CN105132417B - 茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用 - Google Patents
茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105132417B CN105132417B CN201510564178.3A CN201510564178A CN105132417B CN 105132417 B CN105132417 B CN 105132417B CN 201510564178 A CN201510564178 A CN 201510564178A CN 105132417 B CN105132417 B CN 105132417B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- rrna
- mirna
- tea tree
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 240000003553 Leptospermum scoparium Species 0.000 title claims abstract description 63
- 235000009024 Ceanothus sanguineus Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- 235000015459 Lycium barbarum Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract 14
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 27
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 26
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 23
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 21
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 20
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 claims description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 6
- -1 26S rRNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 claims description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 108091040297 miR396 stem-loop Proteins 0.000 claims 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 56
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 3
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100232687 Drosophila melanogaster eIF4A gene Proteins 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009746 freeze damage Effects 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108050001326 26S Proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 description 1
- 102100029510 26S proteasome regulatory subunit 6A Human genes 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001270131 Agaricus moelleri Species 0.000 description 1
- 102000000131 Beta tubulin Human genes 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000807344 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 A Proteins 0.000 description 1
- 101000807337 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 B Proteins 0.000 description 1
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 description 1
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037261 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 A Human genes 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108091083800 miR396b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 101150112970 up gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc‑222‑3p，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，及其筛选方法，该方法挑选了6个常见植物miRNA内参基因，和3个茶树miRNA作为候选内参基因，利用qRT‑PCR技术，通过BestKeeper和geNorm两个软件来评估候选内参基因在不同低温胁迫下及不同茶树组织中的表达稳定性，以期为茶树低温胁迫下miRNA差异表达分析的内参基因选择提供参考。获得的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc‑222‑3p在不同温度处理下和在茶树不同组织中，其基因表达均稳定，可以作为茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR的内参基因。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用。
背景技术
茶树(Camellia sinensis)原产于我国热带及亚热带，是一种喜温畏寒的多年生经济作物。随着茶产业的不断发展，茶树种植区域向北扩展到北纬38°，我国大部分茶区，特别是高山茶园，常遭遇到越冬期低温冻害或春季“倒春寒”。寒冻害已成为我国茶叶优质高产栽培生产中一个较为突出、亟待解决的问题。长期以来，茶园抗寒一般都是采用优化栽培措施、改善栽培条件来提高茶树的耐寒性，但是品种的抗寒遗传特性才是起决定作用的因素。因此，研究茶树对寒冻害的抗逆机制，解析其响应低温的基因表达调控网络，有针对性地发掘相关抗性基因并加以利用，对开展茶树分子育种工作有着积极意义。
基因表达分析在生物学研究中已成为一个揭示基因水平和生长机制的重要方法。实时荧光定量PCR(the real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)与传统PCR相比，由于具有重复性好，特异性强和灵敏度高及高通量等特点，已经成为一种快速且可靠的基因转录水平的定量方法。然而，有效的qRT-PCR却取决于很多因素，如提取的RNA的质量、反转录的效率、引物特异性以及数据处理方法等，而采用稳定表达的内参基因来控制实验误差也是必要的。
在qRT-PCR中，最常用的植物内参基因有甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白基因(β-actin,ACT)、翻译延伸因子(translation elongation factor,TEF)、β-微管蛋白(β-tubulin,TUB)、18S核糖体RNA基因(18S ribosomal RNA protein,18S rRNA)以及25S核糖体RNA基因(25S ribosomal RNAprotein,25S rRNA)等。在用qRT-PCR分析基因的相对表达时，研究者们发现不经筛选直接使用常见内参基因，会降低实验结果的准确性。如U6是研究miRNA相对表达量最常用的一个内参基因，已有报道表明U6在人正常和癌变组织中的表达是不稳定的，其结果所导致的差异近62倍，不可作为该研究的内参基因。Szabo等人认为在所有样本中都无差异表达的内参基因是不存在的，作为常用内参基因的持家基因的表达也不是一直稳定不变的。为了找到适合的内参基因，一般实验前要对多个候选内参基因的稳定性进行评估。在紫花苜蓿不同组织中，5个候选内参基因(18S rRNA、β-actin、EF-1α、UBC2、TUB)中属18S rRNA和EF-1α的表达最稳定；在苹果着色不同时间点的果皮中，4个常用候选持家基因(β-actin、EF-1α、GAPDH、18S rRNA)中属EF-1α和18S rRNA是比较理想的内参基因；多年生黑麦草在非生物胁迫下，6个候选内参基因(eIF4A、TBP-1、E2、UBQ、ZTL、GAPDH)中，eIF4A和UBQ可作为不同胁迫下的内参基因；在茶树的94个不同样品中检测11个候选内参基因的稳定性发现，3个常被使用的持家基因(CsTUBULIN1,CsACINT1、Cs18S rRNA1)是最不稳定的，而CsPTB1,CsEF1,CsSAND1,CsCLATHRIN1和CsUBC1的稳定性却位列前五。
microRNA(miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码小片段RNA，在基因的转录后调控上起到重要作用，对其表达水平的定量研究已成为一种常见实验，选择合适的内参基因是确保实时荧光定量PCR(qRT-PCR)准确性的先决条件。与具有编码功能的基因的定量分析有所不同，常用于miRNA荧光定量的内参基因多为一些片段长度相对较短的基因，如U6(small nuclear RNA)、5.8S核糖体rRNA(5.8S ribosomal RNA protein,5.8S rRNA)、5S核糖体rRNA(5S ribosomal RNA protein,5S rRNA)等，像GAPDH、18S rRNA等也有使用。关于常用内参基因稳定性的争议一直不断，不少实验证实这些常用内参基因在不同物种、组织以及试验处理下，其表达并不是恒定不变的。
为了探讨miRNA在茶树低温胁迫下的调控机制，筛选出低温胁迫下稳定表达的茶树miRNA qRT-PCR内参基因，这也是开展miRNA差异表达的定量分析前需要解决的关键问题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面，本发明提供一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p的前体，其具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，该前体可在茶树细胞内被剪切且表达成miRNA Pc-222-3p。
再一方面，本发明还提供上述茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：
1)选择内参候选基因及引物设计：
选择6个植物miRNA内参基因U6、18S rRNA、26S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA和GAPDH，另外选择3个茶树miRNA cs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p作为内参候选基因，其中，cs-miR396的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，Pc-45545-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，并设计荧光定量PCR引物；
2)内参候选基因的荧光定量PCR实验：
提取不同温度处理下的茶树成熟叶片和4℃下茶树不同器官样品的RNA，反转录生成第一链miRNA cDNA，作为荧光定量PCR的模板，以步骤1)中设计的引物为荧光定量PCR引物，进行荧光定量PCR实验,获得荧光定量PCR数据；
3)内参候选基因的稳定性分析：
利用BestKeeper和geNorm软件对步骤2)中获得的荧光定量PCR数据进行表达稳定性分析，筛选出稳定表达的内参基因；
其中，用BestKeeper进行Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)分析，Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)越小，基因表达稳定性越高；用geNorm对基因表达稳定度的平均值M进行分析，以基因表达稳定度的平均值M作为评估内参表达稳定性的阈值，M值越低，基因表达稳定性越高。
优选地，所述步骤1)中，所述内参候选基因的荧光定量PCR引物为：
U6的正向引物U6F如SEQ ID NO:5所示，反向引物U6R如SEQ ID NO:6所示；
18S rRNA的正向引物18S rRNA F如SEQ ID NO:7所示，反向引物18S rRNA R如SEQID NO:8所示；
26S rRNA的正向引物26S rRNA F如SEQ ID NO:9所示，反向引物26S rRNA R如SEQID NO:10所示；
5.8S rRNA的正向引物5.8S rRNA F如SEQ ID NO:11所示，反向引物5.8S rRNA R如SEQ ID NO:12所示；
5S rRNA的正向引物5S rRNA F如SEQ ID NO:13所示，反向引物5S rRNA R如SEQID NO:14所示；
GAPDH的正向引物GAPDH F如SEQ ID NO:15所示，反向引物GAPDH R如SEQ ID NO:16所示；
cs-miR396b的正向引物cs-miR396b F如SEQ ID NO:17所示，反向引物cs-miR396bR由miRNA荧光定量PCR试剂盒(miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green))提供；
Pc-222-3p的正向引物Pc-222-3p F如SEQ ID NO:18所示，反向引物Pc-222-3p R由miRNA荧光定量PCR试剂盒(miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green))提供；
Pc-45545-5p的正向引物Pc-45545-5p F如SEQ ID NO:19所示，反向引物Pc-45545-5p R由miRNA荧光定量PCR试剂盒(miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBRGreen))提供。具体序列参见表1。
优选地，所述步骤2)中，所述不同温度处理指在25℃、4℃、0℃和-4℃下处理8小时；所述不同器官包括成熟叶、芽、嫩茎、种子、根。
优选地，所述步骤2)中，所述荧光定量PCR实验的程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，60℃退火延伸34s，40个循环，，然后进行60～95℃溶解曲线分析，溶解曲线数据由实时荧光定量PCR仪自动读取。
表1 qRT-PCR中候选内参基因的引物序列及扩增长度
因此，还一方面，本发明提供茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p作为茶树低温胁迫下miRNA qRT-PCR内参基因的应用。
本发明挑选了9个候选内参基因，利用qRT-PCR技术，通过BestKeeper和geNorm两款软件来评估候选基因在不同低温胁迫下及不同茶树组织中的表达稳定性，结果发现一种茶树miRNA Pc-222-3p的表达稳定性好，可作为茶树低温胁迫下miRNA qRT-PCR的内参基因。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为茶树不同温度和不同组织总RNA 1.2％琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2为9个茶树候选内参基因PCR扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳图谱；
图3为9个茶树候选内参基因的qRT-PCR熔解曲线；
图4为geNorm软件分析9个茶树候选内参基因的表达稳定性，其中，A为不同温度处理下；B为不同组织中。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，RNA纯化试剂盒购自Axygen公司，植物总RNA提取试剂盒、DNA polymerase、pMD19-T Simple Vector购自TaKaRa公司，miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量试剂盒(SYBR Green)购自Tiangen公司。
实施例
选择miRNA qRT-PCR内参候选基因及引物设计
选择6个常用于植物miRNA qRT-PCR的内参基因(U6、18S rRNA、26S rRNA、5.8SrRNA、5S rRNA和GAPDH)和3个表达较稳定的茶树miRNA(cs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p)，以这9个miRNA作为内参候选基因。miRNA U6、18S rRNA、26S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA和GAPDH的序列来源于NCBI，茶树miRNA cs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p的序列来源于茶树基因组测序数据和miRNA低温测序文库，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示。
利用Primer Premier 5.0软件设计内参基因上下游引物。U6、18S rRNA、26SrRNA、5.8S rRNA、5S rRNA和GAPDH的上下游引物根据具体序列设计，茶树miRNA(cs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p)上游引物是以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，通过在引物两端增减碱基以达到合适的Tm值和GC％含量，下游引物由试剂盒miRcutemiRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)提供，引物序列及扩增长度、退火温度和GC(％)如表1所示。所有引物都是由上海生工公司合成。
其中，9种内参候选基因的荧光定量PCR引物序列如下：
U6的正向引物U6F如SEQ ID NO:5所示，反向引物U6R如SEQ ID NO:6所示；
18S rRNA的正向引物18S rRNA F如SEQ ID NO:7所示，反向引物18S rRNA R如SEQID NO:8所示；
26S rRNA的正向引物26S rRNA F如SEQ ID NO:9所示，反向引物26S rRNA R如SEQID NO:10所示；
5.8S rRNA的正向引物5.8S rRNA F如SEQ ID NO:11所示，反向引物5.8S rRNA R如SEQ ID NO:12所示；
5S rRNA的正向引物5S rRNA F如SEQ ID NO:13所示，反向引物5S rRNA R如SEQID NO:14所示；
GAPDH的正向引物GAPDH F如SEQ ID NO:15所示，反向引物GAPDH R如SEQ ID NO:16所示；
cs-miR396b的正向引物cs-miR396b F如SEQ ID NO:17所示，反向引物cs-miR396bR由miRNA荧光定量PCR试剂盒(miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green))提供；
Pc-222-3p的正向引物Pc-222-3p F如SEQ ID NO:18所示,反向引物Pc-222-3p R由miRNA荧光定量PCR试剂盒(miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green))提供；
Pc-45545-5p的正向引物Pc-45545-5p F如SEQ ID NO:19所示,反向引物Pc-45545-5p R由miRNA荧光定量PCR试剂盒(miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBRGreen))提供。
总RNA的提取和miRNA cDNA第一链的合成
材料为一年生盆栽茶树[Camellia sinensis(L)O.Kuntze]品种—‘白毫早’扦插苗，高约25cm。分别在25、4、0和-4℃，处理8小时后，采取成熟叶；4℃处理下采取不同茶树器官：芽、嫩茎和幼根和种子。所有样品收集后用液氮速冻，-80℃储藏备用。总RNA的提取参照TaKaRa公司的Fruit-mateTM for RNA Purification(with RNAiso Plus)方法，提取之后用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性，核酸定量仪测定OD260/OD280和OD260/OD230的值，检测RNA的纯度和浓度。miRNA cDNA第一链的合成参照miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(TIANGEN公司)说明书。产物稀释到100ng.μL-1用于后续的定量实验。
采用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA样品，结果如图1所示，其中，泳道1-4表示不同温度处理下(依次为25、0、-4和4℃)的茶树成熟叶片总RNA，泳道4～8表示4℃下茶树不同器官(依次为成熟叶、芽、嫩茎、种子、根)总RNA。凝胶成像系统分析结果显示：28S和18S亚基条带清晰，28S/18S灰度比约为2.0，而5S亚基亮度低，无拖尾现象和其它杂带，可认为提取的Total RNA质量较好，完全可以满足后续实验的需求。
内参候选基因的克隆及真实性验证
茶树叶片总RNA经poly(A)加尾反转录生成第一链miRNA cDNA，以所述第一链miRNA cDNA为模板，以表1中PCR引物为扩增引物，进行PCR反应以克隆内参候选基因，PCR反应体系：10×PCR buffer,5ul；dNTP(2.5mM),4ul；上下游引物(10uM)各0.5ul；rTaq,0.3ul；cDNA模板，1ul；ddH2O,23.7ul,总体积共25ul。反应条件为94℃3min；94℃30s,58℃30s,72℃20s,35Cycles；72℃10min。PCR扩增后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并将PCR扩增产物连接到pMD19-T Simple Vector，由上海英俊生物工程有限公司完成测序。
琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，结果表明，9条内参候选基因条带单一，扩增产物大小符合预期(表1)。其中，M：Marker 500；泳道1-9分别表示9种内参候选基因，1:U6；2:GAPDH；3:18S rRNA；4:26S rRNA；5:5S rRNA；6:5.8S rRNA；7:cs-miR396b；8:pc-222-3p；9:pc-45545-5p。将扩增产物进行测序比对，结果与9条内参候选基因序列完全一致。
miRNA内参候选基因的qRT-PCR反应
分别选取上述不同温度处理(25、4、0和-4℃)下的茶树成熟叶片和4℃下茶树不同器官(芽、嫩茎和幼根和种子)的第一链miRNA cDNA作为模板，以表1中的荧光定量PCR引物为荧光定量PCR引物，按照miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)说明配制20μL PCR反应体系：2×miRcute miRNA Premix(with SYBR&ROX)10μL、Forward Primer(10μM)和Reverse Primer(10μM)各0.4μL、miRNA第一链cDNA 2μL、RNase-Free ddH2O 7.2μL。每个样品做3个技术重复，每个候选内参基因都设不加模板的阴性对照，以检验扩增的背景。反应的条件为：94℃预变性2min，94℃变性20s，60℃退火延伸34s，40个循环，然后进行60～95℃溶解曲线分析，数据由实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国)自动读取。
内参候选基因Ct值及引物特异性分析
图3为9个茶树候选内参基因的qRT-PCR溶解曲线，其中A:Pc-222-3p；B:5S rRNA；C:U6；D:5.8S rRNA；E:26S rRNA；F:18S rRNA；G:GAPDH；H:cs-miR396b；I:Pc-45545-5p，9个候选基因的平均Ct值为17-30，其中18S rRNA和5S rRNA的Ct值都在18左右，表明它们在样本中的起始拷贝数很高，表达丰度高。9个候选内参基因的熔解曲线均呈显著的单一峰，说明引物能特异地扩增目的片段，且每个样品的扩增曲线重复性较好，表明qRT-PCR结果较准确。
内参候选基因的稳定性分析
用BestKeeper(http://www.gene-quantification.de/bestkeeper.html)和geNorm(http://medgen.ugnt.be/～jvdesomp/genorm/)软件分析获得的荧光定量PCR数据，以进行9个候选内参基因在不同温度以及不同组织中的表达稳定性进行分析，筛选出稳定表达的内参基因。
将9个候选内参基因的Ct值直接输入BestKeeper软件中计算Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)，通过比较Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)来判断各内参基因的稳定性，Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)越小，候选内参基因的表达稳定性越高。结果如表2和表3所示，不同温度处理下和茶树不同组织中Pc-222-3p的Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)均最小，因此其表达最稳定，其次是18S rRNA、26S rRNA。而U6、5.8S rRNA、GAPDH等基因SD值或CV值较大，表达并不稳定。
利用geNorm软件进一步评估9个候选内参基因在不同温度和不同组织器官中的表达稳定性。geNorm软件分析时需要将Ct值转换成相对表达量Q，Q＝EΔCt，E为基因扩增效率，ΔCt＝Ctmin-Ct(Ctmin:样品中最低值；Ct:每个样品的值)。geNorm软件通过计算基因表达稳定度的平均值(M)来对基因表达稳定度进行排序。M值是由单个内参基因与其他所有选择内参基因Q值两两相除取log2值，然后计算其标准偏差，最后取n-1个标准偏差的算术平均数作为M值。M值越低，基因表达稳定性越好，geNorm软件默认将M＝1.5作为评估内参表达稳定性的阈值。结果如图4所示，在不同温度处理下，只有26S rRNA M值高于1.5，其他(8个)候选基因表达都较稳定(M<1.50)，其中Pc-222-3p和18S rRNA的M值最小(M＝0.076)(图4a)；在茶树不同组织中有5个基因表达稳定(M<1.50)，其中Pc-222-3p和5.8S rRNA的M值最小(M＝0.761)，而常用的内参U6的M值为1.62，并不稳定(图4b)。综合BestKeeper和geNorm软件分析结果，表明茶树miRNA Pc-222-3p在不同温度处理下和不同组织器官中荧光定量PCR实验的Ct值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)均最小，基因表达稳定度的平均值M最低，因此，茶树miRNA Pc-222-3p基因表达稳定性高，可以作为茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR的内参基因。
表2不同温度处理下9个茶树候选内参基因稳定性的BestKeeper分析
表3茶树不同组织器官中9个候选内参基因稳定性的BestKeeper分析
miRNA Pc-222-3p序列为UUUCCAAGACCACCCAUGCCGA(SEQ ID NO：1)，不能比对到miRBase(20.0)中现有miRNA的成熟体及前体序列，但可以比对到茶树基因组上。延伸其在茶树基因组中序列，获得其前体序列为aaaaaauuacauguagacagagagaggaauaagagggaaagggaggcagaucugcacgaaguuauuggcauggugaucuugggaaagaaagaguuguguuuuagaucuUUUCCAAGACCACCCAUGCCGAugauuucuugcggauccucccuuucccuaacuuguccuauuuagaucuaaucuuaauuuaug(SEQID NO：2)，该前体可在茶树细胞内被剪切且表达成miRNA Pc-222-3p。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (7)
1.一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一种根据权利要求1所述的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p的前体，其具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.一种根据权利要求1所述的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：
1)选择内参候选基因及引物设计：
选择6个植物miRNA内参基因U6、18S rRNA、26S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA和GAPDH，另外选择3个茶树miRNA cs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p作为内参候选基因，其中，cs-miR396的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，Pc-45545-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，并设计荧光定量PCR引物；
2)内参候选基因的荧光定量PCR实验：
提取不同温度处理下的茶树成熟叶片和4℃下茶树不同器官样品的RNA，反转录生成第一链miRNA cDNA，作为荧光定量PCR的模板，以步骤1)中设计的引物为荧光定量PCR引物，进行荧光定量PCR实验,获得荧光定量PCR数据；
3)内参候选基因的稳定性分析：
利用BestKeeper和geNorm软件对步骤2)中获得的荧光定量PCR数据进行表达稳定性分析，筛选出稳定表达的内参基因；
其中，用BestKeeper进行Ct值的标准偏差和变异系数分析，Ct值的标准偏差和变异系数越小，基因表达稳定性越高；用geNorm对基因表达稳定度的平均值M进行分析，以基因表达稳定度的平均值M作为评估内参表达稳定性的阈值，M值越低，基因表达稳定性越高。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述内参候选基因的荧光定量PCR引物为：
U6的正向引物U6F如SEQ ID NO:5所示，反向引物U6R如SEQ ID NO:6所示；
18S rRNA的正向引物18S rRNA F如SEQ ID NO:7所示，反向引物18S rRNA R如SEQ IDNO:8所示；
26S rRNA的正向引物26S rRNA F如SEQ ID NO:9所示，反向引物26S rRNA R如SEQ IDNO:10所示；
5.8S rRNA的正向引物5.8S rRNA F如SEQ ID NO:11所示，反向引物5.8S rRNA R如SEQID NO:12所示；
5S rRNA的正向引物5S rRNA F如SEQ ID NO:13所示，反向引物5S rRNA R如SEQ IDNO:14所示；
GAPDH的正向引物GAPDH F如SEQ ID NO:15所示，反向引物GAPDH R如SEQ ID NO:16所示；
cs-miR396b的正向引物cs-miR396b F如SEQ ID NO:17所示，反向引物cs-miR396b R由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
Pc-222-3p的正向引物Pc-222-3p F如SEQ ID NO:18所示，反向引物Pc-222-3p R由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；
Pc-45545-5p的正向引物Pc-45545-5p F如SEQ ID NO:19所示，反向引物Pc-45545-5pR由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述不同温度处理指在25℃、4℃、0℃和-4℃下处理8小时；所述不同器官包括成熟叶、芽、嫩茎、种子、根。
6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述荧光定量PCR实验的程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，60℃退火延伸34s，40个循环，然后进行60～95℃溶解曲线分析，溶解曲线数据由实时荧光定量PCR仪自动读取。
7.一种根据权利要求1所述的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p作为茶树低温胁迫下miRNA的qRT-PCR内参基因的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510564178.3A CN105132417B (zh) | 2015-09-07 | 2015-09-07 | 茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510564178.3A CN105132417B (zh) | 2015-09-07 | 2015-09-07 | 茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105132417A CN105132417A (zh) | 2015-12-09 |
| CN105132417B true CN105132417B (zh) | 2017-09-26 |
Family
ID=54717987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510564178.3A Active CN105132417B (zh) | 2015-09-07 | 2015-09-07 | 茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105132417B (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105505923B (zh) * | 2015-12-24 | 2019-04-09 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 烟草25s rna内参基因的克隆方法及其应用 |
| CN105543220A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-05-04 | 安徽农业大学 | 茶树snRNA U6基因及其应用 |
| CN106874707A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-20 | 安徽农业大学 | 一种与杨树抗逆基因表达调控相关的内参基因的筛选方法 |
| CN107475416B (zh) * | 2017-09-21 | 2021-04-06 | 福建省农业科学院果树研究所 | 用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用 |
| CN107385104B (zh) * | 2017-09-21 | 2020-09-11 | 福建省农业科学院果树研究所 | 用于筛选莲雾果实发育过程内参基因的引物对及其应用 |
| CN109266780B (zh) * | 2018-11-28 | 2019-11-05 | 南京林业大学 | 海州常山盐胁迫下荧光定量内参基因及其引物和应用 |
| CN110157776B (zh) * | 2019-05-21 | 2022-10-25 | 中国农业科学院烟草研究所 | 盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法 |
| CN110982925B (zh) * | 2019-12-27 | 2022-09-13 | 广东省农业科学院环境园艺研究所 | 白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因及应用 |
| CN111100945B (zh) * | 2020-01-17 | 2022-06-21 | 华南农业大学 | 红椿的内参基因及其引物和应用 |
| CN112813181B (zh) * | 2021-02-04 | 2022-07-26 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 适用于雪茄烟不同组织基因表达分析的内参基因及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103911425B (zh) * | 2013-01-04 | 2015-08-26 | 青岛农业大学 | 一种采用实时定量pcr技术检测茶树cbf1基因表达的方法 |
| CN104830859B (zh) * | 2015-04-24 | 2017-10-10 | 浙江大学 | 一种茶树miRNA及其应用 |
-
2015
- 2015-09-07 CN CN201510564178.3A patent/CN105132417B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105132417A (zh) | 2015-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105132417B (zh) | 茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用 | |
| Maroufi et al. | Validation of reference genes for gene expression analysis in chicory (Cichorium intybus) using quantitative real-time PCR | |
| Manoli et al. | Evaluation of candidate reference genes for qPCR in maize | |
| Gimeno et al. | Selection and validation of reference genes for gene expression analysis in switchgrass (Panicum virgatum) using quantitative real-time RT-PCR | |
| Duan et al. | Identification of optimal reference genes for expression analysis in radish (Raphanus sativus L.) and its relatives based on expression stability | |
| Wang et al. | Evaluation and selection of reliable reference genes for gene expression under abiotic stress in cotton (Gossypium hirsutum L.) | |
| Liu et al. | Genome-wide identification and comparative analysis of drought-related microRNAs in two maize inbred lines with contrasting drought tolerance by deep sequencing | |
| Fernandez et al. | Comparison of predictive methods and biological validation for qPCR reference genes in sunflower leaf senescence transcript analysis | |
| Sun et al. | Identification and comparative profiling of miRNAs in an early flowering mutant of trifoliate orange and its wild type by genome-wide deep sequencing | |
| Xia et al. | Analysis of multiple transcriptomes of the African oil palm (Elaeis guineensis) to identify reference genes for RT-qPCR | |
| Wang et al. | Genome-wide screening and characterization of long non-coding RNAs involved in flowering development of trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.) | |
| Shi et al. | Identification of differentially-expressed genes associated with pistil abortion in Japanese apricot by genome-wide transcriptional analysis | |
| Wang et al. | Validation of reference genes for quantitative real-time PCR during Chinese wolfberry fruit development | |
| Wang et al. | Validation of reference genes for gene expression by quantitative real-time RT-PCR in stem segments spanning primary to secondary growth in Populus tomentosa | |
| Chan et al. | Evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR in oil palm elite planting materials propagated by tissue culture | |
| Gao et al. | Identification of conserved and novel microRNAs in Aquilaria sinensis based on small RNA sequencing and transcriptome sequence data | |
| Kong et al. | Assessment of suitable reference genes for quantitative gene expression studies in melon fruits | |
| CN104830859B (zh) | 一种茶树miRNA及其应用 | |
| Salcedo et al. | Comparative expression analysis of reference genes in field-grown cassava | |
| Luo et al. | Integrated microRNA and mRNA expression profiling reveals a complex network regulating pomegranate (Punica granatum L.) seed hardness | |
| Rao et al. | Combined analysis of microRNAs and target genes revealed miR156-SPLs and miR172-AP2 are involved in a delayed flowering phenomenon after chromosome doubling in black goji (Lycium ruthencium) | |
| Tang et al. | Reference gene selection for qPCR normalization of Kosteletzkya virginica under salt stress | |
| Rett-Cadman et al. | QTL and transcriptomic analyses implicate cuticle transcription factor SHINE as a source of natural variation for epidermal traits in cucumber fruit | |
| Hu et al. | Transcriptome and microRNA sequencing identified miRNAs and target genes in different developmental stages of the vascular cambium in Cryptomeria fortunei Hooibrenk | |
| Zhang et al. | Mining of candidate genes for grape berry cracking using a genome-wide association study |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201012 Address after: 245600 Huayang Industrial Park, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province Patentee after: ANHUI QIMEN COUNTY QIHONG TEA Co.,Ltd. Address before: 230036 Hefei Changjiang Road, Anhui, No. 130 Patentee before: Anhui Agricultural University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |