CN107385104B - 用于筛选莲雾果实发育过程内参基因的引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于筛选莲雾果实发育过程内参基因的引物对及其应用，所述引物包括如下：ACT‑7正向引物5'‑CGTTTGGCTCACTCCATACA‑3'，反向引物5'‑AGGTCTTTGTTGGTGAGCTATT‑3'；α‑TUB正向引物5'‑TCCTTTAAGCCTATGTCGTAACC‑3'，反向引物5'‑R:TCCGCAGCTTTCTTCTTT‑3'。本发明利用qRT‑PCR检测技术，通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件进行基因稳定性评价，结果表明果肉和果皮发育过程表达最稳定的内参基因分别是ACT‑7和α‑TUB，这不仅解决了现有莲雾定量PCR检测中没有内参基因的现状，也为后续的基因表达工作奠定基础。

Description

用于筛选莲雾果实发育过程内参基因的引物对及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于筛选莲雾果实发育过程内参基因的引物对及其应用。

背景技术

莲雾〔Syzygium. samarangense (BI.) Merr.et Perry〕为桃金娘科（Mytaceae）蒲桃属（Syzygium）常绿乔木，是典型热带果树。莲雾果实营养丰富，具止泻、镇痛、抗菌、消炎（Tina等2011）等功效，且色泽艳丽，清脆爽口，受消费者喜爱，在我国适宜种植区发展迅速，是重要的热带特色果类。在生产上，莲雾果实品质不稳和冬季低温寒害是阻碍莲雾产业发展的两大突出问题，亟需解决。长期以来，一般都是采用优化栽培措施、改善栽培条件来提高莲雾果实品质及耐寒性，但品种的优质、抗寒遗传特性才是起决定作用的因素。因此，研究莲雾果实品质及对寒冻害的抗逆机制，解析其果实品质形成的整个代谢网络及响应低温的基因表达调控网络，有针对性地发掘相关基因加以利用，对莲雾分子育种具有重要意义。

基因表达与转录组分析是阐明植物复杂的代谢途径及逆境胁迫生理响应的重要手段。实时荧光定量PCR具灵敏度高、重复性好、特异性强和高通量等特点，被广泛应用于基因的表达及转录组分析等研究中。RNA质量、反转录效率、内参基因的选择等因素影响着qRT-PCR的准确性和可靠性。其中，选择稳定表达的内参基因是保证基因表达分析结果准确可靠的重要前提条件。理想的内参基因应在所有的细胞中或各种生理状态下均能稳定低表达，但大量研究表明传统的看家基因在不同组织类型或试验条件下稳定性不一，因此，根据不同试验材料及条件，筛选合适的内参基因或同时使用多个内参基因，才能保障目标基因表达定量的准确性及可靠性。目前尚未见关于莲雾内参基因筛选的报道，本发明选取7个常用的内参基因，利用qRT-PCR技术对其在不同试验条件下的表达稳定性进行评价，以期筛选出在果实发育过程稳定表达的内参基因，为后续的基因表达工作奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供用于筛选莲雾果实发育过程内参基因的引物对及其应用，本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：利用qRT-PCR技术对7个莲雾内参基因在果实发育过程中表达稳定性进行检测，通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder共4个软件进行基因稳定性评价，综合软件分析结果，筛选出在果实发育过程中稳定表达的内参基因。共获得稳定表达内参基因两个：ACT-7和α-TUB，它们的引物对如下所示：

ACT-7：正向引物5'- CGTTTGGCTCACTCCATACA -3'；

反向引物5'- AGGTCTTTGTTGGTGAGCTATT-3'；

α-TUB：正向引物5'- TCCTTTAAGCCTATGTCGTAACC-3'；

反向引物5'- R:TCCGCAGCTTTCTTCTTT-3'；

所述的内参基因引物对在莲雾果实发育过程实时荧光定量PCR时进行应用。

本发明的优点在于：

本发明提供了两个莲雾内参基因，同时揭露了利用这两个内参基因Unigene序列为基础设计的实时荧光定量PCR引物，不仅解决了现有莲雾定量PCR 检测中没有内参基因的现状；而且所设计的实时荧光定量PCR引物用于莲雾果实发育过程中基因表达分析时，能够提高莲雾基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测莲雾基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

图1 RNA检测电泳图，M：DL2000 DNA marker；1~5：紫红莲雾果肉T1~T5；6~10：紫红莲雾果皮T1~T5；11~14：紫红L1~L4；15~18：黑珍珠L1~L4；19~22：翡翠L1~L4。

图2 以紫红莲雾T5时期果肉cDNA为模板7个内参基因RT-PCR扩增结果，M：DL2000DNA marker；1：ACT-7；2：GAPDH；3：UBQ；4：α-TUB；5：CYP20-1；6：EF-2；7：APRT-5。

图3 莲雾7个内参基因qRT-PRC熔解曲线。

图4 7个内参基因Ct值的箱形图。

图5 莲雾7个内参基因的成对比较分析。

图6 果实发育不同时期莲雾F3H的表达水平。

具体实施方式

实施例1

1 材料及处理

供试莲雾〔Syzygium. samarangense (BI.) Merr.et Perry〕果实来自于福建省漳州市东山县莲雾种植场，品种分别为‘紫红’（Tub Ting Jiang）、‘黑珍珠’（Black Pearl）和‘翡翠’（Feicui）。于2016年6~7月采盛花后10 d、20 d、30 d、40 d和50 d的莲雾果实，不同采样时期记为T1~T5。每株树4个方向各采果实5个，共20个果，单株为1处理，3次重复。清洁果实后，用刮皮刀分离果皮和果肉，分别迅速投入液氮中速冻，后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

所用‘紫红’、‘黑珍珠’和‘翡翠’莲雾幼苗来自厦门亚热带植物研究所。选择长势较一致的一年生莲雾扦插苗，置于GXA-0288光照培养箱（宁波江南仪器厂）内，湿度60%，无光照，试验设25℃、4℃、1℃和-2℃共4个温度处理，不同温度处理记为L1~L4。每个温度处理3 h，单株为1重复，3次重复。之后取嫩叶经液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

2 方法

2.1 总RNA的提取和cDNA第1链的合成

样品总RNA提取均使用百泰克（BioTeke）通用植物总RNA提取试剂盒，具体操作依照产品说明书进行。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，使用Nanodrop2000C分光光度计（Thermo）测定总RNA的浓度和纯度。cDNA第1链的合成使用PrimeScrip 1st StrandcDNA Synthesis Kit试剂盒（TaKaRa），具体操作按照产品说明书进行。

2.2 内参基因的选择和引物设计

本研究从前期构建的莲雾转录组数据库中取肌动蛋白基因（ACT-7）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）、多聚泛素酶基因（UBQ）、微管蛋白基因（α-TUB）、亲环蛋白基因（CYP20-1）、转录延伸因子基因（EF-2）和腺嘌呤磷酸核糖转化酶基因（APRT-5）7个表达量较为稳定的基因作为候选的内参基因（基因序列分别如SEQ ID NO.15-22所示）。另选取黄烷酮-3-羟化酶基因（F3H）进行验证研究。按照定量引物设计要求，利用Primer 3.0设计8对引物（表1），所有引物序列均由上海英骏公司合成。

表1 内参基因和F3H基因的引物序列

2.3 荧光定量PCR对目的基因的检测

使用7500 Reat Time PCR System（Applied Biosystems），以提取的果皮、果肉和叶片样品cDNA第1链为模板进行定量分析。PCR反应体系为：总体积为25 μＬ，25 ng cDNA，0.4 μmol•L^-1正/反向引物，0.15 mmol•L^-1 dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol•L^-1 MgCl₂的10×PCR缓冲液各2.5 μＬ，超纯水补足至25 μＬ。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；最后72℃延伸7 min，于4℃下保存。每个样品设3个重复，并设阴性对照。

2.4 数据分析

荧光定量PCR分析后，根据仪器自动得出的样品的Ct值计算2^-ΔCt，用geNorm和NormFinder软件（Sinara等2010）比较内参基因稳定值大小及适宜选定的内参基因的数量，直接使用样品的Ct值通过BestKeeper软件（Deng等2013）分析候选内参基因稳定性，并在最终采用RefFinder（Xie等2011）软件进行综合评定。

3实验结果

3.1 RNA和引物质量检测

各样品RNA的OD_260/280及OD_260/230均在1.97~2.20；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示28S和18S亚基条带清晰，其灰度比约为2.0，而5S亚基条带亮度低，无其他杂带，满足荧光定量PCR要求（图1）。

7对引物在紫红、黑珍珠和翡翠的5个果肉和果皮发育时期，4个低温胁迫处理中的熔解曲线均只有明显的单一峰，且电泳检测也只有单一条带（图2），说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品PCR扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量PCR结果准确可信（图3）。

3.2 内参基因Ct值分析

对这7个内参基因的Ct值分析发现，每个内参基因在莲雾不同组织及不同低温条件下的表达水平不同，各基因的Ct值从18.88至31.59不等。用Ct值高低反映内参基因的表达丰度，值越低表达丰度越高，反之表达丰度越低。总体而言，各基因在莲雾叶片中的表达丰度高于果实，如图4所示，各基因在莲雾叶片中的Ct值在18.88~29.87之间，而在果肉和果皮中的Ct值在25.44~31.53。此外，内参基因EF-2的表达丰度较其他基因高，α-TUB的表达丰度低于其他基因。7个内参基因的Ct值变化在0.96~4.52之间，其中α-TUB的Ct值在莲雾叶片中变化较大，在果肉和果皮中变化较小；CYP20-1与之相反。但7个内参基因在这3组处理样品中的表达变化均没有一定的规律。

3 内参基因的表达稳定性评价

3.1 geNorm软件分析

geNorm软件以平均变异度M值作为衡量内参基因稳定性的指标，M值越大，表明稳定度越低；反之，则越高。geNorm软件默认的取舍值为M=1.5。由表2可知，7个内参基因在不同处理组中，最稳定的内参基因是有差异的。在果肉发育过程的中，表达最稳定的内参基因为ACT-7；在果皮中α-TUB的稳定性表现最好；在低温胁迫下，CYP20-1是表达最稳定的内参基因。

表2 geNorm数据分析的稳定值（M）和排名

geNorm软件可以通过候选内参基因的配对差异值V_n/n+1来确定合适的内参基因数，其默认阈值为V＜1.5。如图5所示，在莲雾果肉不同发育时期V_4/5=0.13，表明最适内参基因数为4个，即ACT-7、α-TUB、GAPDH和UBQ；而莲雾果皮不同发育时期V_2/3=0.135，表明α-TUB和ACT-7为其最适内参基因；在低温胁迫条件下V_2/3=0.141，表明其最适内参基因数也是2个，为CYP20-1和ACT-7。

3.2 NormFinder软件分析

NormFinder软件通过计算候选内参基因的稳定值进行基因评价，稳定值与内参基因的稳定性成负相关。因此，如表3所示，ACT-7在莲雾果肉不同发育时期表达稳定，为最适的内参基因，而在果皮中则为α-TUB；在低温胁迫下CYP20-1为最稳定的内参基因，其次是ACT-7。

表3 NormFinder数据分析的稳定值和排名

3.3 对7个内参基因表达稳定性的综合评价

根据RefFinder软件综合评定，莲雾果实发育过程中，果肉不同发育时期候选内参基因稳定性由高到低为ACT-7＞GAPDH＞UBQ＞α-TUB＞CYP20-1＞APRT-5＞EF-2，结合geNorm软件分析结果，可选择ACT-7、GAPDH、UBQ和α-TUB等4个最适内参基因；果皮不同发育时期α-TUB＞UBQ＞ACT-7＞EF-2＞GAPDH＞CYP20-1＞APRT-5，由于geNorm推荐最适内参基因为2个，因此可使用α-TUB和UBQ为内参基因；低温胁迫下CYP20-1＞UBQ＞ACT-7＞APRT-5＞EF-2＞GAPDH＞α-TUB，可选择2个最适内参为CYP20-1和UBQ。

4 内参基因验证

为验证内参基因对qRT-PCR分析基因表达的影响，用内参基因α-TUB和UBQ对莲雾花色素生物合成途径的关键基因F3H的表达水平进行分析。如图6所示，以二者为内参基因，在莲雾果实发育过程中F3H基因在果皮中的表达规律基本一致，在‘紫红’中先降后升，在‘黑珍珠’中呈降-升-降变化。F3H在‘紫红’果皮中的表达量高于‘黑珍珠’，盛花后50d（T-T5）F3H的表达量最高，极显著高于其他时期。以上结果说明，在莲雾果皮发育过程中，可以采用α-TUB和UBQ作为内参基因进行分析。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院果树研究所

<120> 用于筛选莲雾果实发育过程内参基因的引物对及其应用

<130> 23

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtttggctc actccataca 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggtctttgt tggtgagcta tt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttacagct cccgtgttat 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcatgagttc catcgagaaa tg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcagtgcag cgtatttaga g 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgagatgtc ataccgaagt tgt 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcctttaagc ctatgtcgta acc 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tccgcagctt acttcttctt t 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctggcctct atgatcttat cc 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggcatcat gtactgcttt g 21

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tatgatgtcg tccgatcc 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcaatccat cctgcaatta 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctgttgtcc aggtaatc 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgagcgagaa gagaaatg 18

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acatccgagt cactcattaa tacc 24

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgcctgaact ctttccactt 20

<210> 17

<211> 2029

<212> DNA

<213> ACT-7

<400> 17

gtgagcatgg tgcgggttgg tgggcttcaa ggtcaaaccc caccgtccaa ttatggtttg 60

acagaaactc aaaccaacca aaccaaacca ttcattggaa ccgaaccgaa ccgtgatgaa 120

agaaatatat acattactag gatcgagatg attagctaag caatatatac accactaccc 180

gcctgtagca acggtgacag cggctcctag cccatttgct cagttgcgat tctccgtgta 240

atagcaagtg tagctgagaa ggcaaaaaga ggatgcaggg cacctgatct tcactcttaa 300

aaataccatt ataagctaaa gaatgctgaa cagatttgca gtataacaaa gaatgggaga 360

aggattctag atgcaaccag gaaattgcca ttacaatcat cctcgatagt ccgatatata 420

attcaagcag atctaaatat gtataagctc gtgttatgcg tatggtttta tcaagctcaa 480

gaataggcaa gactaaagaa agggacagac aagccaaccc agacacaaca ttacccaatc 540

atccgaaaat ccactgccat taagtcacaa gcaaaaactg cacgccggag aatcacaaag 600

acatatctag aagcacttcc ggtgaacaat cgatggccct gactcatcat actcggcctt 660

tgatatccac atctgttgga atgtgctgag ggaagctaat attgaacctc caatccaaac 720

actgtacttt ctctctgggg gagccaccac cttgattttc atgctgctgg gtgctagagc 780

agtgatctcc ttgctcatac gatctgcaat gccaggaaac atggtggagc caccactaag 840

cacaatgttc ccatataagt ctttccttat atcgacatcg cacttcatga ttgaattata 900

tgtggtctca tgtattccag gtgcttccat cccgacgagc gatggttgaa atagaacctc 960

ggcacatcgg aaacgctctg ctccaattgt tattacctgg ccatcgggta actcatagct 1020

tttctcaatt gatgaactac tcttagcagc ttcaatctcc tgctcataat caagagccac 1080

gtaggcaagc ttctctttta tgtcgcggac aatttcacgc tcagctgttg tggtgaatga 1140

gtaacctctc tctgtcaaaa tcttcatcaa agcatcggtt aagtcccttc cagcaaggtc 1200

aagccgaaga atggcatgtg ggagtgcata accttcataa atgggaactg tgtgactgac 1260

tccatcacca gaatccagca cgatacctgt agtacgacca ctggcataaa gggagagtac 1320

agcttgaatg gcaacataca tggcgggcac gttgaaagtt tcaaacatga tctgggtcat 1380

cttctcccta ttcgccttag gattgagggg tgcttcagtg aggagcacgg gatgttcttc 1440

aggagccacg cggagctcat tgtagaaagt gtgatgccaa attttttcca tatcatccca 1500

attgctaaca ataccatgtt ctataggata tttcagtgta aggatacccc ttttagattg 1560

cgcctcatcc cccacataag catccttctg ccccattcct accatgacgc cggtatgcct 1620

tggccgacct acaatgctgg ggaaaacagc ccttggtgca tcgtctccag caaaaccagc 1680

cttaaccatt ccagtcccat tatcaacaac aaggggctga atatcctctg tctccgccat 1740

actttggaaa agctcttctt cttttcttct ctaggaaacc tcctcgatct cccacttctt 1800

aagcaaaagt gagagagaat ggagacctgc tacaacctga gacccagaag cagaagaagc 1860

ggtgggaatg gaatgaggga gatgggattc atagaatttg tgcagagagt gggggcaaaa 1920

aaggtggggg gcagagagtg accagtgacc acgagttaca gttggcaatg cgggtgatca 1980

acgttgcctt ttttcctttc aaaaagaaga cgaataaaag catcagagg 2029

<210> 18

<211> 1303

<212> DNA

<213> GAPDH

<400> 18

caatgaagga ctggagaggt ggcagagctg cttcttttaa cattatccct agcagcacag 60

gcgctgccaa ggctgttggg aaagtgcttc ccgcactaaa tgggaagttg actggaatgg 120

ctttccgtgt gcctactgtt gatgtctcag tggttgacct tactgtgcga cttgagaagg 180

ctgcttctta tgacgagatc aaggaggcaa tcaaggagga atctgagggc aacctgaagg 240

gaattcttgg ttacactgat gatgatgttg tatcgactga ctttttaggt gacaacaggt 300

caagtatctt cgatgccaag gctggaattg ctctgagctc taactttgtg aagcttgtct 360

cttggtatga caatgaatgg ggttacagct cccgtgttat cgacttgatc tgccacatgg 420

cctccgttca gtgagcattt cttggaccag actcggatct cgtcagagga ttttcttctt 480

tccggccctc tttcatttct cgatggaact catgcatctt taaggtttag agagagagat 540

ttttggaata attcgagttc tttctactaa ttatggcaat gtgacacccg tcctatgaga 600

aacttatgtt cccgtccttt attctccaag caaaatatga atggagtaac tgtaccggtt 660

gtcattttga tgacgacacc tttgttgcat ctatttttgg ttgacaaact aatgcttgca 720

tgagcaaatg aaaccagtca ctgaaaagga gtgcatgctc agaatctcag aagccataaa 780

agaagaaatg atacaacttg aatgttcaaa tttgacagaa agaaacgcat tcgcaatttg 840

caccgtatgt aatggaacag ttgagacaga tgacttctac tgccgagctc gctgccttcc 900

aacttctatg ttcatgaagc atttgatttg attcagcttt tccaaaagac ttatctaaag 960

tcccttagaa aaaagtttag gcattggatg aatatatttt tttggaccac cttagggaaa 1020

tgccaaaatt ggcaaagctt tcaattaact attctttatt ttaagttttt ggtttgagat 1080

ttttagctct ttgatgtaga ttttaactga tttttctggt aagctgggtg aaataaatga 1140

tgaagccgcg caactgtaca tgttgtaact caaatgatga tcggatttgt atgctgctct 1200

gtttgggagt accaggggga aagaaaagta cagagaggaa aaatcccctt aaaattcaaa 1260

attttcgctt catcttccca taagaattcg aaaacctccc cag 1303

<210> 19

<211> 1640

<212> DNA

<213> UBQ

<400> 19

gcggcaagta gcctataaaa aaaaataccc acacgatatc acgctctaat atttcgcagc 60

tggttgcaaa agaaaactca aaccctaggt gctctccgtt cgacctctcg tggttcttct 120

ctcttcgcct caagatgcaa atctttgtga aaacccttac tggcaagaca atcaccctcg 180

aggtggaaag ctccgacaca atcgataatg tgaaagcaaa aatccaggac aaggaaggga 240

tccctccgga ccagcagagg cttatctttg ctggcaagca gctcgaggac ggccgaacct 300

tggccgatta caacattcag aaggagtcca ccctccactt ggtgctccgc ctcaggggag 360

gcatgcaaat ctttgtgaag accctcactg ggaagacaat taccctagaa gttgagagct 420

ctgacaccat tgacaatgtc aaggccaaga tccaagacaa ggagggtatc cccccggacc 480

aacaaaggct catctttgct ggcaaacagc ttgaggatgg gcgtactttg gctgattaca 540

acatccagaa ggaatcaacc ctgcacctgg ttcttcgcct taggggtggc atgcagatct 600

ttgtgaagac cctcaccggc aagaccatta ctcttgaggt tgagagttct gataccattg 660

acaatgtgaa ggccaaaatc caggacaaag aagggatccc cccagaccag cagcggttga 720

tctttgctgg caagcaactt gaggatggcc ggacactagc ggactacaac attcaaaagg 780

aatccaccct tcacttggtc ctccgtttga gaggaggaat gcaaatcttt gtcaagaccc 840

ttactgggaa aacaatcact ttggaagttg agagctccga caccatcgac aatgtcaaag 900

ccaagattca ggacaaggaa ggtattcctc cggaccaaca gcgattgatc tttgctggta 960

agcaattgga agatggacga actcttgcgg actataacat ccaaaaggag tcgacccttc 1020

atctggtgtt gaggctcagg ggaggaacta tgatcaaggt taagaccctt actgggaagg 1080

aaattgaaat agatattgag ccgaccgata ccatcgaccg tatcaaggaa agggtcgaag 1140

agaaagaagg aattccacct gtccagcaaa ggcttatata tgccggtaag cagcttgcag 1200

atgataaaac agctcgagac tacaacattg agggtggctc tgtcctccat cttgtgcttg 1260

cgctgagagg tggcagattt taattgaatc ttaccatacc ggggttgtgt tcactgttgg 1320

cacttcattg aactaaagaa gcttgcttaa tccttttgca gtgtggatag acttgagatg 1380

ttatgagcaa ctctatgaac atgataattg cctttttgct ctattcctgt tgttttttct 1440

taaatccgct tttgcatcag agcttggatc accaatattt gccttcttaa attatagcgc 1500

acaagcatgc tgattgccac tggttttgct caagcagtgc agcgtattta gagcgttgag 1560

tctgtgcatg gattcatctt aggattgtat cccgcaagat atatatgttc acaacttcgg 1620

tatgacatct cacaaacttt 1640

<210> 20

<211> 1905

<212> DNA

<213> α-TUB

<400> 20

gtttggggat aaaaagtttg gattcaacat ttagccaatg ataggccgaa tgctgaacct 60

ttgtggccca cgatcagttt tgacaatgtc tctgtctcac atgtggcaga gctacgggta 120

aacagcaaaa tcacgactcc tttaagccta tgtcgtaacc cctccaagtc cactattgca 180

aaagctactc aaatctcaaa agtgaaaata gtacccgaat gggagggatg cagaaagaag 240

aagtaagctg cggaatacta agatactgat ttgatagcaa ttcacaatga aaaaccatca 300

tgccacgaaa atacccacac acgcgcactc aattttgaca ggacaaacat aaaaccgatg 360

catattgaag caaacaagcc agtgaattca caaccatatc agtactcatc tccttcatca 420

ccttcatcgc cctcagcaga ctcggcaccg acttcttcgt agtccttctc cagggcagca 480

aggtcctcac gagcctcaga gaactctccc tcctccatac cctcaccgac ataccaatgc 540

acaaaagcac gcttggcata catgaggtca aatttgtggt cgatgcgaga gaacacctcg 600

gcaacactgg tggagttgga gatcatgcag acagccctct gcaccttggc aaggtcacct 660

cccggaacaa cagtaggtgg ttggtagtta ataccgcact tgaatccggt tgggcaccag 720

tcaacaaatt ggatggtgcg tttggtcttg atggtggcca cagctgcatt cacatccttt 780

ggaacgacat ctcctcggta catgagacag caagccatgt acttgccatg gcgaggatca 840

cacttggcca tcatagatga tggctcgaat gcactgttgg tgatctcagc caccgagagc 900

tgctcatgat atgctttctc agctgagata actggagcat acgaagaaag cataaagtgg 960

atcctggggt aagggaccag gttggtctgg aactcggtga catccacatt caaggctcca 1020

tcaaacctca gagaggcagt caaggatgag atgacctgag agaccaagcg gttcagatta 1080

gtgtatgtgg gacgctcaat atcgagggat cttcggcaga tgtcatagat ggcttcatta 1140

tcaagaagca cggcaacatc agtgtgctca aggagggagt gggtagaaag gacgctgttg 1200

tagggttcca caacagaggt agaaacctga ggagagggat aaacggtgaa actgagcttt 1260

gattttttgc catagtcaac tgagagtcgc tccaagagaa gtgatccgag accagaacca 1320

gtgccacctc caacagaatt aaagacaagg aagccctgga gaccagtgca gttgtctgca 1380

agcttgcgga ttctgtccaa gcagagatcc acgatctcct ttccaatcgt gtaatgacca 1440

cgggcgaagt tgttggcggc atcttctttg ccactgatga gctgctcagg gtggaagagc 1500

tggcggtaag cgccagtcct cacttcatcg ataacggtgg gctccagatc cacaaacaca 1560

gcacgaggga cgtgcttgcc agcaccggtc tcactgaaga aggtgttgaa agcatcatcg 1620

cctccgccaa ctgtcttgtc acccggcaac tggccatcag gctgaatgcc gtgctcgaga 1680

cagtagagct cccagcaggc gttgccgacc tgaatgccgg cctggccgat gtggatcgag 1740

atgcactccc tcatctccgc cggaggaagg gatcgagaga atgggcggcg ggaatcggag 1800

gacgaaggag gggatggggg ggggaagcac gggaggtcga aggcgtttat gaagacgcct 1860

tcttcggagg aaatctctct tctcgctctg ccggaaagat gaaac 1905

<210> 21

<211> 2148

<212> DNA

<213> CYP20-1

<400> 21

acattacggg gttttcttca attcgggatt ttatccgtga cagtaattcg tttgacggga 60

tcgtgaccca ttggaaacga ggtcaacaca aatcttaaag agcgccgaat ccacagcaac 120

agccgcaaca ttcagtttgc gaaaacagag gaacttttct caatttacaa atcaagtaat 180

ggtcacagaa ctatacaaaa ccactctcga tgtactggaa cattttaggt ttaccagaag 240

tcttttgttt tgtctttcat tttcagagag attgtttccc gttcgaatat tgctttcact 300

cgttgcaaat atcatgctgt cggcatcagt ttttacccgt tcattcggct ggaatttatt 360

aataaaatga aattccccaa aaatgactct tctcatttgg acaatggatt gaagattttt 420

aattaataca aaggagaaat acatcatttg ctttccagtt ttcagaaaaa aaaatttccg 480

ttttctagat ttcattcggc tatatttaat ctaacttcca attcagactc agagcagttc 540

tctctattcc tggcctctat gatcttatcc aagctctttc aagcatgccc caatatccaa 600

tgaacaagat tgcctcgcgt tttcttcacc atataaaaac ttcatactca tcaaagcagt 660

acatgatgcc tgagccctac attcatgtgc aatctggagc gaagtgctca tagagccaat 720

tctccgctgt ctgaaatgac gactgtactt ttgggttggc cgctctgtct cccttcagcc 780

tcaatcttgc ggacaacatc cattccagac agcacctttc caaacacaac atggtggcca 840

tccaacctac aagagattga aaggagttca aatccttgag ttagtttacg atcaacctaa 900

caactcaaaa gattaccaaa agaactcaga ttaactagat tatgacaata atccatgata 960

aagttgccta gatgttttta ggcatacgca cattttttcc ccacaaggac ttgagatgaa 1020

gctaacaata gcctcaaact cattcaaatc atggtaacat ctccaacagt aacagcaatg 1080

agctgaatgt cccacgaatt aggtgacaat gttgcttatc aaagaaatga gtaaaggaag 1140

atagtcgatt accaactagt tgtcacagtg gtaatgaaaa attgtgaccc attcgtgtct 1200

ggcccagcat ttgccatcga aaggcgccct gcatctgtat gcttcaattt gaagttttca 1260

tcagaaaatt tgttcccgta gatcgactct ccccctctcc cgtctccaag agtgaagtca 1320

gcaccgtgga tcataaagct aggaatgatc ctgtggaatc ggctcccttt gtaatgcagg 1380

ggcttcccac tctttccgat ccctttctcc cctgcaataa gactgataat aatctaggaa 1440

agacaccctg acatgtttag gcaggaagta acaatttagg gatacctctc tcttctctac 1500

acatgaatga ttctttctta ttattagttt gtagagaaat cattcagcaa aaagccgatt 1560

gctcttcctt caacttggtc atgagtgttc aggggtttaa aggaaattca aaaaggaagc 1620

agatgtcact tggctacccg tgcaaagagc tcggaagtta tcaactgttt tggggacggt 1680

tttgccaaag agacccatga caattcgacc cactggtttt cctccaatct caacatcgaa 1740

ataaaccttg tgagtcacct cttccaaatc gtctggctcc ttctttaccg caccaacttt 1800

gcgatgaaca agtttcggat cagacgaagc tccggcgtcg ctcaatcggt tctggatgag 1860

agcaagggtt ccgaacaaga ccaagatcca cgccatcgtg atcgtgaccc atctcgtcct 1920

cgtcgccatg gccatttcca gatttcgctc ccctcctcct cctcctccgc gctcgaattt 1980

cccgcctttt ccccgggaat tcgtcgaaac tcgcggcgaa ggagagcgcg ggcttcgtgg 2040

gtgttcgtgg gtcaaccctc tcgtctctgc gcttgacgat ggtcaacggt cggccatgag 2100

cgaagctcga gctcttcgat caggctttgc tttcctcttc cttttttc 2148

<210> 22

<211> 4502

<212> DNA

<213> EF-2

<400> 22

gcacccccca catcctcctt catggagaac aaaagaaaac ttattcataa taataaacct 60

ctagaagcat aaaaactctg gtgggagagt caacaattaa gttgcgatga tctggtacat 120

tatggcacca tgaactttaa tcagctccaa caaacaaaac cacctatgag aaaataaaaa 180

ttgcacctct caagagacca ggacaatgtt caaaaaactc aacatgacga cgacaagcag 240

aacaattaaa ctgaaaagtt tgtgactact actacacaag ggacagcatc cagggaaagg 300

agaactagtg tgctgagcca tgaatatcac atcctcaatc catcctgcaa ttacagcttg 360

tcctcgaact cagacagcgg ggtcatctgc tccttcaagc ccttcctctt gcggatatca 420

gcaacaagct gagatgcctg agacccagac tccagaggat cggacgacat catatcccag 480

tggtcgaaga cacactgagg gaacgcctgc ccagaggttg cagctctcaa tgtactggag 540

aaaccgaagg actcgataac aggaaggtag gccttgatgt tgtagagagg ggttccaggc 600

ctctgcatct cctcaaacac atgcccacgc ttctggttaa ggacactgta aatacctcca 660

agggcctgct ccggagcttg gatctcgaca aggtagacag gctcaagaag cctgggcttg 720

gctgtcaact gcgaagcata gataaccctc ctagcagtcg gaatgacctg gccaccacct 780

ctgtgaatgg cgtcggcatg cagaaccaca tcacagacct caaagcaaat accacgcata 840

ttctcctcag ccaaagcacc ttcttttgat gcccactgga aaccagcaac aacagaatcc 900

ttgatttcat tgaggtactg aacaccctta cacatatcaa caaccatgtt aggtccagta 960

gtctcaggac cgaagcacca aatcttcttc gcaagatcct tatcccagcc aaactcttca 1020

gacaagatct ttgagcgagc cttgggatca tccctgggac caatacggcc atcatcaatg 1080

gcctcagcaa gcccctcctc caaaggtcga gcctccatgt acaacctgtt gtgcttattg 1140

ggtgatttgc tcatgacagt acggcacgat ttctccaaca cagtttcacg gaaagacaca 1200

actggatctg acttcacaat ctcagctccg cccatgaagt catcctgcaa atccttaagg 1260

caaatttcca aatgaagttc tccagcacca gcaatgatgt gttcgccaga ttcctcaatg 1320

ctacatacca ccatagggtc tgacttggcc agacgtttaa gtccttcaac gagcttggga 1380

aggtcagaag ccaccttgca ctgaacagca acacgcacaa ctggagagac ggagaatttc 1440

atggcacgga ttgggtgggc atcgacttct ttctcatttg tcaaagttgc attcttcgtg 1500

atatactgat caagaccaac cagagccaca gtgttaccac acggcacatc ctcaacagtc 1560

tcctgcctct ttcccatcca aataacagtt ctctggacac tcttcacata taaatccttc 1620

ttctcacctg ggacgtagtt gggacccatg atcctgacct tcagaccagt agagaccttg 1680

ccagcgaaaa cacgaccaaa agcaaagaat ctacccttat cagaagcagg aatcatcttg 1740

gagacataga gcatgagagg tccctcagga tcacagttcc taatggcagt ggcatattga 1800

tcgtcaaggg ggccctcata caagttctca acacgatact tctgagcctt agctggagat 1860

ggaaggtgga atatcatcat ttccaacaaa gcagtacttg ccggaagcca agtctgcatc 1920

acacgcttca tcaatgcctt acccatcaag tccttctcct cagacttcat ggtgacccca 1980

agcttctgta gcatgggcca cagcttatct ttctggtcat tcatgcatgt attgatgatc 2040

tgcttgattg gctcatagca gaactggaca aaaccacgct tacatgttgc agaaccggtg 2100

ttcttgcttg tccatttctt ggtggcagga tcgaagaaat tctcacccca caaacgttcc 2160

atcatcttcg actcgtcaac accaaacttg gatgcataca tcttggcgaa attggtgaga 2220

gtaaaggccc aaccatgcag accagcagaa aaagcaacag ttcctttctc tgggtacacc 2280

tggacatcac cgagaagggg atcctcatat gtggccatga tgacattagc attctcaata 2340

actctttgga atgtttgata tgcctcctca ccatcaacct gcagctcgag gaagcatctg 2400

tccatcttgt tgacagtcaa gacaggcctg atcctctcac ccaaagcctg acgaagaaca 2460

gtttctgtct ggacacagac accctcaaca cagtccacaa ccactaacgc accatcagta 2520

atacggaggg cagctgtaac ctcagaagag aagtccacgt gcccaggtga gtcgatcaag 2580

ttgatcagat actcattgcc atttctctct cccttgtagg tctttaagga ttcgtcagac 2640

atttcatagt atagagaaat tccagtagac ttgatcgtga taccacgctc tgcctcatct 2700

gcacgagtat ctgtcatacg aacgtctcca gcaacttcct gagcaataat accagcagca 2760

gccacaaggg aatcggtgag ggtggatttc ccgtgatcaa catgggcgat gacagacata 2820

ttccgaatgt tgtgcttgta gtccatgatt cttcggagct catcagccgt gaacttcacc 2880

atcttgtcgg gttcttaaaa ggcactcctc cacaaaatta gaagaaatct gaggcgagga 2940

gaggcgagag gagaggagag gagagagaga gcgggaacac cacgccgagt gtcgttccgc 3000

tccttttgct ctccgaccaa ggcccgagct tcttagggtt gtgcgctcgc tcctcgcctt 3060

ggccttcgcc ttcgagatct gcgcggtttc tgctctccgg agggaggttt tgctcgatga 3120

gtttgactga tacagaaatg gctcctccta ttgaaacccc acagaaagtt tatcaaaacg 3180

atcatccatc ccatccacct cttaatgaaa ggattctctc atcaatgact aggaggtctg 3240

ttgctgcgca cccttggcat gaccttgaga taggacctgg agctcctaca gtcttcaact 3300

gtgtgattga aattagtaaa gggagcaagg tcaagtatga acttgacaag aaaactggac 3360

tgatcaaggt cgaccgtgtg ctgtattctt cagttgtgta cccccacaac tatggtttca 3420

tccctcgaac tctctgcgag gataatgacc ctatggatgt cttgatcatc atgcaggaac 3480

ctgttcttcc tggatgcttt cttagggcta aagctattgg gctcatgcct atgattgatc 3540

agggcgagaa agatgacaag ataattgctg tttgcgctga tgatcctgaa taccgtcatt 3600

acaatgatat taaggagctc ccaccccatc gtttggctga aattcgtcgt ttctttgaag 3660

attacaagaa aaatgagaac aaggaagttg cagttaatga tttcctgcct gcctctgctg 3720

cctttgatgc aattcagcac tccatgaacc tgtacgcaga ctacattgtg gagagcttga 3780

ggagatagat agcccattcc agcattggtg atgctgatct cccgaagtga cttgaataca 3840

cagataacga cgatatatac agtatctata tttactacag gaaagtgggt attttgctac 3900

atgtacgagc attgtttcat ggttctgttt atattatgat ggtggattgg cttttatatc 3960

cttttccttc ttaaaaggaa agcaaacggc ttggcttctg tattcttttt tctaatttta 4020

tggaactagt atctcaacct agtcctcttg atgttttggt gtcgcaacct aaaaaaaata 4080

tcatcgagat tcgatctcag gctaatggat tactagatta aataaattaa ctaatctagc 4140

tcgagttctc tcaaactcta ccaaatctca acttaggtcc aattgtgagc atgtaaatat 4200

tttcaatggg agtcgctact aatcatttaa ggtaaattga ttagaaacct aaataaaagg 4260

cagaaggaca ctattggtgc cataacttgt gtacggcgat cactttggtg ccataacttt 4320

ttttcggatc actttggtgc taaaatctga aaaaatagat cactttagtg actccggcca 4380

aaattcctgc caaaaagctg acttggcatt tattttttta aaaaaataat ttaaattata 4440

cacgtggaaa ttatgtgact tttttttgaa tttttgaatt ttttttttct ttttttttct 4500

tt 4502

<210> 23

<211> 1146

<212> DNA

<213> APRT-5

<400> 23

ggcgaggttt gaggggacgc ctttgccagt gctgacaccc ctctctctgt ctctcttctc 60

aggccagtgc tgacgcacgc acactttctc tctctatctc ttcccccctc tctctctcca 120

tccgctcgca cagagagagt gaaacagaga gcgaaggaga agaagacgat gctggcggca 180

gaggatggaa gagacccgag attgaaggcc atctcagaca ccataagggt cgttcctcac 240

ttcccaaaac caggcataat gttccacgac ataaccaccc tgttgctcga tcacaaggcc 300

ttcaaagaca cggttgacct gtttgtggag cggtatagag acatgggcat ctccattgtt 360

gctggcattg aagccagggg attcatattt gggccatcta ttgctttggg tattggtgcc 420

aaatttgtcc ctctccggaa accagggaag ctgccaggaa gagtcatatc tgaatcgtat 480

gaactcgaat atggcactga tcaactcgag atgcatgtcg gagctgttca gccaggggaa 540

cgtactataa tcatagacga tttggtagcc actggcggga ccctttccgc tgcaataaga 600

cttctggaac gttttcaggc tgaagtggtt gagtgcgctt gtgtcattgg ttcgcctgtt 660

gtccaggtaa tcctcaaata aagcagtttg gtaatatctt atccatgtgt tcaattttgc 720

gactcattga tggattttgc tgctcacatt gtccagtttt catgcatgca tttctcttct 780

cgctcatctt tttctatcta ctgtagaaat ggaattgtat gatcattcgt gttgactttc 840

taaccatgca tatcttccct aactgaacgt tgaagtgcac aactttttct caatagcagg 900

cttttattgt cgtaccagtg tcgtttcaag tatatattgt gttattttgt ataagatcaa 960

gttataactg ctgatcagct ctgctgtgca gaagtttcgt tcatgaggtt tatggggtcc 1020

tctgttggtt aatggtgtct gctctctctg ttgacttgaa aaatgctttt aagctcagct 1080

gtaacggata aagtagtcac aaacaagcgg tagcttgagt ttgttcgact gatcagataa 1140

actact 1146

Claims (1)

1.用于扩增肌动蛋白基因和微管蛋白基因的引物对在莲雾果肉和果皮发育过程中进行相关基因实时荧光定量PCR检测时的应用，所述引物对如下所示：

ACT-7：正向引物5'- CGTTTGGCTCACTCCATACA -3'；

反向引物5'- AGGTCTTTGTTGGTGAGCTATT-3'；

α-TUB：正向引物5'- TCCTTTAAGCCTATGTCGTAACC-3'；

反向引物5'- R:TCCGCAGCTTTCTTCTTT-3'；

所述肌动蛋白基因和微管蛋白基因为内参基因。

Images