KR101668917B1

KR101668917B1 - 앱시스산 수용체 CaRCAR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법

Info

Publication number: KR101668917B1
Application number: KR1020140118705A
Authority: KR
Inventors: 이성철; 임채우
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2016-10-25
Also published as: KR20160029919A

Abstract

본 발명은 식물체의 건조 스트레스 저항성 관련 고추유래의 앱시스산 수용체 유전자 CaRCAR1에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CaRCAR1 단백질의 발현을 조절하여 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 CaRCAR1이 과발현된 형질전환 식물체(CaRCAR1-OX)에서, 앱시스산에 대한 민감도 증가효과 및 건조 스트레스에 대한 저항성 증가효과를 확인하였는바, 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

앱시스산 수용체 CaRCAR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 {Method for improving the resistance to the drought stress using ABA receptor, CaRCAR1, in plants}

본 발명은 고추유래의 앱시스산 수용체 유전자 CaRCAR1 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 CaRCAR1의 발현을 조절하여 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

건조(drought) 상태와 같은 환경 스트레스들은 직접적으로 곡물의 성장 및 생산에 해로운 효과들을 야기한다. 특히, 오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 크게 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.

한편, 식물은 가뭄, 염, 추위, 더위, 병충해 등의 다양한 환경적 스트레스에 자주 노출되기 때문에 스트레스의 해로운 효과에 대처하는 생리학적, 생화학적, 분자적 방어 기작을 발전시켜왔으며, 특히 앱시스산(abscisic acid: ABA) 신호 변환 조절은 식물이 상기 스트레스를 극복할 수 있도록 한다. 보고된 바에 의하면, 앱시스산을 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 앱시스산을 생성하지 못하거나, 앱시스산에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

이에, 식물체의 건조 저항성 증진방법이 주요한 과제의 대상이 되고 있으며, 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질을 이용하는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허 공개번호 10-2010-0040789), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은, ABA 또는 건조 스트레스에 의한 CaRCAR1 유전자 발현 감소효과, CaRCAR1이 과발현된 형질전환 식물체(CaRCAR1-OX)의 앱시스산 민감도 증진효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 CaRCAR1을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 CaRCAR1에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CaRCAR1 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물체에서 CaRCAR1 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질 전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 CaRCAR1을 제공한다.

본 발명은 상기 유전자 CaRCAR1에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공한다.

본 발명은 CaRCAR1 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물체에서 CaRCAR1 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질 전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 후보 물질을 처리한 후, CaRCAR1 단백질의 발현 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 식물체의 건조 스트레스 저항성 관련 고추유래의 유전자 CaRCAR1에 관한 것으로서, 상기 CaRCAR1이 과발현된 형질전환 식물체(CaRCAR1-OX)의 앱시스산 민감도 증진효과를 확인하였는바, CaRCAR1 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 고추 CaRCAR1과 SlPYL8, MtPYL9, PsATF, AhPIP, MdPYL9, AtRCAR3간의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 2는 고추 CaRCAR1과 SlPYL8, MtPYL9, PsATF, AhPIP, MdPYL9, AtRCAR3간의 phylogenetic tree analysis 결과이다.
도 3은 (A) ABA 또는 (B) 건조 스트레스 조건에서, CaRCAR1 발현량의 변화를 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 고추 CaRCAR1의 세포내 발현 및 작용 위치를 확인하기 위하여 CaRCAR1-GFP 발현을 확인한 결과이다.
도 5는 ABA 스트레스 조건에서, CaRCAR1이 과발현된 형질전환 애기장대 식물체(CaRCAR1-OX #4, #9) 및 야생형인 대조군(WT)간 (A) 발아율, (B) 녹색 자엽의 비율을 육안으로 관찰한 결과, (C) 녹색 자엽의 비율을 수치화한 결과, (D) 뿌리길이를 수치화한 결과, 및 (E) 뿌리길이를 육안으로 관찰한 결과이다.

본 발명자들은, 건조 또는 ABA 스트레스 조건에서 CaRCAR1 발현 감소 및 CaRCAR1이 과발현된 형질전환 애기장대에서 앱시스산 민감도 증진효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 유전자 CaRCAR1 또는 유전자 CaRCAR1에 의해 코딩되는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 유전자인 CaRCAR1은 Differential hybridization analysis를 통하여 고추로부터 분리하였으며, 본 발명의 CaRCAR1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaRCAR1 유전자에 의해 코딩되는 펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 상기 CaRCAR1 유전자의 비-생물적 스트레스에 대한 새로운 기능을 밝히기 위해 연구하던 중, CaRCAR1 유전자가 앱시스산(abscisic acid: ABA), 건조(탈수) 스트레스에 노출된 고추 잎에서 발현이 억제된다는 사실을 밝혀냈으며(실시예 2 참조), 앱시스산의 민감도가 증가할 수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스 산 또는 건조 스트레스와 CaRCAR1 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.

이에, 본 발명의 일실시예에서는 CaRCAR1 단백질과 다른 ABA receptor 단백질간 아미노산 서열의 상동성(실시예 1 참조)을 확인하였다. 또한, CaRCAR1이 과발현된 형질전환 애기장대를 제조하여(실시예 3 참조), 앱시스산 민감도 증진효과(실시예 4 참조)를 확인함으로써 CaRCAR1의 발현을 조절함으로써, 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시킬 수 있음을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명은 CaRCAR1 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물체에서 CaRCAR1 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 CaRCAR1 단백질이 과발현되어 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CaRCAR1 서열 상동성 분석

본 발명자들은 고추 CaRCAR1 아미노산 서열이 타종의 ABA receptor 단백질과 어느 정도 유사성을 나타내는지 알아보기 위하여, Multiple alignment analysis 및 phylogenetic tree analysis를 실시하였다. 고추 CaRCAR1의 아미노산 서열과 SlPYL8, MtPYL9, PsATF, AhPIP, MdPYL9, AtRCAR3간의 아미노산 서열의 상동성을 비교하였다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 고추 CaRCAR1 아미노산 서열은 타종의 PYL 및 RCAR과 같은 ABA receptor 단백질과 높은 상동성을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 2. ABA 및 건조 스트레스에 의한 CaRCAR1 유전자의 유도

ABA 또는 건조(drought) 스트레스에 의해 촉진되는지 알아보기 위해, qRT-PCR을 통하여 상기 조건하에서, CaRCAR1 유전자 발현양상을 확인하였다.

ABA (100μM), drought(탈수)을 각각 처리한 후, 샘플링한 고추 잎으로 부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 샘플은 genomic DNA를 제거하기 위하여 RNA-free DNase 처리를 하였으며, -20℃에서 보관되었다. reverse transcription PCR을 위하여, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit (Roche)를 이용하였다. 이와 동시에 역전사효소없이 PCR을 수행하고, cDNA 샘플에서 genomic DNA의 오염을 재확인하기 위한 qRT-PCR에 PCR 산물을 사용하였다. 합성한 cDNA는 iQ^TMSYBR Green Supermix 및 하기 표 1에 나타낸 특이 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분 가열 후, [95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초]를 한 사이클로 하여 45 사이클 반복. qRT-PCR은 반복 실험(biological 및 technical replicate)을 각각 적어도 두 번씩 수행하였다. 각 유전자의 상대적 발현량은 ΔΔCt 방법(Livak and Schmittgen 2001)으로 계산하였으며, 타겟 유전자 발현의 정확한 측정을 위해 내부 대조군 유전자( 18S rRNA)를 정규화에 이용하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ABA 또는 건조 스트레스 조건에서 CaRCAR1 유전자 발현은 점차적으로 감소하였다. 상기 결과는 CaRCAR1 유전자의 발현은 ABA 및 건조 스트레스와 밀접한 관련성을 갖는다는 것을 의미한다.

실시예 3. CaRCAR1 단백질의 세포내 발현 및 작용 위치 조사

CaRCAR1 단백질의 세포내 발현 및 작용 위치를 조사하기 위하여, 종결코돈을 갖지 않는 CaRCAR1 전장 cDNA의 C-말단에 형광단백질인 Green flourescent protein (GFP)을 결합시켜 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터 하에서 발현되도록 벡터를 구축하였다. 일시 발현을 위해서, 상기 CaRCAR1-GFP가 삽입된 벡터를 갖는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101를 p19 균주와 혼합하여 유전자 silencing을 피하고, 1ml needless 주사기를 사용하여 5주된 Nicotiana benthamiana 잎의 배축면에 주입하였다. 현미경 분석을 위해 잎절편을 주입 2일 후에 잘랐다. 하부 표피세포를 LSM Image Browser software로 조작되는 공초점 현미경(model Zeiss 510 UV/Vis Meta)으로 분석하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, CaRCAR1는 세포의 핵 및 세포질 모두에서 발현 또는 작용하는 것으로 확인되었다.

실시예 4. CaRCAR1 과발현 애기장대 돌연변이 식물체의 제조

CaRCAR1 유전자에 대해 식물체 내에서의 그 기능을 확인하기 위해 모델식물인 애기장대에 형질전환하였다. CaMV 35S 프로모터 하에 CaRCAR1 유전자의 상시발현을 유도하기 위해, CaRCAR1의 cDNA 전체 서열을 binary 벡터 pK2GW7에 삽입하였다. 이후 전기 천공법을 통해 상기 binary 벡터를 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101에 도입하였다. 애기장대 식물로의 CaRCAR1 유전자 도입은 floral dipping 방법을 사용하여 수행하였다. CaRCAR1 유전자 과발현(CaRCAR1-OX) 형질전환주의 선택을 위해, 형질전환된 것으로 추정되는 식물에서 수확한 종자를 50μg/ml 카나마이신을 포함한 MS 고체배지에 파종하여 선발하였다.

실시예 5. CaRCAR1 과발현 애기장대 돌연변이 식물체의 ABA 스트레스에 대한 증진된 민감도 확인

ABA 민감도에 대한 CaRCAR1 유전자의 역할을 알아보기 위하여 CaRCAR1이 과발현된 형질전환 애기장대 식물체(CaRCAR1-OX #4, #9)와 야생형(WT)인 대조군간의 발아율, 녹색 자엽의 비율, 및 뿌리의 길이를 비교하였다.

각 농도별 ABA(0, 0.50, 0.75, 1.00 μM)가 함유된 ㅍ MS 배지에 종자를 치상(planting)하고, 이 후 2일, 4일째 발아율을 측정하였으며, 상기 실험은 50개의 종자(seed)를 대상으로 실시되었으며, 독립적으로 3번 반복 수행하였다. 또한, ABA(0, 0.75 μM)가 함유된 ㅍ MS 배지에 종자를 치상(planting)한 후, 7일째 녹색 자엽의 비율을 측정하였으며, 상기 실험은 40개의 종자(seed)를 대상으로 실시되었으며, 독립적으로 3번 반복 수행하였다. 아울러, ABA(0, 0.5 μM)가 함유된 ㅍ MS 배지에 종자를 치상(planting)한 후, 7일째 뿌리의 길이를 측정하였으며, 상기 실험은 독립적으로 3번 반복 수행하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, ABA의 처리농도가 증가함에 따라, CaRCAR1이 과발현된 형질전환 및 야생형 애기장대 묘목의 발아율, 녹색 자엽의 비율, 및 뿌리 길이는 감소하였으며, CaRCAR1이 과발현된 형질전환 애기장대는 야생형인 대조군과 비교하여 낮은 발아율, 녹색 자엽의 비율을 보였으며, 뿌리 길이가 크게 감소하였다.

상기 결과는 CaRCAR1 유전자가 과발현된 애기장대에서 앱시스산(ABA)에 대한 민감도가 증진되었음을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to the drought stress using ABA receptor, CaRCAR1, in plants <130> CAU20141516KR_PB14-12162 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRCAR1 <400> 1 atggaggcac agtttgtaga aagataccat agtcatcagc ctagtgacca tcaaagtagt 60 tcatctcttg ttaagcacat caaagcacct gttgatattg tttggtcact cgtaaggaga 120 ttcgatcagc ctcagaagta taagccattt attagcaggt gtactgtgaa gggtgatctt 180 acaattggta gtgttagaga ggtgaatgtc aagtctggtc ttccagccac cactagcacc 240 gaaagattgg aacttcttga tgatgaggag catatccttg gcatcagaat cgttggtggc 300 gatcacaggc ttaagaacta ttcttcggtt attacagtcc atcccgagac acttgatggt 360 agaccgggga cactggtgat tgagtcattt atggtggatg tgcctgaagg gaacactcaa 420 gaggagactt gctactttgt gaaggcctta atcaattgca atctgaaatc actagctgat 480 gtatctgaga gaatggctat gcagggaggt gttgtaccca ccagtgtgaa ctggtcttct 540 agtaaccaga tcgagacatg a 561 <210> 2 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRCAR1 Protein <400> 2 Met Glu Ala Gln Phe Val Glu Arg Tyr His Ser His Gln Pro Ser Asp 1 5 10 15 His Gln Ser Ser Ser Ser Leu Val Lys His Ile Lys Ala Pro Val Asp 20 25 30 Ile Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Lys Tyr Lys 35 40 45 Pro Phe Ile Ser Arg Cys Thr Val Lys Gly Asp Leu Thr Ile Gly Ser 50 55 60 Val Arg Glu Val Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80 Glu Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp Glu Glu His Ile Leu Gly Ile Arg 85 90 95 Ile Val Gly Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Val Ile Thr 100 105 110 Val His Pro Glu Thr Leu Asp Gly Arg Pro Gly Thr Leu Val Ile Glu 115 120 125 Ser Phe Met Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Gln Glu Glu Thr Cys 130 135 140 Tyr Phe Val Lys Ala Leu Ile Asn Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp 145 150 155 160 Val Ser Glu Arg Met Ala Met Gln Gly Gly Val Val Pro Thr Ser Val 165 170 175 Asn Trp Ser Ser Ser Asn Gln Ile Glu Thr 180 185 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRCAR1-Forward <400> 3 atggaggcac agtttgtaga aagatacc 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRCAR1-Reverse <400> 4 tcatgtctcg atctggttac tagaagacc 29 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA-Forward <400> 5 tatggtgtgc accggtcgtc tcgt 24 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA-Reverse <400> 6 gcagttgttc gtctttcata aatccaa 27

Claims

고추 유래의 건조 스트레스 저항성 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaRCAR1 유전자.
제 1항에 기재된 CaRCAR1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드.
하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법:
(a) CaRCAR1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaRCAR1 유전자를 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaRCAR1 단백질을 과발현시키는 단계.
제 3항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질 전환 식물체.