一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,涉及用于检测CsCBF1基因表达的特异性引物,更具体的说一种采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR技术)检测不同处理下,CsCBF1基因相对表达量的方法。主要用于CsCBF1基因表达调控机理的研究。
技术背景
转录因子CBF(C-repeat-binding factor)广泛存在于各种植物中,在低温逆境信号转导通路中,能够感受上游传递的低温信号,激活冷诱导(和)或脱水诱导基因的表达,从而引起植物体内的多种生理生化变化,并产生一定的抗寒、抗旱和耐盐能力,是植物抗逆过程中一个重要的调节因子。已有研究表明,CBF基因的表达不仅受低温诱导,而且也与机械损伤、干旱、高渗透压等逆境胁迫有密不可分的联系,同时一些与抗冷密切相关的植物激素(如ABA、乙烯、油菜素内酯等)对CBF基因的表达也有调控作用。而CsCBF1基因表达与其发挥作用的机理仍不清楚。我们应用实时荧光定量PCR技术,建立检测CsCBF1基因mRNA表达水平的方法,对于阐明CsCBF1基因表达的作用机理具有一定指导作用。
在分子生物学领域,很多方法都可以用来进行靶基因的定量研究,这些方法包括Northern/Southern杂交、高效液相色谱(HPLC)、PCR-ELISA、RNA酶保护分析、原位杂交等。但这些方法均存在耗时、费力、敏感性差、需要运用放射性元素或潜在交叉污染的可能性等缺陷。
发明内容
本发明的目的是公开一种采用实时定量PCR技术进行快速、准确检测茶树CBF1基因表达的方法,从而为阐明CsCBF1基因表达的作用机理奠定基础。
为实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法,其特征在于包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计及荧光定量PCR反应、CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤,具体操作方法如下:
(1)实验材料的处理:将茶苗进行4℃、-5℃、干旱、激素处理,分别于不同时间(0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h)进行取样,迅速用液氮收集,-70℃保存,备用;
(2)总RNA的提取与纯化:取不同处理下的茶树叶片,利用RNA提取试剂盒,从茶树叶片中提取得到纯化的总RNA;
(3)cDNA第一链的合成:以茶树叶片总RNA为模板合成cDNA第一链,反应体系为20ul;
(4)内参基因的选择:内参须满足:①在研究中样本之间的表达是相似的;②处理因素不会影响其表达;③与待测基因同时进行相同的扩增等要求。
(5)荧光定量引物设计:根据CsCBF1基因序列设计符合荧光定量PCR反应特点的特异引物:
yF:5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’;
yR:5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’;
以及作为内参基因的GAPDH特异上下游引物:
GAPDH-F:5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’
GAPDH-R:5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
(6)实时荧光定量PCR:以上述(3)中合成的cDNA第一链为模板,上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物,其中每条引物分别配制成10u mol/L的工作浓度。进行实时荧光定量PCR扩增反映,每个样品设置3个重复,扩增后所得到3个重复管的Ct值取平均数;
(7)不同处理下,CsCBF1基因的相对表达量计算:实时荧光定量PCR完成后,根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2-ΔΔCt值,计算方式如下:
ΔCt=Ct(CsCBF1基因)-Ct(GAPDH基因)
ΔΔCt=ΔCt(处理N小时)-ΔCt(处理0小时)
以2-ΔΔCt数值表示处理时间N小时时,CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。
本发明更加详细的试验方法如下:
(1)实验材料的处理:将两年生扦插苗乌牛早移至营养钵中,置于光照培养箱中培养两周,培养条件:白天25℃(16h),晚上18℃(8h)。然后进行如下处理:
A.低温处理:以正常生长条件下(25℃)培养的茶苗为对照,在光照培养箱中对茶苗进行4、-5℃低温处理(无光照),处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶,迅速用液氮收集,-70保存,备用。
B.脱水处理:向生长植株的营养钵内一次性浇以15%-30%的PEG600溶液20ml,对照组浇以等量的蒸馏水;处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶,迅速用液氮收集,-70保存,备用。
C.激素处理:油菜素内酯(BR)处理:在25℃条件下向茶苗喷施0.1-1.5mg/L的BR溶液处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶,迅速用液氮收集,-70保存,备用。
(2)总RNA的提取与纯化:EASY spin植物RNA快速提取试剂盒,从所取的一芽两叶中提取得到总RNA。
(3)cDNA第一链的合成:cDNA第一链的合成采用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒,反转录引物使用试剂盒所提供的Oligo(dT)18引物,以总RNA为模板合成cDNA第一链,反应体系为20ul。
(4)内参基因的选择:内参须满足:①在研究中样本之间的表达是相似的;②处理因素不会影响其表达;③与待测基因同时进行相同的扩增等要求。根据以上原则本实验选择GAPDH为内参基因。
(5)荧光定量引物设计:根据CsCBF1基因的全长序列,使用Primer5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物,引物序列如下:
yF:5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’;
yR:5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’;
CsCBF1基因的PCR产物预计长度为235bp,琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的长度与预计产物长度一致,且为但一条带,说明所设计的引物具有很强的特异性,适合用于实时荧光定量PCR检测;琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
作为实时荧光定量PCR内参基因GAPDH的引物序列如下:
GAPDH-F:5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’
GAPDH-R:5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
GAPDH的PCR产物预计长度为206bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致,且为但一条带,说明所设计的引物具有很强的特异性,适合用于实时荧光定量PCR检测;琼脂糖凝胶电泳结果如图2。
(6)实时荧光定量PCR:实时荧光定量PCR采用德国罗氏公司LigntCycler480实时荧光定量PCR仪(配有该公司提供的LigntCycler480荧光定量分析软件)、Fermentas公司的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行。以上述(3)中合成的cDNA第一链为模板,上述(5)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增反映,每个样品设置3个重复,扩增后所得到3个重复管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值所经历的反应循环数)取平均数;
实时荧光定量PCR反应体系如下:
实时荧光定量PCR反应程序如下:
95℃5min
(7)不同处理下,CsCBF1基因的相对表达量计算:实时荧光定量PCR完成后,根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2-ΔΔCt值,计算方式如下:ΔCt=Ct(CsCBF1基因)-Ct(GAPDH基因)ΔΔCt=ΔCt(处理N小时)-ΔCt(处理0小时)
以2-ΔΔCt数值表示处理时间N小时时,CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。GAPDH基因是看家基因,在所有类型的细胞中都进行表达,看家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响,而不受其他机制调节,受环境因素影响很小,表达水平较为恒定。因此,看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中2-ΔΔCt数值越大,表明CsCBF1基因的表达量越高。
图3为4℃处理下CsCBF1基因的表达变化,从图中可以看出,常温条件下,CsCBF1基因的表达量很低,几乎检测不到其转录物的存在。低温处理1h后,CsCBF1开始表达,随后逐渐升高,8h达到较高值,随后有短暂的下调,直到24h达到最高值,且表达较持久。图4为-5℃处理下CsCBF1基因的表达变化,从图中可以看出,除了处理0.5h时,CsCBF1的表达有微小的提高外,其余各时间CsCBF1的表达均低于对照(处理0h)表达水平,表达水平较低。图5为干旱胁迫下CsCBF1基因的表达变化,从图中可以看出,在处理2h、4h时,CsCBF1表达低于对照(处理0h)表达水平,其余时间CsCBF1基因的表达均有所提高,但变化很小,且整体表达水平不高。图6为常温下喷油菜素内酯,CsCBF1基因的表达变化,从图可以看出经油菜素内酯处理后,CsCBF1基因的表达水平均低于对照(表达水平低于1),几乎检测不到表达。以上结果显示,4℃低温条件可以显著提高CsCBF1基因的表达水平,而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。
本发明提供的特异性引物快速检测CsCBF1基因表达的方法与现有技术相比的有益效果是:
(1)本发明采用的实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术由自动化仪器收集荧光信号,避免了肉眼判断的主观性,可进一步提高灵敏度;实时荧光定量PCR技术全封闭反应,无须PCR后续处理,避免污染,保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光定量PCR技术也免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤,大大缩短了实验时间。
(2)通过对茶树进行不同处理,发现4℃可以显著提高CsCBF1基因的表达水平,而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。这与拟南芥、水稻等作物CBF1基因的研究有明显的差异。
附图说明
图1为CsCBF1基因实时荧光定量PCR产物电泳结果;CsCBF1产物长度235bp,Marker条带从上而下依次为:2000、1000、750、500、250、100bp;
图2为内参基因GAPDH实时荧光定量PCR产物电泳结果;GAPDH的PCR产物预计长度为206bp,Marker条带从上而下依次为:2000、1000、750、500、250、100bp;
图3为4℃处理下CsCBF1基因的表达变化;
图4为-5℃处理下CsCBF1基因的表达变化;
图5为干旱胁迫下CsCBF1基因的表达变化;
图6为常温下喷油菜素内酯,CsCBF1基因的表达变化。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明,这里所述实施例的方案,不限制本发明,本领域的专业人按照本发明的精神可以对其进行改进和变化,所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内,本发明的范围和实质由权利要求来限定;其中所用试剂均有市售。
实施例:
1.实验材料的处理:将两年生扦插苗乌牛早移至营养钵中,置于光照培养箱中培养两周,培养条件:白天25℃(16h),晚上18℃(8h)。然后进行如下处理:
A.低温处理:以正常生长条件下(25℃)培养的茶苗为对照,在光照培养箱中对茶苗进行4、-5℃低温处理(无光照),处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶,迅速用液氮收集,-70保存,备用。
B.脱水处理:向生长植株的营养钵内一次性浇以20%的PEG600溶液20ml,对照组浇以等量的蒸馏水;处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶,迅速用液氮收集,-70保存,备用。
C.激素处理:油菜素内酯(BR)处理:在25℃条件下向茶苗喷施1mg/L的BR溶液处理0、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h分别取一芽两叶,迅速用液氮收集,-70保存,备用。
2.总RNA的提取和纯化:
(1)取500ul裂解液RLT(已经加入β-巯基乙醇),转入1.5ml离心管中,加入50ulPLANTaid混匀备用。
(2)液氮中研磨适量植物组织成细粉后,取约50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管中,立即用手剧烈震荡20s,充分裂解。
(3)将裂解物12000rpm离心5-10min。沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid,将所有裂解物上清转到一个新离心管中。
(4)估计上清体积,加入1/2体积的无水乙醇。立即吹打混匀,不要离心。
(5)将混匀物(每次小于700ul,多可以分两次加入)加入到一个吸附柱RA中(吸附柱放入收集管中)12000rpm离心60s,弃掉废液。
(6)加700ul去蛋白液RW1,室温静置30s,12000rpm离心30s,弃废液。
(7)加500ulRW,12000rpm离心30s,弃废液,加入500ulRW,重复一遍。
(8)将吸附柱RA放回空收集管中,12000离心2min,并静置一会儿,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(9)取出吸附柱RA,放入一个RNase-free离心管中,在吸附膜中间部位加50ulRNase free Water,室温静置1min,12000rpm离心1min。
(10)提取的总RNA可用DNaseI酶(Fermentas公司)进一步纯化,以去除RNA中残存的DNA,具体如下:往0.2mL离心管中加入3ul提取的总RNA、3ul 10×reaction buffer with MgCl2,3ul DNase I,DEPC水补至总体积到10ul,37℃温浴30min,加入1ul 50mMEDTA,65℃温浴10min。即得纯化的总RNA。
3.cDNA第一链合成:以2所述纯化的茶树叶片总RNA作为模板,使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒,
(1)将试剂盒中各组分融化、混匀、离心、储存在冰上。
(2)在无菌、无RNase的离心管中加入以下个成分:
(3)按顺序加入以下组分:
(4)温和混匀,离心。
(5)42℃温浴60min。
(6)70℃热激5min.
4.CsCBF1基因的实时荧光定量PCR检测:
(1)引物设计:
根据CsCBF1基因的全长序列,使用Primei5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物,引物序列如下:
yF:5’-TTTGCTGACTCGGTTTGGAG-3’;
yR:5’-TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA-3’;
CsCBF1基因的PCR产物预计长度为235bp,琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的长度与预计产物长度一致,且为但一条带,说明所设计的引物具有很强的特异性,适合用于实时荧光定量PCR检测;琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
作为实时荧光定量PCR内参基因GAPDH的引物序列如下:
GAPDH-F:5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’
GAPDH-R:5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3
GAPDH的PCR产物预计长度为206bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致,且为但一条带,说明所设计的引物具有很强的特异性,适合用于实时荧光定量PCR检测;琼脂糖凝胶电泳结果如图2。
(2)实时荧光定量PCR:
实时荧光定量PCR使用德国罗氏公司LigntCycler480实时荧光定量PCR仪(配有该公司提供的LigntCycler480荧光定量分析软件)。采用Fermentas公司的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行。以上述(2)中合成的cDNA第一链为模板,上述(1)中yF、yR、GAPDH-F和GAPDH-R为特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增反映,每个样品设置3个重复,扩增后所得到3个重复管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值所经历的反应循环数)取平均数。
实时荧光定量PCR反应体系设置如下:
实时荧光定量PCR反应程序如下:
95℃5min
(3)不同处理下,CsCBF1基因的相对表达量计算:
实时荧光定量PCR完成后,根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2-ΔΔCt值,计算方式如下:
ΔCt=Ct(CsCBF1基因)-Ct(GAPDH基因)
ΔΔCt=ΔCt(处理N小时)-ΔCt(处理0小时)
以2-ΔΔCt数值表示处理时间N小时时,CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。GAPDH基因是看家基因,在所有类型的细胞中都进行表达,看家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响,而不受其他机制调节,受环境因素影响很小,表达水平较为恒定。因此,看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中2-ΔΔCt数值越大,表明CsCBF1基因的表达量越高。
图3为4℃处理下CsCBF1基因的表达变化,从图中可以看出,常温条件下,CsCBF1基因的表达量很低,几乎检测不到其转录物的存在。低温处理1h后,CsCBF1开始表达,随后逐渐升高,处理8h达到较高值,随后有短暂的下调,直到24h达到最高值。且表达较持久。图4为-5℃处理下CsCBF1基因的表达变化,从图中可以看出,除了处理0.5h时,CsCBF1的表达有微小的提高外,其余各时间CsCBF1的表达均低于对照(处理0h)表达水平,表达水平较低。图5为干旱胁迫下CsCBF1基因的表达变化,从图中可以看出,在处理2h、4h时,CsCBF1表达低于对照(处理0h)表达水平,其余时间CsCBF1基因的表达均有所提高,但变化很小,且表达水平均不高。图6为常温下喷油菜素内酯,CsCBF1基因的表达变化。从图可以看出经油菜素内酯处理后,CsCBF1基因的表达水平均低于对照(表达水平低于1),几乎检测不到表达。以上结果显示,4℃低温条件可以显著提高CsCBF1基因的表达水平,而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。
通过对茶树进行不同处理,发现4℃可以显著提高CsCBF1基因的表达水平,而-5℃、干旱、油菜素内酯均不能诱导CsCBF1基因的表达。这与拟南芥、水稻等作物CBF1基因的研究有明显的差异。