gtgcgggagc ttcccggctg ctgctgctgc cgccggcctt 360

tttgcgatac catactgggg gtttggcccc gggaatgctg gattgggttt tgttcgtggt  420

actcttggtt tcgggactca tcacctggta atgtcgctat cgggtggatg gatctcggcg  480

acgcgagacg tacactgatt tctttttctt ttttctttat caatcagtta tcagtacgta  540

ctgctaccta gggtcctctc ttttttttcc ccggatgcaa aatacgtact gcctgtaacc  600

aatattatat ttatatagat aaaaacaaca taaattttaa gtccctatgt ttatctgaaa  660

atttagaaca gcaatagtca tttcagtgga ccaaaggatt gggttagaat ctggacagtg  720

attgcgggag aagtcctgcc atgagcttag ggtcctagtt tggcaactcc atctttctaa  780

ggccttgttc gtttgtgtcg gattacaccc gaaatcgtta cagctaatca aagtttatat  840

aaattagaga agcaatccgg ataggaatcg ttccgaccca ccaatccgcc acaaacgaac  900

aaggcctaaa gattttcatc tttccaaaga aaaataaact aaactttctt ggaaaaaaat  960

ataaatctct taaaaaatgt ggttgccaaa ctagccctta taataaagga aaaactggag 1020

gaattttaga ggaatgaaat cctatatgaa attatgttat gtggcctttg aaacagaggc 1080

tttagttcct acatatccta taaggttcct atggaatggt ccatcgtagt gatattttag 1140

agaatttcta acttaaagcc cgacctctta gaaattgtca tttgtgcctc tctctctgca 1200

ctctaattca tgtgttcttt ctatgttgca tccaggattc tcaaaacacg gaaataggag 1260

aaacacatga ttataacgcc catgccgttg aaatcctaca aaaatttata acacggaaaa 1320

gttataaaaa catgtttttg gatcatgcgc ataaaaaata taggaatgtg agacacaaag 1380

aaaataaaat atgagggtgg acctcacgct taattttccc tccaaaatta ccatggagca 1440

tgtcatttca taggattttt caaggaattg ataggatcca atcatttgtc ccaaaaggct 1500

tttatatgaa aactttctat gcgaattgaa tcctctaaag ttcctttgtt tttcctccat 1560

tccaaagtta tctgcgtttt taattcatgt atgattacaa gtgttataca actctattcg 1620

tacatttttt ttcctttcta tttttgtatt ttgtcaatcc tctgttccaa aggaggcatc 1680

taaaataggg aatgagatag ccttaatcga gtactagtag catttgatat atcataaaaa 1740

agtagcattt gatatgtgcg agaagagctg gggttaacgt cgtaacgcaa atagttaact 1800

agacggaaac cggtagcgga aacaaaatca gccttgtggc cgcaactaca ccaaatagca 1860

ccatcaagtc actatcgaaa tcgccctgtt gcctccctac ttgcaagctg gaagctgcaa 1920

cttgcgtccc cgtccagccg tccttgctct ctgacccaga tgcagccccc ttccttcccc 1980

agtgcctggt ggctcccctc ccgcgttatt cactctgcta gtcctgctca ggtctgctga 2040

ctgctgctct ctgatccaaa cctcctcctc caccaccacc tataaatacg catcctcaaa 2100

tccaccattc ccaaatcgaa aaccactcga acacaagctc aggcaaggca aaaggaaccc 2160

gcaccatccg aggctcaagc agagaagtga tcatcatcat cagaagaaga tgtgcccaac 2220

caagaagggg atgaccggag agccgagctc gccatgcagc tcggca                2266

Claims (20)

1.分离的核苷酸分子，包含具有启动子活性且为选自下述的序列的多核苷酸：

a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1；

b)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的至少500个连续核苷酸；

c)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1至少95％相同的变异序列，同时保留EQ ID NO：2或SEQ ID NO：1中所鉴定的所有调控元件；以及

d)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的互补物。

2.表达盒，包含与目标多核苷酸可操作连接的权利要求1所述的多核苷酸。

3.载体，包括权利要求2所述的表达盒。

4.植物细胞，具有稳定地并入其基因组的权利要求2所述的表达盒。

5.如权利要求4所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

6.如权利要求5所述的植物细胞，其中所述的单子叶植物为玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦、高粱或水稻。

7.植物，具有稳定地并入基因组的权利要求2所述的表达盒。

8.如权利要求7所述的植物，其中所述的植物为单子叶植物。

9.如权利要求5所述的植物，其中所述的单子叶植物为玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦、高粱或水稻。

10.如权利要求7所述的植物的转基因种子。

11.如权利要求7所述的植物，其中目标多核苷酸编码赋予耐旱性、耐寒性或耐盐性的基因产物。

12.如权利要求7所述的植物，其中所述目标多核苷酸编码涉及营养吸收、氮的利用效率、根强度、根的抗倒性、土壤虫害控制、玉米根虫抗性、糖代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢和植物激素的生物合成的多肽。

13.在植物中表达第一多核苷酸的方法，所述方法包括向植物引入表达盒，该表达盒包含启动子和与所述启动子可操作连接的第一多核苷酸，其中所述启动子包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有启动子活性且为选自下述的序列：

a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1；

b)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的至少500个连续核苷酸；

c)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1至少95％相同的变异序列，同时保留SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1中所鉴定的所有调控元件；以及

d)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的互补物。

14.如权利要求所述13的方法，其中所述植物单子叶植物。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述单子叶植物为玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦、高粱或水稻。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码赋予耐旱性、耐寒性或耐盐性的基因产物。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码涉及营养吸收、氮的利用效率、根强度、根的抗倒性、土壤虫害控制、玉米根虫抗性、糖代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢和植物激素的生物合成的多肽。

18.在植物细胞中表达第一多核苷酸的方法，所述方法包括向植物细胞引入表达盒，所述表达盒包含启动子和与所述启动子可操作连接的第一多核苷酸，其中所述启动子包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有启动子活性且为选自下述的序列：

a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1；

b)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的至少500个连续核苷酸；

c)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1至少95％相同的变异序列，同时保留SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1中所鉴定的所有调控元件；以及

d)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的互补物。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码赋予耐旱性、耐寒性或耐盐性的基因产物。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述的第一多核苷酸编码涉及营养吸收、氮的利用效率、根强度、根的抗倒性、土壤虫害控制、玉米根虫抗性、糖代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢和植物激素的生物合成的多肽。

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