CN103525856A - 一种乙烯应答因子基因OsERF3及其启动子在调控水稻根发育中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙烯应答因子基因OsERF3在调控水稻根发育中的应用，通过酵母双杂交的方法，筛选到了一个与已经公开发表的OsWOX11蛋白互作的乙烯应答因子OsERF3。通过超表达和人工小干扰RNA的方法，得到该基因相应的转化水稻，发现超表达该基因后植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株增长、增多，而主根的增长是由于根尖成熟区细胞的长度增长引起的；而人工小干扰RNA转基因植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株变短、变少，主根的变短是由于分生区和成熟区细胞的长度变小引起的。表明该基因具有促进水稻根发育的功能。该基因启动子与报告基因β-葡萄糖苷酸酶融合的结果表明该基因在根尖分生区中表达。

Description

一种乙烯应答因子基因OsERF3及其启动子在调控水稻根发育中的用途

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻根部发育的乙烯应答因子基因OsERF3的用途，还涉及一种乙烯应答因子基因OsERF3启动子在调控水稻根发育中的用途。

背景技术

根是植物适应陆生生活的重要器官，大多数生长在土壤里，构成了植物的地下部分，其主要功能是吸收、输出、支持、合成和储藏。因此，根对于整个植物的生长发育具有重要作用，而研究植物根的发育机制，为我们在生产实践中改良作物习性，提高作物产量提供了重要的理论基础与方向。

目前植物中对于根的结构和发育研究得最清楚的当属双子叶植物拟南芥。拟南芥的根系为直根系，主要由主根（primary root,PR）和侧根（lateral root,LR）组成。相比于拟南芥而言，作为单子叶植物的水稻，其根系为典型的须根系，除了主根（primary root,PR）和侧根（lateral root,LR）外，还具有大量的冠状根（crown root，CR）。目前，在水稻中已经分离和鉴定出几个根发育相关的突变体和基因，这些基因和突变体均不同程度地影响着主根（PR）、侧根（LR）和冠根（CR）的发育。QHB是植物中最早报道在水稻根的不活动中心特异表达的WUSCHEL-type homeobox类基因,在其超量表达的转基因植株中没有冠根（CR）的形成（Noriko Kamiya et al.,Isolation and characterization of a rice WUSCHEL-type homeoboxgene that is specifically expressed in the central cells of a quiescent center in the root apicalmeristem.the Plant Journal.2003,35,429-441）。在crl1，crl2（crown rootless1,crown rootless2）突变体中，水稻根部CR数目减少，而这主要是由于冠根（CR）发育的起始受到影响所致（Yoshiaki Inukai et al.,Crown rootless1,Which Is Essential for Crown Root Formation in Rice,Is a Target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in Auxin Signaling.The Plant Cell 2005,17,1387-1396）。ARL1(Adventitious rootless1)编码一个含有LATERAL ORGANBOUNDARIES(LOB)结构域的蛋白，在侧根、不定根原基，分裂原基，维管组织等中表达，参与了生长素介导的细胞分化，促进中柱鞘中原始细胞的分裂，从而参与调控水稻中不定根的产生（Hongjia Liu et al.,ARL1,a LOB-domain protein required for adventitious root formationin rice,the plant journal 2005,43,47-56）。

AP2/ERF(APETALA2/Ethylene-Responsive Factor)家族转录因子是植物中重要的一类转录因子,广泛参与植物各类生理过程。从籼稻品种9311中克隆得到的AP2／ERF基因OsEATB通过与赤霉素生物合成途径的互作发挥功能，其超量表达植株株高变矮，穗长变短，而有效分蘖和穗的发育潜能则有所提高（Weiwei Qi,et al.,Rice ethylene-response AP2／ERF factorOsEATB restricts internode elongation by down-regulating a gibberellin biosynthetic gene,PlantPhysiology，2011,157,216-228）。CRL5属于AP2／ERF家族成员，其突变体crl5(crownrootless5)中冠根的起始受到影响，从而导致植株中冠根的数目变少（Yuka Kitomi et al.,Theauxin responsive AP2／ERF transcription factor CROWN ROOTLESS5 is involved in crown rootinitiation in rice through the induction of OsRR1,a type-A response regulator of cytokininsignaling.the plant journal 2011,67,472-484）。OsERF922的转基因抑制植株对水稻稻瘟病的抗性增强，其超表达植株则表现出对稻瘟病的易感性；同时，超量表达OsERF922后，植株对盐胁迫的耐受力也降低（Dongfeng Liu,et al.,The rice ERF transcription factor OsERF922negatively regulates resistance to Magnaporthe oryzae and salt tolerance,Journal of ExperimentalBotany，2012）。

综上所述，水稻根的发育是受多种机制调控的，诸如生长素及其他特定的转录因子复合物等，而AP2／ERF类转录因子在调控水稻根发育中的作用机制目前尚未明确。本发明找到了一个来源于粳稻ZH11，与目前已发表的OsWOX11（Zhao Yu et al.,TheWUSCHEL-Related Homeobox Gene WOX11 Is Required to Activate Shoot-Borne Crown RootDevelopment in Rice,The Plant Cell,2009）互作，控制着水稻冠根（CR）和主根（PR）等多方面发育的转录因子基因。该基因超量表达后植株PR长度和CR数目明显高于野生型，抑制表达该基因后，PR长度和CR数目则低于野生型。该基因启动子与报告基因GUS融合及原位杂交的结果表明该基因在根尖分生区中表达。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种乙烯应答因子基因OsERF3在调控水稻根发育中的应用，超量表达该基因后植株主根（PR）长度和冠根数目（CR）明显高于野生型，抑制表达该基因后，PR长度和CR数目则低于野生型。

本发明的另一个目的是提供了一种乙烯应答因子基因OsERF3启动子在调控水稻根发育中的应用，该基因启动子与报告基因GUS融合及原位杂交的结果表明该基因在根尖分生区中表达。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过酵母双杂交实验，由已报道的OsWOX11（Zhao Yu et al.,TheWUSCHEL-Related Homeobox Gene WOX11 Is Required to Activate Shoot-Borne Crown RootDevelopment in Rice,The Plant Cell,2009）作为诱饵蛋白，从水稻两分蘖时期的根部酵母文库中筛选并分离得到一个调控植物根部发育的乙烯应答因子基因OsERF3，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，由708个碱基组成，其推测的蛋白质编码序列有708个碱基，是序列1自5’端第1位碱基到708位碱基组成。该基因在调控水稻根发育方面的功能尚未有任何文献报道。将该基因的完整翻译区（Coding Sequence）与玉米泛素启动子（Ubiquitin）结合后直接转入水稻，转基因植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株增长、增多，而主根的增长主要是由于根尖成熟区细胞的长度增长引起的；构建该基因的人工小干扰RNA载体（序列为SEQ ID NO:2），转入水稻后，转基因植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株变短、变少，且主根的变短主要是由于分生区和成熟区细胞的长度变小引起的。构建该基因的启动子与报告基因GUS融合的载体，转化水稻本身，结果发现该基因在根尖分生区中表达。表明该基因具有促进水稻根发育的功能。

本发明构建了一种超表达载体pu1301，获得转化载体pu1301-ERF3、pu1301-amiERF3、p1381-ERF3promoter-GUS，利用该转化载体转化水稻品种“中花11”（见遗传资源来源披露表-1），得到该基因的超表达转基因水稻植株，抑制表达转基因水稻植株和启动子与报告基因GUS融合的转基因植株。

一种乙烯应答因子基因OsERF3及其启动子在调控水稻根发育中的应用，其步骤是：

1）以已经报道的OsWOX11（Zhao Yu et al.,The WUSCHEL-Related Homeobox GeneWOX11 Is Required to Activate Shoot-Borne Crown Root Development in Rice,The Plant Cell,2009）全长蛋白作为诱饵筛选本实验室构建的水稻两分糵时期酵母文库，互作克隆经测序及序列比对后（序列比对网站NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov），发现其中一个互作克隆为数据库中命名为OsERF3的基因的全长cDNA，登录号为AP003299。根据该数据库中提供的序列设计引物对，以水稻cDNA为模板，扩增了OsERF3的全长（翻译起始位点至下游708个碱基)，一种分离的DNA片段，乙烯应答因子基因OsERF3，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述引物对DNA序列如下：

oxERF3-F（正向引物）5’-GGGGGTACCATGGCGCCCAGAGCAGCTAC-3’

oxERF3-R（反向引物）5’-CGCGGATCCCTAGTTCTCTACCGGCGGCGG-3’

将数据库中命名的OsERF3的登录号提交到人工小干扰RNA构建网站WMD3(http://wmd3.weigelworld.org／cgi-bin／webapp.cgi),数据库自动输出构建针对OsERF3的小干扰RNA引物的DNA序列，以水稻中通用的小干扰RNA构建载体NW55（Norman Warthmannet al.,Highly Specific Gene Silencing by Artificial miRNAs in Rice,PloS ONE,2008,（3）:e1829）为模板，扩增了一段DNA序列，其序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述引物DNA序列如下：

I miR-s：5’-AGTAAAGTAAGGATGCGTTGCTTCAGGAGATTCAGTTTGA-3’

II miR-a：5’-TGAAGCAACGCATCCTTACTTTACTGCTGCTGCTACAGCC-3’

III miR*s：5’-CTAAGCATCGCTTCCTTACTTTATTCCTGCTGCTAGGCTG-3’

IV miR*a：5’-TAAAGTAGGAAGCGATGCTTAGAGAGGCAAAAGTAA-3’

G-11491'：5’-TCGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAA-3’

G-11494'：5’-TCGGATCCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3

3）将步骤1）中得到的全长cDNA序列提交到NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行序列比对，找到覆盖该基因的BAC序列，登录号为AP003299，从OsERF3的起始密码子上游设计引物，扩增出该基因的启动子区域，其序列为SEQ NO:3所示的核苷酸序列，所述的引物DNA序列如下：

ERF3 promoter-F1:5’-CGCGGATCCGCTAGCAGCGCCTGGTACAT-3’

ERF3 promoter-R1:5’-ACGCGTCGACGTGTTTTGGGAGGTTGGGTT-3’

4）将步骤1)、2)中扩增的片段分别连接到超表达载体pu1301（Sun and Zhou,2008,RicejmjC domain-containing gene JMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organdevelopment.PNAS.36 13679-13684）上。pu1301是由国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301（Sun等，2004，Xa26,a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice,encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37:517-527）基础上改造而成。获得转化载体pu1301-ERF3和pu1301-amiERF3；将步骤3）中扩增的片段连接到pCAMBIA1381（购自CAMBIA公司），获得转化载体p1381-ERF3promoter-GUS。

4）利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei Y et.al.,Efficient transformation ofrice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJ.1994,6:271-282)将所述的载体分别导入水稻受体中花11（详见遗传资源来源披露表-1），获得转化植株；

5）借助PCR的方法分析鉴定阳性转基因植株，再利用Northern blot、Realtime-PCR、GUS染色分析转基因植株中相关基因的表达；

6）鉴定转基因植株的表型，并进行统计分析。

一种乙烯应答因子基因OsERF3及其启动子的功能验证和应用，其步骤是：申请人克隆得到水稻乙烯应答因子基因OsERF3及其启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3中所示。发明通过遗传转化该基因的超表达，人工小干扰RNA载体和启动子融合报告基因GUS载体，得到相应的转基因植株。发现超表达该基因后植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株增长、增多，而主根的增长主要是由于根尖成熟区细胞的长度增长引起的；而人工小干扰RNA转基因植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株变短、变少，且主根的变短主要是由于分生区和成熟区细胞的长度变小引起的。该基因启动子与报告基因GUS融合及原位杂交的结果表明该基因在根尖分生区中表达。表明该基因具有促进水稻主根伸长和冠根发生的功能。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

水稻作为全球的主要粮食作物之一，对缓解粮食短缺，尤其是保障我国的粮食安全有着重要的意义，如何提高水稻产量已经成为一项具有重要意义的科学问题。根作为植物的重要器官，在整个植株的生长过程中发挥着重要角色，根的生长发育势必会影响植株的产量。目前AP2／ERF类转录在水稻根发育过程中作用的研究文章仅有几例，本发明的AP2／ERF转录因子OsERF3在水稻根发育过程中的作用尚未有任何报道。本发明通过遗传转化该基因的超表达和人工小干扰RNA载体，得到相应的转基因植株。发现超表达该基因后植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株增长、增多一倍左右，（见图5），而主根的增长主要是由于根尖成熟区细胞的长度增长引起的(见图7)；而人工小干扰RNA转基因植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株变短、变少约一倍（见图6），且主根的变短主要是由于分生区和成熟区细胞的长度变小引起的（见图7）。该基因启动子与报告基因β-葡萄糖苷酸酶融合的结果表明该基因在根尖分生区中表达（见图8）表明该基因具有调控水稻根发育的功能。

附图说明:

图1为一种筛选水稻两分蘖时期根部文库得到的OsERF3阳性克隆酵母验证结果示意图。

图2为一种超表达载体pu1301的结构示意图。

图3为一种OsERF3在转基因超量表达植株中的表达量示意图。

图4为一种OsERF3在转基因人工小干扰RNA植株中的表达量示意图。

图5为一种在OsERF3超量表达植株中PR,CR与野生型的形态学比较及统计学分析示意图。

图6为一种在OsERF3人工小干扰RNA植株中PR,CR与野生型的形态学比较及统计学分析示意图。

图7为一种在OsERF3超量表达植株、OsERF3人工小干扰RNA植株以及野生型植株中PR分生区、成熟区的形态学比较及细胞长度的统计学分析示意图。

图8为一种OsERF3启动子融合报告基因GUS后转基因植株中根尖部位报告基因GUS表达的石蜡切片图。

具体实施方式

实施例1：OsERF3超表达载体的构建

对本发明所需要的基因OsERF3，主要通过RT-PCR方法（参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），北京，科学出版社，2002版）进行扩增得到OsERF3基因特异的一段序列。具体操作如下：

1）抽提来自水稻品种“中花11”(见遗传资源来源披露表-1)幼苗叶片的RNA，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒（具体操作步骤见试剂盒说明书）；

2）RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配制混合液1：总RNA 4μg，DNaseI 2U,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC（焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂）处理水（0.01％DEPC）到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg／ml的oligo(dT)，④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配制混合液2：混合液110μl，5x first strandbuffer 4μl，0.1M DTT（巯基乙醇）2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

3）然后根据NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）公布的OsERF3基因的全长cDNA序列，设计特异引物PCR扩增特异片段。PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，oxERF3-F和oxERF3-R引物各0.4μl（用于超表达的引物为oxERF3-F和oxERF3-R；），LATaq酶0.2μl，加水到20μl（所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司）。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃60秒，⑤从②－④循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。

用来克隆OsERF3超表达载体片段的引物为：

oxERF3-F（正向引物）5’-GGGGGTACCACTTGTAAACCTGCTGCACC-3’

oxERF3-R（反向引物）5’-CGCGGATCCCTAGTTCTCTACCGGCGGCGG-3’

最终得到的OsERF3基因的超表达载体片段的cDNA序列，一种乙烯应答因子基因OsERF3（分离的DNA片段），其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4)最后将扩增产物连接到T／A克隆载体pGEMT-vector（购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司）上用T7和SP6引物测序验证。

5）将扩增产物连接到超表达载体pu1301得到质粒pu301-ERF3-EHA105。

实施例2：OsERF3人工小干扰RNA载体的构建

1)以NW55质粒为模板，先以引物I miR-s和III miR*s，II miR-a和IV miR*，II miR-a和III miR*s扩增3组PCR反应（PCR体系及程序与实施例1中所述的PCR体系及程序一致）。

2)从以上3组PCR反应中各取0.5μl PCR产物为模板，以引物对G-11491'和G-11494′扩增（PCR体系及程序与实施例1中所述的PCR体系及程序一致；G-11491'和G-11494'由生工生物工程（上海）有限公司合成）。

用来构建人工小干扰RNA载体的引物为：

I miR-s：5’-AGTAAAGTAAGGATGCGTTGCTTCAGGAGATTCAGTTTGA-3’

II miR-a：5’-TGAAGCAACGCATCCTTACTTTACTGCTGCTGCTACAGCC-3’

III miR*s：5’-CTAGCATCGCTTCCTTACTTTATTCCTGCTGCTAGGCTG-3’

IV miR*a：5’-TAAAGTAAGGAAGCGATGCTTAGAGAGGCAAAAGTA-3’

G-11491'：5’-TCGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAA-3’

G-11494'：5’-TCGGATCCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3’

最终得到的OsERF3基因人工小干扰RNA载体片段的cDNA序列，其序列为SEQ IDNO.2所示。

3)将扩增产物连接到T／A克隆载体pGEMT-vector（购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司）上用T7和SP6引物测序验证。

4）将扩增产物连接到超表达载体pu1301得到质粒pu301-amiERF3-EHA105。

实施例3：OsERF3启动子融合报告基因GUS的载体构建

1）抽提水稻品种“中花11”（(见遗传资源来源披露表-1)叶片总DNA。DNA抽提方法为CTAB法（Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499）,以叶片总DNA为模板，以启动子扩增引物扩增ERF3启动子序列（PCR体系及程序与实施例1中所述的PCR体系及程序一致）。

用来构建启动子融合报告基因GUS的载体的引物为：

ERF3 promoter-F1:5’-CGCGGATCCGCTAGCAGCGCCTGGTACAT-3’

ERF3 promoter-R1:5’-ACGCGTCGACGTGTTTTGGGAGGTTGGGTT-3’

最终得到的OsERF3基因启动子融合报告基因GUS的cDNA序列，其序列为SEQ ID NO：3所示。

2)将扩增产物连接到T／A克隆载体pGEMT-vector（购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，即美国Promega公司）上用T7和SP6引物测序验证。

3）将扩增产物连接到载体pCAMBIA1381（购自CAMBIA公司），获得转化载体p1381-ERF3promoter-GUS-EHA105。

实施例4:一种乙烯应答因子基因OsERF3在调控水稻根发育中的用途，其步骤是:

A、双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性和表达量检测：

1)将pu301-ERF3-EHA105（来自实施例1），pu301-amiERF3-EHA105（来自实施例2），p1381-ERF3Promoter-GUS-EHA105(来自实施例3)向水稻受体品种“中花11”（见遗传资源来源披露表-1）转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法（Hiei等,Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA.Plant J,1994,6:271-282）进行。所获得的T0代转基因植株命名为OxERF3-n或amiERF3-n，其中n=1，2，3…代表转基因的不同家系。

2)取T0代转化植株叶片抽提总DNA（DNA抽提方法同实施例3）。然后用PCR方法对超表达T0代转化植株和启动子转化植株用β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)引物进行阳性检测，用G-11491'和G-11494'引物对人工小干扰RNA植株进行阳性检测。

GUS引物的序列如下：

GUS-LF:5'-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’

GUS-LR:5'-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACC-3’

G-11491'和G-11494'引物序列如下：

G-11491'：5’-TCGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAA-3’

G-11494'：5’-TCGGATCCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3’

以上引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，左、右引物（GUS-LF和GUS-LR）各0.4μl，r-Taq酶0.2μl,加去离子水到20μl（所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、r-Taq酶等均购自宝生物工程大连有限公司）。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③57℃30秒，④72℃1分钟，⑤从②－④循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％（质量/体积）的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。因为GUS基因和G-11491'和G-11494'引物片段为转化载体所特有，这样能扩增出GUS基因或者G-11491'和G-11494'特异条带的转基因植株即为阳性植株。对T0代阳性植株收种子（T1代），为T1代的大田种植和性状调查做准备。

3)为了检测超表达植株中的目标基因的表达量，申请人采用Northern-blot的方法对转基因T0代植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期的水稻叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒（具体操作步骤见试剂盒说明书）；Northern转膜上样量为15-μg，探针标记采用随机引物标记的方法，所使用的同位素标记物为α-32P-dCTP，膜在杂交管中先预杂交3个小时左右，然后加入同位素标记的探针，继续杂交12个小时；杂交结束后，用2×柠檬酸钠缓冲液（SSC），0.1%（体积/体积）十二烷基硫酸钠（SDS）常温下将杂交膜漂洗10分钟，然后用同样的洗膜液在65℃漂洗，每次两分钟，直到信号值合适为止。洗完膜以后将膜置于干净的滤纸晾干，用保鲜膜包好，然后用磷屏（Phosphorimage，FUJI，日本）压片6-9小时最后用FUJIFILMFLA5100扫描读取结果。最终的到的T0代转基因植株中OsERF3表达结果见图3。其中，WT代表野生型水稻品种ZH11(见遗传资源来源披露表-1)，OE3、OE4、OE8、OE9、OE10，OE12，OE14为OsERF3阳性超表达家系OxERF3-3、OxERF3-4、OxERF3-8、OxERF3-9、OxERF3-10、OxERF3-12、OxERF3-14的缩写，上排显示各个转基因家系中OsERF3的表达量，下排为rRNA上样量。由此Northern-blot结果可以看出，与野生型ZH11相比，OE3、OE4、OE9、OE10、OE12、OE14家系中OsERF3的表达量均有提高，在这些家系中超表达ERF3有效果。

4)为了检测人工小干扰RNA植株中的目标基因表达量，申请人采用Real-time PCR的方法对转基因T0代植株进行了表达分析。抽提了T0代转基因植株的总RNA，按照实施例1的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测OsERF3的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。Real-time PCR所用引物序列为：

ERF3amiRT-F:5’-GGCGTTCGCTTTCCTTTCA-3’

ERF3amiRT-R:5’-CGGTGCAAGCTTCATCATACG-3’

最终得到的T0代转基因植株中OsERF3表达结果见图4。amiERF3-1到amiERF3-10为最终得到的10个转基因家系，其中amiERF3-6为转基因阴性，Real-time PCR结果显示在转基因材料中，OsERF3的表达与野生型ZH11相比，下降了约70%，抑制效果很好。

B、T1代性状调查和表达分析：

a:转基因植株PR，CR表型分析及统计

1）将T1代种子，超表达植株4个家系，分别为OxERF3-3，OxERF3-4，OxERF3-9，OxERF3-12人工小干扰RNA4个家系，分别为amiERF3-5，amiERF3-7，amiERF3-9，amiERF3-6(阴性对照)于含有50μg／ml潮霉素（Roche公司生产，50mg／ml）的盛有生根培养基的平皿上发芽3天，挑选根长势一致的种子转移到不含潮霉素的盛有生根培养基的方皿上继续培养4天。

2）将方皿中的植株取出，水洗掉培养基后，观察根部表型并照相。测量PR长度，记录CR数目，结果见图5和图6。由图5可以看出，发芽一周后，ERF3超量表达的各个家系OxERF3-3，OxERF3-4，OxERF3-9，OxERF3-12植株PR长度和CR数目比野生型ZH11(control)长、多（图5左），统计后发现，发芽一周的野生型ZH11中，PR平均长度为2.15cm，CR平均数目为1.4个，而OxERF3-3，OxERF3-4，OxERF3-9，OxERF3-12中，PR平均长度分别为4.14cm，3.55cm，3.71cm，2.12cm，CR数目分别为2.86个，2.81个，3.6个，1.7个，为图5右所示。而抑制ERF3表达后，转基因阳性家系amiERF3-5，amiERF3-7，amiERF3-9中PR长度，CR数目与野生型（WT）和阴性对照amiERF3-6均下降了一半左右（图6）。可见，ERF3后可以促进主根的伸长和冠根的发生。

b:转基因植株根部半薄切片分析

将T1代种子超表达植株4个家系，分别为OxERF3-3，OxERF3-4，OxERF3-9，OxERF3-12人工小干扰RNA4个家系，分别为amiERF3-5，amiERF3-7，amiERF3-9，amiERF3-6(阴性对照)于含有50μg／ml潮霉素（Roche公司生产，50mg／ml）的盛有生根培养基的平皿上发芽3天，切取主根（PR）根尖1-2cm组织于50%（体积/体积）甲醛溶液（甲醛5ml，冰醋酸5ml，50%（体积/体积）酒精90ml）中固定，在真空干燥箱（Hotpack Vacuum OVEN）中抽真空30min至根尖组织不再有气泡冒出。室温下于50%（体积/体积）甲醛溶液中继续固定24小时。挑取根尖于尚未凝固的1%（质量/体积）的琼脂糖中包埋，待完全凝固后修块。包埋有根尖的琼脂糖块于75%，85%，95%（体积/体积）乙醇溶液中脱水1小时，最后于100%（体积/体积）乙醇中加入曙红染料后继续脱水1小时，重复此步骤一次。渗透液预渗透1-2小时，加入硬化剂后渗透1-2小时（小于5小时），65℃展片台上，往半薄切片专用模具中加入聚合液包埋根尖材料，65℃烘干2小时，（半薄切片中所用到的树脂，硬化剂，渗透剂等均购自Heraeus Kulzer Dental公司）。转入37℃恒温箱（电热恒温隔水式培养箱，黄石恒丰医疗器械有限公司生产）中聚合3-4天，超薄切片机上切片，切片后于展片台上烘干切片，固绿染色5min，单蒸水票洗掉染料，再于显微照相机上照相分析。选取清晰、可分辨根尖组织的切片对根尖分生区、成熟区细胞长度及细胞数目进行统计分析。结果及其统计学分析见图7。半薄切片结果可见，转基因抑制植株中，伸长区及成熟区细胞长度均比野生型下降，而超表达植株中成熟区细胞的长度与野生型相比有较大的伸长，伸长区不明显。

c:OsERF3启动子融合报告基因GUS转基因植株根部石蜡切片分析

将T1代种子于含有50μg／ml潮霉素（Roche公司生产，50mg／ml）的盛有生根培养基的平皿上发芽3天，切取主根1-2cm于GUS染料中染色过夜，95%（体积/体积）乙醇脱色后将根转入含50%（体积/体积）乙醇的FAA（甲醛5ml，冰醋酸5ml，50%酒精90ml）中固定过夜，再分别用50%，60%，70%，80%，90%（体积/体积）脱水各1小时后，加入曙红染色过夜，出去染液后，用无水乙醇洗两次，每次1小时彻底出去水分，再依次用乙醇:二甲苯=1:1和1:3，以及纯二甲苯透明各1小时，再向其中加入碎的石蜡，待石蜡慢慢溶于二甲苯后再继续添加石蜡并置于37℃溶解，饱和后再置于60℃，直至饱和后再依次用溶于二甲苯的50%（体积/体积），75%（体积／体积）和纯的石蜡替换，最后将材料包埋在纯的石蜡中，冷却后用于石蜡切片。结果见图8。石蜡切片结果显示GUS染色区域主要集中于根尖伸长区，表明OsERF3在根中有表达。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  一种乙烯应答因子基因OsERF3在调控水稻根发育中的用途

 

<130>  一种乙烯应答因子基因OsERF3在调控水稻根发育中的用途

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  708

<212>  DNA

<213>  水稻

 

<400>  1

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<210>  2

<211>  257

<212>  DNA

<213>  水稻

 

<400>  2

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<210>  3

<211>  2561

<212>  DNA

<213>  水稻

 

<400>  3

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cctagacgcc acacacaccc aaacccaacc tcccaaaaca c                       2561

Claims (2)

1.一种乙烯应答因子基因OsERF3在调控水稻根发育中的应用。

2.一种乙烯应答因子基因OsERF3启动子在调控水稻根发育中的应用。

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