CN103911425B - 一种采用实时定量pcr技术检测茶树cbf1基因表达的方法 - Google Patents
一种采用实时定量pcr技术检测茶树cbf1基因表达的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103911425B CN103911425B CN201310000481.1A CN201310000481A CN103911425B CN 103911425 B CN103911425 B CN 103911425B CN 201310000481 A CN201310000481 A CN 201310000481A CN 103911425 B CN103911425 B CN 103911425B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- gapdh
- cscbf1
- quantitative pcr
- real
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR技术)检测不同处理下茶树CBF1(CsCBF1)基因相对表达量的方法，属于生物技术领域。包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计、荧光定量PCR反应及CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤。其特点是以不同处理下茶树叶片cDNA为模板，甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参基因，通过荧光定量PCR技术，在mRNA水平上对CsCBF1进行相对定量分析，为研究CsCBF1基因表达调控奠定基础。与现有技术相比，本发明的检测方法所需时间短，且可以同时分析不同环境处理下CsCBF1基因的表达变化情况，找出能显著诱导CsCBF1基因表达的条件，操作方法简单，所得结果具有重复性好、定量准确等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测CsCBF1基因表达的特异性引物，更具体的说一种采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR技术)检测不同处理下，CsCBF1基因相对表达量的方法。主要用于CsCBF1基因表达调控机理的研究。
技术背景
转录因子CBF(C-repeat-binding factor)广泛存在于各种植物中，在低温逆境信号转导通路中，能够感受上游传递的低温信号，激活冷诱导(和)或脱水诱导基因的表达，从而引起植物体内的多种生理生化变化，并产生一定的抗寒、抗旱和耐盐能力，是植物抗逆过程中一个重要的调节因子。已有研究表明，CBF基因的表达不仅受低温诱导，而且也与机械损伤、干旱、高渗透压等逆境胁迫有密不可分的联系，同时一些与抗冷密切相关的植物激素(如ABA、乙烯、油菜素内酯等)对CBF基因的表达也有调控作用。而CsCBF1基因表达与其发挥作用的机理仍不清楚。我们应用实时荧光定量PCR技术，建立检测CsCBF1基因mRNA表达水平的方法，对于阐明CsCBF1基因表达的作用机理具有一定指导作用。
在分子生物学领域，很多方法都可以用来进行靶基因的定量研究，这些方法包括Northern/Southern杂交、高效液相色谱(HPLC)、PCR-ELISA、RNA酶保护分析、原位杂交等。但这些方法均存在耗时、费力、敏感性差、需要运用放射性元素或潜在交叉污染的可能性等缺陷。
发明内容
本发明的目的是公开一种采用实时定量PCR技术进行快速、准确检测茶树CBF1基因表达的方法，从而为阐明CsCBF1基因表达的作用机理奠定基础。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计及荧光定量PCR反应、CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤，具体操作方法如下：
(1)实验材料的处理：将茶苗进行4℃、-5℃、干旱、激素处理，分别于不同时间(0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h)进行取样，迅速用液氮收集，-70℃保存，备用；
(2)总RNA的提取与纯化：取不同处理下的茶树叶片，利用RNA提取试剂盒，从茶树叶片中提取得到纯化的总RNA；
(3)eDNA第一链的合成：以茶树叶片总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20ul；
(4)内参基因的选择：内参须满足：①在研究中样本之间的表达是相似的；②处理因素不会影响其表达；③与待测基因同时进行相同的扩增等要求。
(5)荧光定量引物设计：根据CsCBF1基因序列设计符合荧光定量PCR反应特点的特异引物：
yF：5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’；
yR：5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’；
以及作为内参基因的GAPDH特异上下游引物：
GAPDH-F：5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’
GAPDH-R：5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
(6)实时荧光定量PCR：以上述(3)中合成的cDNA第一链为模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物，其中每条引物分别配制成10u mol/L的工作浓度。进行实时荧光定量PCR扩增反映，每个样品设置3个重复，扩增后所得到3个重复管的Ct值取平均数；
(7)不同处理下，CsCBF1基因的相对表达量计算：实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2-ΔΔCt值，计算方式如下：
ΔCt＝Ct(CsCBF1基因)-Ct(GAPDH基因)
ΔΔCt＝ΔCt(处理N小时)-ΔCt(处理0小时)
以2-ΔΔCt数值表示处理时间N小时时，CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。
本发明更加详细的试验方法如下：
(1)实验材料的处理：将两年生扦插苗乌牛早移至营养钵中，置于光照培养箱中培养两周，培养条件：白天25℃(16h)，晚上18℃(8h)。然后进行如下处理：
A.低温处理：以正常生长条件下(25℃)培养的茶苗为对照，在光照培养箱中对茶苗进行4、-5℃低温处理(无光照)，处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。
B.脱水处理：向生长植株的营养钵内一次性浇以15％-30％的PEG600溶液20ml，对照组浇以等量的蒸馏水；处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。
C.激素处理：油菜素内酯(BR)处理：在25℃条件下向茶苗喷施0.1-1.5mg/L的BR溶液处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。
(2)总RNA的提取与纯化：EASY spin植物RNA快速提取试剂盒，从所取的一芽两叶中提取得到总RNA。
(3)cDNA第一链的合成：cDNA第一链的合成采用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，反转录引物使用试剂盒所提供的Oligo(dT)18引物，以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20ul。
(4)内参基因的选择：内参须满足：①在研究中样本之间的表达是相似的；②处理因素不会影响其表达；③与待测基因同时进行相同的扩增等要求。根据以上原则本实验选择GAPDH为内参基因。
(5)荧光定量引物设计：根据CsCBF1基因的全长序列，使用Primer5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
yF：5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’；
yR：5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’；
CsCBF1基因的PCR产物预计长度为235bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的长度与预计产物长度一致，且为但一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
作为实时荧光定量PCR内参基因GAPDH的引物序列如下：
GAPDH-F：5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’
GAPDH-R：5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
GAPDH的PCR产物预计长度为206bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为但一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图2。
(6)实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR采用德国罗氏公司LigntCycler480实时荧光定量PCR仪(配有该公司提供的LigntCycler480荧光定量分析软件)、Fermentas公司的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行。以上述(3)中合成的cDNA第一链为模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反映，每个样品设置3个重复，扩增后所得到3个重复管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值所经历的反应循环数)取平均数；
实时荧光定量PCR反应体系如下：
实时荧光定量PCR反应程序如下：
(7)不同处理下，CsCBF1基因的相对表达量计算：实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2-ΔΔCt值，计算方式如下：ΔCt＝Ct(CsCBF1基因)-Ct(GAPDH基因)ΔΔCt＝ΔCt(处理N小时)-ΔCt(处理0小时)
以2-ΔΔCt数值表示处理时间N小时时，CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。GAPDH基因是看家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，看家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中2-ΔΔCt数值越大，表明CsCBF1基因的表达量越高。
图3为4℃处理下CsCBF1基因的表达变化，从图中可以看出，常温条件下，CsCBF1基因的表达量很低，几乎检测不到其转录物的存在。低温处理1h后，CsCBF1开始表达，随后逐渐升高，8h达到较高值，随后有短暂的下调，直到24h达到最高值，且表达较持久。图4为-5℃处理下CsCBF1基因的表达变化，从图中可以看出，除了处理0.5h时，CsCBF1的表达有微小的提高外，其余各时间CsCBF1的表达均低于对照(处理0h)表达水平，表达水平较低。图5为干旱胁迫下CsCBF1基因的表达变化，从图中可以看出，在处理2h、4h时，CsCBF1表达低于对照(处理0h)表达水平，其余时间CsCBF1基因的表达均有所提高，但变化很小，且整体表达水平不高。图6为常温下喷油菜素内酯，CsCBF1基因的表达变化，从图可以看出经油菜素内酯处理后，CsCBF1基因的表达水平均低于对照(表达水平低于1)，几乎检测不到表达。以上结果显示，4℃低温条件可以显著提高CsCBF1基因的表达水平，而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。
本发明提供的特异性引物快速检测CsCBF1基因表达的方法与现有技术相比的有益效果是：
(1)本发明采用的实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光定量PCR技术全封闭反应，无须PCR后续处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光定量PCR技术也免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。
(2)通过对茶树进行不同处理，发现4℃可以显著提高CsCBF1基因的表达水平，而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。这与拟南芥、水稻等作物CBF1基因的研究有明显的差异。
附图说明
图1为CsCBF1基因实时荧光定量PCR产物电泳结果；CsCBF1产物长度235bp，Marker条带从上而下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp；
图2为内参基因GAPDH实时荧光定量PCR产物电泳结果；GAPDH的PCR产物预计长度为206bp，Marker条带从上而下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp；
图3为4℃处理下CsCBF1基因的表达变化；
图4为-5℃处理下CsCBF1基因的表达变化；
图5为干旱胁迫下CsCBF1基因的表达变化；
图6为常温下喷油菜素内酯，CsCBF1基因的表达变化。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。
实施例：
1.实验材料的处理：将两年生扦插苗乌牛早移至营养钵中，置于光照培养箱中培养两周，培养条件：白天25℃(16h)，晚上18℃(8h)。然后进行如下处理：
A.低温处理：以正常生长条件下(25℃)培养的茶苗为对照，在光照培养箱中对茶苗进行4、-5℃低温处理(无光照)，处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。
B.脱水处理：向生长植株的营养钵内一次性浇以20％的PEG600溶液20ml，对照组浇以等量的蒸馏水；处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。
C.激素处理：油菜素内酯(BR)处理：在25℃条件下向茶苗喷施1mg/L的BR溶液处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶，迅速用液氮收集，-70保存，备用。
2.总RNA的提取和纯化：
(1)取500ul裂解液RLT(已经加入β-巯基乙醇)，转入1.5ml离心管中，加入50ulPLANTaid混匀备用。
(2)液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取约50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管中，立即用手剧烈震荡20s，充分裂解。
(3)将裂解物12000rpm离心5-10min。沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，将所有裂解物上清转到一个新离心管中。
(4)估计上清体积，加入1/2体积的无水乙醇。立即吹打混匀，不要离心。
(5)将混匀物(每次小于700ul，多可以分两次加入)加入到一个吸附柱RA中(吸附柱放入收集管中)12000rpm离心60s，弃掉废液。
(6)加700ul去蛋白液RW1，室温静置30s，12000rpm离心30s，弃废液。
(7)加500ulRW，12000rpm离心30s，弃废液，加入500ulRW，重复一遍。
(8)将吸附柱RA放回空收集管中，12000离心2min，并静置一会儿，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(9)取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，在吸附膜中间部位加50ulRNase free Water，室温静置1min，12000rpm离心1min。
(10)提取的总RNA可用DNaseI酶(Fermentas公司)进一步纯化，以去除RNA中残存的DNA，具体如下：往0.2mL离心管中加入3ul提取的总RNA、3ul 10×reaction buffer with MgCl2，3ul DNase I，DEPC水补至总体积到10ul，37℃温浴30min，加入1ul 50mMEDTA，65℃温浴10min。即得纯化的总RNA。
3.cDNA第一链合成：以2所述纯化的茶树叶片总RNA作为模板，使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，
(1)将试剂盒中各组分融化、混匀、离心、储存在冰上。
(2)在无菌、无RNase的离心管中加入以下个成分：
(3)按顺序加入以下组分：
(4)温和混匀，离心。
(5)42℃温浴60min。
(6)70℃热激5min.
4.CsCBF1基因的实时荧光定量PCR检测：
(1)引物设计：
根据CsCBF1基因的全长序列，使用Primei5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
yF：5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’；
yR：5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’；
CsCBF1基因的PCR产物预计长度为235bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的长度与预计产物长度一致，且为但一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
作为实时荧光定量PCR内参基因GAPDH的引物序列如下：
GAPDH-F：5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’
GAPDH-R：5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
GAPDH的PCR产物预计长度为206bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为但一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图2。
(2)实时荧光定量PCR：
实时荧光定量PCR使用德国罗氏公司LigntCycler480实时荧光定量PCR仪(配有该公司提供的LigntCycler480荧光定量分析软件)。采用Fermentas公司的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行。以上述(2)中合成的cDNA第一链为模板，上述(1)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反映，每个样品设置3个重复，扩增后所得到3个重复管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值所经历的反应循环数)取平均数。
实时荧光定量PCR反应体系设置如下：
实时荧光定量PCR反应程序如下：
(3)不同处理下，CsCBF1基因的相对表达量计算：
实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2-ΔΔCt值，计算方式如下：
ΔCt＝Ct(CsCBF1基因)-Ct(GAPDH基因)
ΔΔCt＝ΔCt(处理N小时)-ΔCt(处理0小时)
以2-ΔΔCt数值表示处理时间N小时时，CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。GAPDH基因是看家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，看家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中2-ΔΔCt数值越大，表明CsCBF1基因的表达量越高。
图3为4℃处理下CsCBF1基因的表达变化，从图中可以看出，常温条件下，CsCBF1基因的表达量很低，几乎检测不到其转录物的存在。低温处理1h后，CsCBF1开始表达，随后逐渐升高，处理8h达到较高值，随后有短暂的下调，直到24h达到最高值。且表达较持久。图4为-5℃处理下CsCBF1基因的表达变化，从图中可以看出，除了处理0.5h时，CsCBF1的表达有微小的提高外，其余各时间CsCBF1的表达均低于对照(处理0h)表达水平，表达水平较低。图5为干旱胁迫下CsCBF1基因的表达变化，从图中可以看出，在处理2h、4h时，CsCBF1表达低于对照(处理0h)表达水平，其余时间CsCBF1基因的表达均有所提高，但变化很小，且表达水平均不高。图6为常温下喷油菜素内酯，CsCBF1基因的表达变化。从图可以看出经油菜素内酯处理后，CsCBF1基因的表达水平均低于对照(表达水平低于1)，几乎检测不到表达。以上结果显示，4℃低温条件可以显著提高CsCBF1基因的表达水平，而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。
通过对茶树进行不同处理，发现4℃可以显著提高CsCBF1基因的表达水平，而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。这与拟南芥、水稻等作物CBF1基因的研究有明显的差异。
Claims (5)
1.一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计、荧光定量PCR反应及CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤，具体操作方法如下：
(1)茶苗处理：将茶苗分别置于低温(4℃、-5℃)、干旱、激素环境下处理不同时间；
(2)所取组织RNA提取：取不同处理下的茶树叶片，利用RNA提取试剂盒，从茶树叶片中提取得到纯化的总RNA；
(3)cDNA的合成：以茶树叶片总RNA为模板合成cDNA第一链；
(4)内参基因选择：根据实时定量PCR反应内参基因选择要求，选择甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参基因；
(5)荧光定量引物设计：根据荧光定量PCR引物设计原则，设计CsCBF1基因、GAPDH基因特异性上下游引物yF、yR和GAPDH-F、GAPDH-R，引物序列分别为：
yF：5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’；
yR：5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’；
GAPDH-F：5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’；
GAPDH-R：5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3。
(6)实时荧光定量PCR反应：以上述合成的cDNA第一链为模板，yF、yR和GAPDH-F、GAPDH-R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应。
(7)不同处理下，CsCBF1基因的相对表达量计算：实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2-ΔΔCt值，计算方式如下：
ΔCt＝Ct(CsCBF1基因)-Ct(GAPDH基因)
ΔΔCt＝ΔCt(处理N小时)-ΔCt(处理0小时)
以2-ΔΔCt数值表示处理时间N小时时，CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。
2.根据权利要求书1所述一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于茶苗处理步骤中，低温处理与以往实验4℃、0℃处理相比增加了-5℃；干旱处理采用的是通过浇灌15％-30％的聚乙二醇(PEG)来模拟干旱环境；激素处理是通过喷施0.1-1.5mg/L油菜素内酯(BR)；处理时间分别为0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h。
3.根据权利要求书1所述一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于RNA提取步骤中，所取的组织为一芽两叶。
4.根据权利要求书1所述一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于荧光定量引物设计步骤中，根据荧光定量PCR引物设计原则，设计了CsCBF1基因特异性上下游引物：
yF：5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’；
yR：5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’；
以及作为内参基因的GAPDH基因特异性上下游引物：
GAPDH-F：5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’；
GAPDH-R：5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3。
5.根据权利要求书1所述一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于实时荧光定量PCR反应步骤中，以上述(3)合成的cDNA第一链为模板，上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物，其中每条引物分别配制成10u mol/L的工作浓度；进行实时荧光定量PCR扩增反映，每个样品设置3个重复，扩增后所得到3个重复管的Ct值取平均数。
实时荧光定量PCR反应体系如下：
实时荧光定量PCR反应程序如下：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310000481.1A CN103911425B (zh) | 2013-01-04 | 2013-01-04 | 一种采用实时定量pcr技术检测茶树cbf1基因表达的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310000481.1A CN103911425B (zh) | 2013-01-04 | 2013-01-04 | 一种采用实时定量pcr技术检测茶树cbf1基因表达的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103911425A CN103911425A (zh) | 2014-07-09 |
| CN103911425B true CN103911425B (zh) | 2015-08-26 |
Family
ID=51037428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310000481.1A Active CN103911425B (zh) | 2013-01-04 | 2013-01-04 | 一种采用实时定量pcr技术检测茶树cbf1基因表达的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103911425B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132417B (zh) * | 2015-09-07 | 2017-09-26 | 安徽农业大学 | 茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用 |
| CN111662999B (zh) * | 2020-07-03 | 2022-09-06 | 广东省农业科学院环境园艺研究所 | 杜鹃红山茶不同组织器官荧光定量内参基因及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101698854A (zh) * | 2009-05-07 | 2010-04-28 | 山东大学 | 转盐芥cbf1基因提高玉米、小麦抗旱耐盐性的应用 |
| CN101842485A (zh) * | 2007-09-11 | 2010-09-22 | 先锋高级育种国际公司 | 与玉米cbf转录因子相关的调控元件 |
-
2013
- 2013-01-04 CN CN201310000481.1A patent/CN103911425B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101842485A (zh) * | 2007-09-11 | 2010-09-22 | 先锋高级育种国际公司 | 与玉米cbf转录因子相关的调控元件 |
| CN101698854A (zh) * | 2009-05-07 | 2010-04-28 | 山东大学 | 转盐芥cbf1基因提高玉米、小麦抗旱耐盐性的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 用改良TAIL-PCR技术分析转基因烟草cbf1基因插入区的侧翼序列;宋达峰等;《作物学报》;20051025(第10期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103911425A (zh) | 2014-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Priya et al. | Differential expression pattern of rubber elongation factor (REF) mRNA transcripts from high and low yielding clones of rubber tree (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) | |
| CN104357580A (zh) | 两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重rt-pcr方法及其专用引物组 | |
| CN103320517B (zh) | 一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物和方法 | |
| CN110452959B (zh) | 一种黄草乌实时定量pcr内参基因的筛选方法 | |
| CN103937785B (zh) | 西瓜雌性系基因ClWIP1与染色体易位及连锁标记 | |
| CN103911425B (zh) | 一种采用实时定量pcr技术检测茶树cbf1基因表达的方法 | |
| CN107119048B (zh) | 桑假尾孢菌rDNA及其在桑假尾孢菌分子检测中的应用 | |
| JP7090357B2 (ja) | チョウザメの性別を同定するための、プライマーセット、キット、ならびにマイクロｒｎａ血清マーカー及びプライマーセットの使用 | |
| Hongbo et al. | A study on differentially expressed gene screening of Chrysanthemum plants under sound stress | |
| CN105063226B (zh) | 菜用大豆中平头炭疽菌的特异性pcr检测引物及其检测方法 | |
| CN104561348A (zh) | 检测水稻高粒重等位基因的特异性pcr分子标记 | |
| CN103525856A (zh) | 一种乙烯应答因子基因OsERF3及其启动子在调控水稻根发育中的用途 | |
| CN107849566B (zh) | 用于检测白粉病的方法和试剂盒 | |
| CN112239779A (zh) | 一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物、试剂盒及其应用 | |
| CN114231602B (zh) | 一种基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法 | |
| CN105018612A (zh) | 一种大蒜病毒的定量检测方法 | |
| CN104789670A (zh) | 桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因及应用 | |
| CN109837355B (zh) | 菵草cyp704b1基因的应用 | |
| CN107653250B (zh) | 一种鸡爪槭内参基因及其应用 | |
| CN101988127A (zh) | 一种实时荧光定量PCR检测花生LOX基因mRNA表达水平的方法 | |
| CN109837288B (zh) | 菵草myc3基因及其应用 | |
| CN115873982B (zh) | 用于芍药茎秆发育中基因表达的内参基因及其引物和应用 | |
| Luchi et al. | Laser microdissection on Norway spruce bark tissue: a suitable protocol for subsequent real-time reverse transcription–polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis | |
| CN108823207A (zh) | 一种苎麻的Bn-miR43及其应用 | |
| CN108949779B (zh) | 斑茅野生种受干旱胁迫表达的基因SaWRKY |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: QINGDAO AGRICULTURAL UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: JIMO RUICAOYUAN TEA RESEARCH INSTITUTE Effective date: 20150720 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150720 Address after: 266000 Qingdao Road, Chengyang District, Shandong, No. 700 the Great Wall Applicant after: Qingdao Agricultural University Address before: 266000 No. 1, Shimen village, Longquan Town, Jimo City, Shandong, Qingdao, Yuquanlu Road Applicant before: JIMO RUICAOYUAN TEA RESEARCH INSTITUTE |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |