CN105441396A - 茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白及其编码基因，所述基因的cDNA具有SEQ？ID？NO.1中所示的核苷酸序列。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2中所示。该基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，花中的表达量显著高于其他组织。本发明为今后利用基因工程技术改良植物品质提供理论依据，具有很大的应用价值。

Description

茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及茄子光信号通路中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种茄子组成型光形态建成SmCOP1(ConstitutivePhotomorphogenic1)蛋白及其基因和应用。

背景技术

COP1在植物中是一种E3泛素连接酶。研究发现，COP1调控了许多光信号通路转录因子的泛素化降解过程，比如，HY5、LZF1、HFR1和CO等。COP1通过降解HY5、LZF1和HFR1来调控拟南芥幼苗下胚轴的伸长和花色素苷的积累，通过调控CO的蛋白稳定性来调控拟南芥的光周期开花。

COP1调控了许多光信号通路的转录因子，那么光又是如何调控COP1的呢？研究发现，COP1的亚细胞定位受到光的调控：COP1既可以定位于细胞质又可以定位于细胞核，黑暗条件下，COP1蛋白主要定位在细胞核，照光后，COP1从细胞核转移至细胞质。COP1的这种依赖于光的亚细胞定位对其功能的实现意义重大，因为COP1作为E3泛素连接酶，其底物转录因子大多都是在细胞核发挥功能的，所以黑暗下，COP1主要定位于细胞核，它的底物大部分被其泛素化并随后被26S蛋白酶体降解掉，照光后，COP1主要定位于细胞质，它下游的底物才可以获得积累并发挥转录功能，调控各种光形态建成生理表型。

目前已从很多植物中克隆得到COP1基因，如拟南芥、水稻、苹果、油菜等。茄子是重要的蔬菜作物，但相关研究相对比较滞后。目前，未有任何与茄子COP1基因及其编码蛋白的相关文献报道。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于填补茄子COP1基因的空白。本发明提供了一种茄子COP1的cDNA以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子SmCOP1基因在不同组织器官的表达模式。本发明还提供了SmCOP1转入拟南芥后表型发生改变的结果。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白，包括SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供一种编码茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因的核酸序列，所述基因的cDNA序列包括：

(a)如SEQIDNO.1所示第1～2028位所示的碱基序列；或

(b)与SEQIDNO.1所示第1～2028位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列；或

(c)能与SEQIDNO.1所示第1～2028位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。

优选地，所述cDNA序列包括SEQIDNO.1第1～2028位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸。

第三方面，本发明提供一种用于扩增所述茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。

第四方面，本发明提供一种用于编码茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因荧光定量PCR分析的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。

第五方面，本发明提供了一种茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因在基因工程调控植物生长状况和花青素合成的应用。

优选地，所述植物包括拟南芥。

在本发明中，术语“SmCOP1基因编码序列”指SEQIDNO.1所示的第1～2028位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.1所示的第1～2028位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.1所示的第1～2028位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmCOP1相同功能的蛋白的SEQIDNO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmCOP1基因产物的表达模式，即分析茄子SmCOP1基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，根据本发明的茄子SmCOP1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmCOP1相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与茄子SmCOP1相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对茄子SmCOP1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,PaloAlto,Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmCOP1相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的茄子SmCOP1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

光信号能调控许多次生代谢途径，例如花青素的合成。茄子是广泛种植的蔬菜作物，紫色茄子的果皮含有丰富的花青素。近年来的研究结果表明，紫色茄子的抗氧化保健作用在常见蔬菜作物中是最好的。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、将SmCOP1基因在拟南芥突变株cop1-4中表达，茄子COP1基因具有与拟南芥COP1基因相似的功能。

2、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，克隆光信号通路中的关键基因SmCOP1基因，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的茄子COP1蛋白与番茄COP1蛋白的氨基酸序列同源比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；

图2为本发明的茄子COP1基因在不同组织的表达情况；

图3为转SmCOP1基因植株的RT-PCR检测；

图4为转SmCOP1基因对拟南芥突变株cop1-4的表型恢复情况；

图5为转SmCOP1基因对拟南芥突变株cop1-4的花青素合成的调控情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、茄子SmCOP1基因的克隆

1.植物材料的获得

本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子的叶片用于提取RNA。

2.RNA的提取

采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(ThermoScientificNANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。

3.基因的全长克隆

基于Genbank中COP1基因的保守序列设计一对简并引物。将提取RNA进行反转录(PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物

F1(SEQIDNO.3)：5′-ATGGTRGARAGTTCARTKGGAGGG-3′

R1(SEQIDNO.4)：5′-TCAMGCWGCAAGKACYARCACTTTTATAG-3′

进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，得cDNA序列SEQIDNO.1。

实施例2、茄子COP1基因的序列信息与同源性分析

本发明新的茄子COP1基因全长CDS开放读框序列为2028bp，详细序列见SEQIDNO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子COP1的氨基酸序列，共675个氨基酸残基，分子量为76257.1道尔顿，理论等电点(pI)为6.87，详细序列见SEQIDNO.2所示序列。

将茄子COP1的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与番茄COP1基因(NM_001247118.1)在核苷酸水平上具有94.30％一致性；在氨基酸水平上，它们两者之间相似性高达95.72％，如图1所示(Query：茄子COP1的氨基酸序列；Sbjct：番茄COP1的氨基酸序列)。由此可见，茄子COP1基因与番茄COP1基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、茄子COP1基因在不同组织中的表达

1.植物材料的获得

在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

2.RNA的提取

采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

3.cDNA的获得

以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRaPrimeScript^TMRTreagentKitPerfectRealTime试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。

4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子COP1基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-timePCR中SmCOP1基因定量分析的特异性引物，

COP1-F(SEQIDNO.5)：5′-AGTTTGGTGCACGAAGCAGGAAG-3′

COP1-R(SEQIDNO.6)：5′-TGTGAACGGGCTGGCTTGTGT-3′

内参基因为Actin(GU984779.1)，其引物为

ACTIN-F(SEQIDNO.7)：5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′

ACTIN-R(SEQIDNO.8)：5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′

5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASYDilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-timePCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-timePCR反应在FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

7.采用2^-△△Ct法作相对定量分析。结果表明SmCOP1基因在茄子的根、茎、叶、花、果皮、果肉中都有表达，其中在花中的表达量最高，其次是叶，而在果肉中的表达量较低，说明SmCOP1基因的表达具有明显的空间差异性(图2)。

实施例4、茄子COP1基因转拟南芥的功能验证

所用转化载体为pCAMBIA1302(Cambia)，拟南芥材料为COP1突变株cop1-4(Luetal.,2015.Red-light-dependentinteractionofphyBwithSPA1promotesCOP1–SPA1dissociationandphotomorphogenicdevelopmentinArabidopsis.MolecularPlant.8:467–478.)。将含有SmCOP1-1302的农杆菌培养至OD0.8～2.0，6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用MS液重悬，调整OD₆₀₀为0.8～1.2，侵染拟南芥花序10～60sec，暗培养12h后正常培养，收集成熟的种子。

收集的T₀代转基因种子，铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，4℃春化3d，光照培养箱培养6-10d，选取根长的长，且长出真叶的健壮幼苗，移栽至土盆，培养。收集的T₁代种子继续铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，选取抗性：不抗比为3:1的株系收集T₂代种子。T₂代在50mg/L潮霉素抗性平板上存活率为100％的认为筛选到纯和抗性植株。对获得的株系采用Real-timePCR检测SmCOP1的表达量(图3)。所用拟南芥actin(NM_179953)引物如下：

SEQIDNO.9：5′-GTCTGGATTGGAGGGTC-3′

SEQIDNO.10：5′-TGAGAAATGGTCGGAAA-3′

将筛选得到的阳性转化株同突变株，野生型一同置于黑暗/光下培养。结果显示，cop1-4在黑暗下的子叶是打开的，说明缺乏COP1基因的植株在黑暗下也能完成光形态建成，而转基因植株SmCOP1/cop1-4同野生型一样子叶闭合，在黑暗下不能完成光形态建成(图4)。在光下，cop1-4有明显的花青素合成现象，而转基因植株SmCOP1/cop1-4同野生型一样无此现象(图5)。这说明茄子COP1基因具有与拟南芥COP1基因相似的功能。

本发明所涉及的序列如下：

SEQIDNO.1(SmCOP1基因cDNA序列)：

ATGGTGGAAAGTTCAGTTGGAGGGGTGGTGCCAGCAGTGAAAGGGGAGGTGAGGAGGAGGATGGGGGACAAGGAGGAGGGGAGTAGTGTAAGGGATGAAGAAGCTGGGACAACAGCAGAATGGGAAATGGACAGGGAATTGTTGTGTCCTATATGTATGCAGATCATAAAGGATGCATTTTTAACTGCTTGTGGGCATAGCTTTTGCTACATGTGCATAGTTACTCACCTTCATAACAAGAGTGATTGCCCTTGTTGTTCTCATTATCTCACTACCAGCCAACTCTATCCCAATTTCCTTCTTGACAAGCTATTGAAGAAGACATCTGCTCGTCAGATTTCAAAAACTGCATCTCCTGTTGAACAATTTCGTCATTCATTGGAACAGGGTTGTGAAGTGTCAATAAAGGAGCTGGACACTCTATTGTCGATGTTGTCAGAGAAAAAGAGGAAATTGGAGCAGGAAGAAGCAGAGCGAAATATGCAAATTCTGCTAGACTTCTTACAGATGTTAAGGAAGCAAAAAGTTGATGAACTCAATGAGGTGCAACAAGATCTGCAGTACATCAAAGCGGACTTAAATTCAGTAGAGAGACATAGAATAGACCTATACCGGGCTAGGGACCGGTACTCAATGAAGCTTCGGATGGTTGCAGATGATCCTATTGGGAAAAAACCTTGGTCTTCGTCCACTGATAGGAACTTTGGCGGTCTTTTCTCCACTTCACGAAATGCTCCTGGAGGATTACCAACTGGAAACTTGACATACAAAAAGGTGGACAGCAGAGCTCAAATAAGCTCTCCTGGACCACAGAGAAAAGATACTTCAATCAGTGAAATGAATTCACAACATATGAGTCAATCAGGTCTGGCTGTGGTTAGGAAGAAGCGCGTCAATGCACAGTTCAATGATCTCCAAGAATGTTACTTGCAAAAGAGACGTCAATTGGCAAACAAATCGCGTGTCAAGGAGGAAAGGGACACAGATGTTGTGCAAAGAGAAGGTTACAGTGCTGGACTAGCAGATTTTCAGTCTGTACTTAGCACTTTCACTCGTTATAGTCGGTTAAGAGTCATTGCTGAGCTTCGGCATGGGGATCTGTTTCACTCGGCCAATATAGTGTCAAGCATTGAATTTGATCGTGATGATGAGTTGTTTGCTACTGCTGGAGTTTCACGGCGTATAAAAGTTTTTGACTTCTCTTCGGTTGTAAATGAACCTACCGATGTACACTGCCCTGTTGTTGAAATGTCTACCCGGTCTAAGCTGAGTTGCTTGAGCTGGAATAAGTATACCAAGAACCACATAGCCAGTAGTGATTATGATGGAATAGTAACTGTATGGGATGTGAACACCAGACAGAGTGTGATGGAATACGAAGAGCATGAGAAACGGGCATGGAGTGTTGATTTTTCACGCACTGAACCCTCGATGCTTGTATCTGGTAGTGATGATTGTAAGGTCAAAGTTTGGTGCACGAAGCAGGAAGCAAGTGTTCTGAATATTGACATGAAGGCAAATGTATGCTGCGTAAAATATAATCCTGGATCTAGTGCTCATATAGCGGTTGGCTCTGCGGATCATCATATTCATTATTATGACTTAAGGAACACAAGCCAGCCCGTTCACATTTTTAGTGGCCACAGAAAAGCTGTTTCATATGTGAAATTTTTGTCCAACAATGAACTTGCTTCAGCATCGACAGACAGTACACTACGATTGTGGGATGTAAAGGAAAATTTGCCGGTCCGCACGCTTAGAGGACATACGAATGAGAAAAACTTTGTTGGTCTCTCAGTGAACAATGAATTCCTCTCATGTGGCAGTGAAACGAATGAAGTATTCGTGTATCATAAGGCGATCTCGAAACCCGTTACTTGGCATACATTCGGTTCCCCAGACGTGGATGAAGCTGATGAAGACGCAGGATCTTATTTCATCAGCGCGGTGTGCTGGAAGAGCGATAGCCCCACGATGTTAGCTGCTAATAGTCAAGGAACTATAAAAGTGCTAGTCCTTGCAGCTTGA

SEQIDNO.2(SmCOP1基因氨基酸序列)：

MVESSVGGVVPAVKGEVRRRMGDKEEGSSVRDEEAGTTAEWEMDRELLCPICMQIIKDAFLTACGHSFCYMCIVTHLHNKSDCPCCSHYLTTSQLYPNFLLDKLLKKTSARQISKTASPVEQFRHSLEQGCEVSIKELDTLLSMLSEKKRKLEQEEAERNMQILLDFLQMLRKQKVDELNEVQQDLQYIKADLNSVERHRIDLYRARDRYSMKLRMVADDPIGKKPWSSSTDRNFGGLFSTSRNAPGGLPTGNLTYKKVDSRAQISSPGPQRKDTSISEMNSQHMSQSGLAVVRKKRVNAQFNDLQECYLQKRRQLANKSRVKEERDTDVVQREGYSAGLADFQSVLSTFTRYSRLRVIAELRHGDLFHSANIVSSIEFDRDDELFATAGVSRRIKVFDFSSVVNEPTDVHCPVVEMSTRSKLSCLSWNKYTKNHIASSDYDGIVTVWDVNTRQSVMEYEEHEKRAWSVDFSRTEPSMLVSGSDDCKVKVWCTKQEASVLNIDMKANVCCVKYNPGSSAHIAVGSADHHIHYYDLRNTSQPVHIFSGHRKAVSYVKFLSNNELASASTDSTLRLWDVKENLPVRTLRGHTNEKNFVGLSVNNEFLSCGSETNEVFVYHKAISKPVTWHTFGSPDVDEADEDAGSYFISAVCWKSDSPTMLAANSQGTIKVLVLAA

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因的核酸序列，其特征在于，所述基因的核酸序列包括：

(a)如SEQIDNO.1所示第1～2028位所示的碱基序列；或

(b)与SEQIDNO.1所示第1～2028位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列；或

(c)能与SEQIDNO.1所示第1～2028位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。

3.如权利要求2所述编码茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因的核酸序列，其特征在于，包括SEQIDNO.1第1～2028位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸。

4.一种用于扩增权利要求2所述编码茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。

5.一种用于权利要求2所述编码茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因的荧光定量PCR分析的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。

6.一种如权利要求2所述茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因在基因工程调控植物生长状况和花青素合成的应用。

7.根据权利要求6所述茄子组成型光形态建成SmCOP1蛋白的基因的用途，其特征在于，所述植物包括拟南芥。