CN116254238A

CN116254238A - 促进植物开花的cop1基因突变及其用途

Info

Publication number: CN116254238A
Application number: CN202211226069.7A
Authority: CN
Inventors: 胡金勇; 于冬梅; 董雪; 崔海涛; 蒋晓东; 邹可; 孙弋博; 闵峙杰; 张利平
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-10-09
Filing date: 2022-10-09
Publication date: 2023-06-13

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体而言本发明涉及植物COP1基因突变体及其促进植物早花的用途。在拟南芥COP1蛋白质中以S648为中心5埃范围内立体结构上靠近的16个氨基酸中，一个或2个或更多个氨基酸缺失、替换或插入影响COP1与CO蛋白质的相互作用，导致CO蛋白质不被降解，拟南芥植物发生早花。并且该16个氨基酸在诸多植物物种中高度保守。因此本发明的COP1基因变体具有广泛的应用价值，可以使用诸多植物物种的COP1基因变体培育具有早花特性的诸多植物品种。

Description

促进植物开花的COP1基因突变及其用途

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体而言，本发明涉及植物COP1基因突变体以及促进植物早花且不影响生长的用途。

背景技术

自然界存在25000多种开花植物，其中开花农作物给我们带来了丰富的食物、蔬菜和水果，比如小麦、大麦、玉米、高粱、马铃薯、芥菜、油菜、花生、大豆、苹果、桃等。开花植物的生长一般经历营养生长阶段和生殖生长阶段，其中营养生长期短则数月，多则数年。农作物必须在适宜的条件和正确的时间开花才能保证其种子的形成。农作物是固着在土地上生长的，生长环境如温度、光照等因素对其开花繁殖具有决定性作用，因而限制了它们的种植时间与范围。培育早花的农作物品种，适当扩大其种植范围、缩短其生长周期，不仅能丰富人们的食物资源，也能增加经济收入。

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的一个重要事件。以拟南芥(Arabidopsisthaliana)为例，其开花起始受光周期途径、赤霉素途径、春化途径、自主途径、年龄途径等多个途径的调控，有约200个基因参与其中。在光周期途径中，CO(Constans)是促进植物开花的关键基因。CO基因的转录水平和CO蛋白的累积水平在一天中具有周期性波动。研究认为，CO可以通过与HAP3(Heme Activator Protein 3)和HAP5(Heme Activator Protein 5)构成复合体，结合到FT启动子区，诱导其表达，从而促进开花。

COP1(Constitutively Photomorphogenic 1)是编码一个76kD的E3泛素连接酶的基因，对CO蛋白的降解/累积起重要作用。COP1最初是邓兴旺等利用拟南芥暗生长形态变异的突变体鉴定到的(Deng X W，Caspar T，Quail P H，1991，cop 1：a regulatory locusinvolved in light-controlled development and gene expression inArabidopsis.Genes Dev,5(7):1172-1178)。COP1蛋白包含一个N端的环形锌指结构域、一个卷曲螺旋结构域和一个C端的WD40重复序列结构域，并含有核定位信号和细胞质定位信号。其能够通过对光的感应，聚集在细胞核内或分散到细胞质中，调控植物的形态建成和其它光响应过程。

邓兴旺等(中国发明专利申请公开号CN1329670A)公开了cop1-4和cop1-6突变体能够改善拟南芥植物幼苗的表现型，即在黑暗下突变体幼苗具有展开的、紧密的似光下野生型的叶片，低光水平下幼苗比野生型黄萎现象减弱。研究表明，在短日照条件下，cop1-4和cop1-6突变体中能够积累光周期开花途径中的关键蛋白CO,因而比野生型提早开花，但其植株矮小；在长日照条件下，突变体的开花时间与野生型没有明显差别。因此，应用这两个cop1突变体改良农作物品种的潜力有限。

本发明则通过研究COP1与CO的相互作用的手段，找到了既能促进植物早花，同时又不影响植物生长发育的技术方案。

发明内容

本发明人发现，拟南芥COP1蛋白质三维立体结构上以S648为中心的5埃范围内的一个区域(在下文中称作5埃CO结合区)是能够使拟南芥早花的关键区域。该5埃CO结合区结构的改变，影响COP1与CO蛋白质的相互作用，导致CO蛋白质不被降解，使得拟南芥发生早花。由于该5埃CO结合区结构的改变仅影响到与CO蛋白质的结合，植物的生长发育不受影响，因此该5埃CO结合区中1个、2个或更多个氨基酸缺失或被替换或者紧邻5埃CO结合区的1个、2个或更多个氨基酸位置插入1个、2个或更多个氨基酸，通常会产生上述植物发生早花但生长发育不受影响的效果。

因此，本发明的一个方面涉及促使植物早花的COP1变体蛋白，其为被子植物门植物COP1蛋白的如下变体，其中SEQ ID NO：2氨基酸序列中I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664位置上的1个、2个或更多个氨基酸缺失或被替换或者紧邻上述1个、2个或更多个氨基酸位置插入1个、2个或更多个氨基酸，或者基于与SEQ ID NO：2的蛋白质序列比对，其他被子植物COP1中对应于SEQ ID NO：2的I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664位置上的1个、2个或更多个氨基酸缺失或被替换或者紧邻上述1个、2个或更多个氨基酸位置插入1个、2个或更多个氨基酸。

在更优选的实施方案中，所述5埃CO结合区内的氨基酸替换是同类氨基酸替换。更优选地，其中所述同类氨基酸替换是SEQ ID NO：2的S648位置上，或者基于与SEQ ID NO：2的蛋白质序列比，其他被子植物COP1中对应于SEQ ID NO：2的S648位置上的丝氨酸被同类氨基酸替换，例如丝氨酸被替换为天门冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或者甘氨酸。最优选地，所述同类替换是丝氨酸被替换为天门冬酰胺。

COP1蛋白的5埃CO结合区氨基酸序列在所研究的很多植物例如十字花科(Cruciferae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、禾本科(Gramineae)、茄科(Solanaceae)、伞形科(Umbelliferae)、菊科(Compositae)、锦葵科(Malvaceae)或葫芦科(Cucurbitaceae)植物中非常保守，同一性为100％。此外，在十字花科例如鼠耳芥属(Arabidopsis)、南芥属(Arabis)、山萮菜属(Eutrema)、亚麻荠属(Camelina)、荠属(Capsella)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)或芸薹属(Brassica)植物中，COP1蛋白中除5埃CO结合区氨基酸序列同一性100％之外，整个WD40结构域的氨基酸序列也是非常保守的。因此在本发明的技术方案中，所述被子植物门植物是十字花科、蔷薇科、豆科、锦葵科、葫芦科、菊科、茄科、伞形科或禾本科植物。更进一步地，所述的十字花科植物是鼠耳芥属的拟南芥(Arabidopsis thaliana)、南芥属的高山南芥(Arabis alpina)、山萮菜属的盐芥(Eutrema salsugineum)、亚麻荠属的亚麻荠(Camelina sativa)、荠属的荠菜(Capsellarubella)、萝卜属的萝卜(Raphanus sativus)、白芥属的白芥(Sinapis alba)、芸薹属的甘蓝(Brassica oleracea)、花椰菜(Brassica cretica)、白菜型油菜(Brassica rapa)或甘蓝型油菜(Brassica napus)。更进一步地，所述的蔷薇科植物是草莓(Fragariaananassa)、月季(Rosa chinensis)、苹果(Malus domestica)或桃(Prunus persica)，豆科植物是大豆(Glycine max)或花生(Arachis hypogaea)，禾本科植物是小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、粳稻(Oryza sativa Japonica Group)或籼稻(Onyza sativa Indica Group)，茄科植物是烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)或马铃薯(Solanum tuberosum)，伞形科植物是胡萝卜(Daucus carota subsp.Sativus)，菊科植物是向日葵(Helianthusannuus)，锦葵科植物是棉花(Gossypium hirsutum)，葫芦科植物是的黄瓜(Cucumissativus)。

在最优选的实施方案中，所述COP1变体蛋白具有SEQ ID NO.4所示序列。

在另一方面，本发明还涉及编码上述任一项所述COP1变体蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是多种形式的，例如可以是DNA、cDNA或mRNA。在最优选的实施方案中，所述核酸分子具有SEQ ID NO.3所示序列。

在另一方面，本发明还涉及上述COP1变体蛋白、核酸分子在促使植物早花中的用途。

在优选的方案中，来自十字花科、蔷薇科、豆科、禾本科、茄科、伞形科、菊科、锦葵科或葫芦科植物的COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使十字花科、蔷薇科、豆科、禾本科、茄科、伞形科、菊科、锦葵科或葫芦科植物早花。更优选地，将来自十字花科植物的COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使十字花科植物早花。更优选地，将来自上述某一科的植物COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使同一科植物早花。

在一个更优选的方案中，将来自鼠耳芥属、南芥属、山萮菜属、亚麻荠属、荠属、萝卜属、白芥属或芸薹属植物的COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使鼠耳芥属、南芥属、山萮菜属、亚麻荠属、荠属、萝卜属、白芥属或芸薹属植物早花。更优选地，将来自拟南芥、高山南芥、盐芥、亚麻荠、荠菜、萝卜、白芥、甘蓝、花椰菜、白菜型油菜或甘蓝型油菜的COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使拟南芥、高山南芥、盐芥、亚麻荠、荠菜、萝卜、白芥、甘蓝、花椰菜、白菜型油菜或甘蓝型油菜早花。更优选地，将来自上述某一属的植物COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使同一属植物早花。最优选地，将来自上述某一种的植物COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使同一种植物早花。

在另一个更优选的方案中，将来自草莓、月季、苹果、桃、大豆、花生、小麦、大麦、玉米、高粱、粳稻、籼稻、烟草、番茄、马铃薯、胡萝卜、向日葵、棉花、黄瓜的COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使草莓、月季、苹果、桃、大豆、花生、小麦、大麦、玉米、高粱、粳稻、籼稻、烟草、番茄、马铃薯、胡萝卜、向日葵、棉花、黄瓜早花。最优选地，将来自上述某一种的植物COP1变体蛋白、或编码所述COP1变体蛋白的核酸分子用于促使同一种植物早花。

在另一方面，本发明还涉及一种使植物早花的方法，其特征在于，将表达上述COP1变体蛋白的植物与不表达上述COP1变体蛋白的植物杂交，筛选表达上述COP1变体蛋白的植株，或者将上述核酸分子导入植物细胞并再生成植株。

本领域的技术人员能够根据具体情况需要容易地对本发明的技术方案做出适当的调整，这些调整仍然能够解决本发明的技术问题，也是本发明权利要求保护的范围。

下面通过附图和实施例进一步对本发明进行详细描述。

附图说明

图1是拟南芥cop1基因结构示意图。其中，基因结构根据拟南芥cop1基因序列AT2G32950绘制，图中显示了拟南芥cop1的基因结构，包括5‘-UTR、外显子、内含子以及3’-UTR，以及编码S648N突变位点的核苷酸所在的位置，即CDS编码区第1943位核苷酸由G突变为A。

图2是拟南芥COP1蛋白质结构示意图。其中显示了COP1蛋白的3个结构域，从N端至C端分别是环形锌指结构域(RING)、卷曲螺旋结构域(Coil)和7个WD40重复序列。同时还显示了本领域中cop1-4以及cop1-6突变体所涉及的突变位点，以及本发明一个实施方案的S648N(本发明中将其命名为cop1-21)突变位点。

图3是显示拟南芥COP1蛋白质立体结构中S648形成的氢键示意图。其中S648中侧链-OH与V374的-C＝O以及A662的-C＝O形成2个氢键，S648的-NH₂与A662的-C＝O形成一个氢键。

图4是显示拟南芥COP1变体蛋白质立体结构中N648形成的氢键示意图。其中N648中的侧链不与周围的氨基酸形成氢键，仅N648的-NH₂与A662的-C＝O形成一个氢键。

图5是显示拟南芥COP1中以S648为中心的5埃范围内的氨基酸以及所形成的氢键示意图。其中以S648为中心的5埃范围内的氨基酸分别为I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、A649、V650、A662、N663、S664，在此区域中共形成12个氢键。

图6是野生型及突变体cop1-21、cop1-4、cop1-6拟南芥在长日照(LD)和短日照(SD)条件下培养的植株表型比较图。植株在长日照情况下生长约4周，cop1-21突变型植株已经抽薹开花并且生长发育情况与野生型植株相比没有差别，而野生型、cop1-4和cop1-6突变体植株刚开始出现花苞，而且cop1-4和cop1-6突变体植株在生长发育上与野生型相比明显矮小。在短日照条件下生长约8周，野生型植株没有开花迹象，cop1-21、cop1-4和cop1-6突变体植株均抽薹开花，与野生型植株相比，cop1-21突变体植株在生长发育上没有差别，而cop1-4和cop1-6突变体植株明显矮小。

图7是等位性测验结果图。其中cop1-21与cop1-4以及cop1-21与cop1-6杂交F1代植株均表现出早花的表型。

图8是长/短日照条件下拟南芥野生型(Col-0)、cop1-21、co-9和cop1-21 co-9的开花时间。长日照条件下，野生型植株在约17片叶时开花，cop1-21在约14片叶时开花，开花时间提前，co-9及cop1-21 co-9均开花较晚，在约40片叶时才开花。短日照条件下，cop1-21在约26片叶时开花，显著早于野生型、co-9及cop1-21 co-9(均超过80片叶开花)。

图9是cop1-21与CO过表达系杂交的拟南芥植株在短日照条件下CO蛋白质丰度的Western blot图。其中以抗myc抗体杂交显示CO蛋白质，以Ponceau S染色显示上样量。在短日照条件下，cop1-21背景下的CO过表达系中CO蛋白大量积累。

图10是COP1^S648N与CO的免疫共沉淀实验结果。其中以抗HA抗体杂交显示CO蛋白，以抗GFP抗体杂交显示COP1和变体蛋白以及单独的YFP蛋白。结果显示，大量的CO蛋白能够与COP1蛋白共沉淀，但与COP1变体蛋白共沉淀的明显减少，表明COP1^S648N与CO的蛋白互作减弱。

图11是COP1^S648N与CO酵母双杂交实验结果图。其中，只有共转化pGADT7-CO和pBridge-COP1的酵母细胞能够在SD-Leu/-Trp/-His+1mM 3-AT的培养基上生长，表明CO蛋白与COP1蛋白能够互作，而COP1^S648N与CO蛋白不发生互作。

图12显示不同植物COP1蛋白质序列比对结果。其中各植物的COP1的WD40区相对其他区域比较保守，并且5埃CO结合区中的氨基酸完全相同，图中用下划线标记了7个桨片的各片层区，本发明5埃CO结合区氨基酸用粗体标记。

图13是十字花科植物COP1蛋白质序列比对结果图。其中WD40结构域(以拟南芥为例为第349至675位氨基酸)氨基酸序列比对结果显示具有95.7％的同一性，并且5埃CO结合区的16个氨基酸完全保守，同一性100％，本发明5埃CO结合区氨基酸用粗体标记。

发明详述

在本发明中，术语“早花”是指与野生型相比，植物提前现蕾开花的现象。其中，植物开花时间的指征为抽薹约2cm时的莲座叶数目。

“长日照条件”是指光照16小时/黑暗8小时，温度为21℃的培养条件。

“短日照条件”是指光照8小时/黑暗16小时，温度为21℃的培养条件。

拟南芥野生型cop1基因由2028个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码675个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明人的实验研究发现，拟南芥COP1基因CDS编码序列第1943位上的G突变为A，即(编码的COP1突变体蛋白为第648位的丝氨酸突变为天冬酰胺)后，在长、短日照条件下均能提早开花，并且植株的生长没有受到抑制。该突变基因被命名为cop1-21，相应编码的蛋白质命名为COP1^S648N蛋白。cop1-21基因的CDS编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，COP1^S648N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在此为基础，本发明人对拟南芥COP1蛋白及其变体蛋白COP1^S648N进行立体结构比较分析，发现在COP1蛋白中以S648为中心的5埃范围内由16个氨基酸组成了一个小的区域。该5埃范围区域中一个或两个氨基酸缺失、替换或者插入使得该区域结构发生改变，影响COP1与CO蛋白的相互作用，导致CO蛋白积累，使得拟南芥植物具有早花表型，在短日照或暗环境下开会花，但这种结构改变并不影响COP1蛋白质的其他功能。为表述方便，在本发明中该5埃区域称作5埃CO结合区，该5埃CO结合区共16个氨基酸，以拟南芥COP1蛋白为例，分别为I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664。该16个氨基酸在分类上为10个为非极性疏水氨基酸，6个为极性中性氨基酸，其中4个是丝氨酸。通过使用Pymol软件对COP1蛋白的WD40结构域的三维结构(PBD ID:5IGO)进行分析，发现该16个氨基酸中形成了12个氢键，加上具有10个非极性疏水氨基酸，因此该区域形成了以疏水相互作用和氢键维持的稳定的结构。

Uljon等详细研究了(Uljon等2016，Structure 24,687-696)拟南芥COP1的WD40结构域的立体结构，其是一种七个桨片的β螺旋桨结构，其中在第一桨片底部面上有一个插入的环，7个桨片分别为由片层1A、1B、1C、1D构成的第一桨片，由2A、2B、2C、2D构成的第二桨片，由3A、3B、3C、3D构成的第三桨片，由4A、4B、4C、4D构成的第四桨片，由5A、5B、5C、5D构成的第五桨片，由6A、6B、6C、6D构成的第六桨片和由7A、7B、7C、7D构成的第七桨片。其中A序列位于立体结构的内部，D序列位于立体结构的外缘。在氨基酸一级结构上，从N端至C端，分别是7D、1A、1B、1C、1D、2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C、3D、4A、4B、4C、4D、5A、5B、5C、5D、6A、6B、6C、6D、7A、7B、7C。该7个桨片构成的立体结构显示在顶部形成一个浅袋，在底部形成一个稍深的袋子。经过分析发现，本发明的氨基酸位点I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664分别位于1A，5A、6A、7A和7B片层区，即位于WD40结构域的浅袋内部核心中靠近第六和七桨片一侧。

由于COP1的WD40结构域与很多种蛋白质相互作用，并因此通过E3连接酶活性将所结合的蛋白质进行降解，例如与HY5、HYH、STO、STH、HFR1、cry1、cry2、phyA、phyB(ChunlingYi and Xingwang Deng，COP1-from plant photomorphogenesis to mammaliantumorigenesis，Trends in Cell Biology，2005，15(11)：618-625)。因此COP1序列中负责与多种配体蛋白质进行结合的WD40结构域非常保守，该结构域位置上的突变通常会导致结构发生变化从而引起不良的负面效果，诸如邓兴旺发现很多WD40结构域的突变体具有致死性，如cop1-5、cop1-7、cop1-8、cop1-9、cop1-10和cop1-11(Timothy W.McNellis,AlbrechtG.von arnlm,Takashi Araki,Yoshibuml Komeda,Simon Misera and Xing-Wang Deng,1994,Genetic and Molecular analysis of an Allelic Series of cop1 MutantsSuggests Functional Roles for the Multiple Protein Domains,The Plant Cell,6:487-500)，并且也发现致死突变cop1-8、cop1-9中COP1-8和COP1-9变体蛋白不能与HY5、STH和STO相互作用(Magnus Holm,Christian S.Hardtke,Rachelle Gaudet and Xing-WangDeng,2001,Identification of a structural motif that confers specificinteraction with the WD40 repeat domain of Arabidopsis COP1,The EMBO Journal，20(1&2):118-127)。

根据研究，很多COP1的结合配体，如HY5、STO、STH等结合至COP1的WD40结构域核心靠近第3、4和5桨叶侧，并且是通过离子键进行相互作用(Uljon等2016，Structure 24,687-696)。根据分析，由于其他WD40结构域的突变导致COP1蛋白立体结构具有较大的改变，影响到一些配体的结合，从而导致致死表型或者出现其他表型缺陷。而本发明中以S648为中心的由16个氨基酸组成的局部结构通过输水相互作用和氢键作用导致非常稳定，一个或数个氨基酸的突变仅产生局部小的立体结构改变，该改变仅影响到浅袋内部核心中靠近第六和七桨片一侧，而核心的另外一侧的结构应该没有受到影响，因此本发明的突变仅仅导致不能结合CO蛋白，而不影响结合到核心另一侧或者其他部位的配体如HY5、STO、STH等的结合，因此仅出现由于CO累积导致的早花效应，不会出现其他生长发育的缺陷，例如植株矮小等。

众所周知，组成生物体的氨基酸有20种，根据氨基酸侧链的性质将氨基酸分成4类，①含非极性、疏水性侧链氨基酸，包括丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val、V)、亮氨酸(Leu、L)、异亮氨酸(Ile、I)、脯氨酸(Pro、P)、甘氨酸(Gly、G)、蛋氨酸(Met、M)、色氨酸(Trp、W)和苯丙氨酸(Phe、F)；②含极性、中性侧链的氨基酸，包括谷氨酰胺(Gln、Q)、丝氨酸(Ser、S)、苏氨酸(Thr、T)、半胱氨酸(Cys、C)、天冬酰胺(Asn、N)和酪氨酸(Tyr、Y)；③含极性、酸性侧链的氨基酸，包括天冬氨酸(Asp、D)和谷氨酸(Glu、E)；④含极性、碱性侧链的氨基酸，包括赖氨酸(Lys、K)、精氨酸(Arg、R)和组氨酸(His、H)。在本发明中，术语非极性疏水氨基酸、极性中性氨基酸是指上述第①和第②类氨基酸，本发明中，术语同类氨基酸替换是指将上述4类氨基酸定义中的某一类的氨基酸使用与其相同类别的氨基酸进行替换。在本发明中，在所述16个氨基酸形成的5埃CO结合区中，对于1个、2个或更多个氨基酸进行任何类型的氨基酸替换或插入均能实现仅仅影响该局部结构从而仅影响与CO结合的技术效果，因此任何类型的氨基酸替换或插入均为本发明的实施方案。由于该局部区域包括10个非极性疏水氨基酸和6个极性中性氨基酸，本领域技术人员已知，使用同类的氨基酸进行替换或插入，对局部的立体结构的影响相对较小，因此优选地本发明通过进行非极性疏水氨基酸或极性中性氨基酸进行同类氨基酸替换或插入实施。此外，应当理解，该5埃CO结合区中1个、2个或更多个氨基酸的缺失亦可引起同样的效应，即仅仅5埃CO结合区发生局部结构改变，导致不能与CO蛋白质结合，因此所述缺失突变也能实现本发明的技术效果，均为本发明的实施技术方案。

为了研究上述5埃CO结合区的氨基酸在被子植物中的保守情况，本发明人选取了被子植物中的一些植物进行了序列比对。这些植物包括十字花科的拟南芥(GenBank:GenBank:ABF57293.1)、甘蓝型油菜(GenBank:CAF2096033.1)和萝卜(NCBI ReferenceSequence:XP_018441855.1)，蔷薇科的草莓(GenBank:API61819.1)、月季(NCBI ReferenceSequence:XP_024173448.1)、苹果(NCBI Reference Sequence:XP_028951334.1)和桃(NCBI Reference Sequence:XP_007210464.2)，豆科的大豆(NCBI Reference Sequence:XP_003545597.1)和花生(NCBI Reference Sequence:XP_025609023.1)，禾本科的小麦(GenBank:KAF7091270.1)、大麦(GenBank:KAE8814141.1)、玉米(NCBI ReferenceSequence:XP_008677082.1)、高粱(NCBI Reference Sequence:XP_021315078.1)、粳稻(NCBI Reference Sequence:XP_015627602.1)和籼稻(GenBank:EEC74080.1)，茄科的烟草(NCBI Reference Sequence:XP_016503261.1)、番茄(GenBank:AAC98912.1)和马铃薯(NCBI Reference Sequence:XP_006351972.1)，伞形科的胡萝卜(NCBI ReferenceSequence:XP_017228304.1)，菊科的向日葵(NCBI Reference Sequence:XP_021989424.1)，锦葵科的棉花(NCBI Reference Sequence:XP_016710447.2)，和葫芦科的黄瓜(NCBI Reference Sequence:XP_004143233.1)，在这些植物的后面给出了相应的GenBank登录号或者NCBI参考序列号，可以方便地从公开的数据库中查询到相应的序列信息。对比软件使用的是软件ClustalW。

通过比对发现，许多被子植物COP1的WD40结构域(以拟南芥为例为第349至675位氨基酸)相对于其他结构域比较保守，虽然WD40结构域的327个氨基酸中完全相同的氨基酸有185个，同一性为56.6％，但形成七个桨片的片层区序列的氨基酸相当大部分完全相同，且5埃CO结合区的16个氨基酸完全相同。

本发明人进一步对十字花科植物进行了同样的序列比对，这些十字花科植物分别是：鼠耳芥属的拟南芥(GenBank:ABF57293.1)，南芥属的高山南芥(GenBank:KFK31097.1)，山萮菜属的盐芥(NCBI Reference Sequence:XP_006410433.1)，亚麻荠属的亚麻荠(NCBIReference Sequence:XP_010509945.1)，荠属荠菜(NCBI Reference Sequence:XP_023640041.1)，萝卜属的萝卜(NCBI Reference Sequence:XP_018441855.1)，白芥属的白芥(GenBank:KAF8049993.1)，芸薹属的甘蓝(NCBI Reference Sequence:XP_013637215.1)、花椰菜(GenBank:KAF3554934.1)、白菜型油菜(GenBank:AEE81754.1)和甘蓝型油菜(GenBank:CAF2096033.1)，在这些植物的后面给出了相应的GenBank登录号或者NCBI参考序列号，可以方便地从公开的数据库中查询到相应的序列信息。

经过序列对比发现十字花科COP1的WD40结构域(以拟南芥为例为第349至675位氨基酸)序列同一性为95.7％，其中327个氨基酸中有14个位置上的氨基酸在各个十字花科植物中有所差异，其中有13个氨基酸发生了替换，且大多数为同类氨基酸替换，另有一个不同是高山南芥中对应于拟南芥第408位的A缺失。并且其中5埃CO结合区的16个氨基酸在这些植物中完全保守，同一性为100％。

对于上述的其他被子植物，由于其与拟南芥植物COP1蛋白5埃CO结合区具有100％的同一性并且十字花科植物WD40结构域的相对高保守性，加之现有的植物开花理论，据信其他被子植物也具有类似的调控开花的途径。尤其是通过COP1-CO基因调控开花的途径。因为，这些植物中的COP1与拟南芥植物COP1具有80％-90％不等的序列同一性，尤其是在与CO等蛋白质相互作用的WD40区具有高度保守的同一性，更因为本发明所述5埃CO结合区的16个氨基酸在不同的植物物种中是100％相同，并且氨基酸类型也非常保守，这一区域大部分是非极性的氨基酸，且不带电荷，因此他们在局部通过输水相互作用，构成了保守的结构域，因此该结构域的空间立体构型是具有非常重要意义的。由于所述的16个氨基酸在上述大跨度的被子植物物种中依然相同，因此可知COP1与CO相互作用的结构域相同，因此通过在所有其他物种中，在与拟南芥S648为中心的5埃CO结合区16个氨基酸位置的等价位置上进行1个、2个或更多个氨基酸替换、缺失或插入，同样能够实现所述这些物种在短日照条件下出现早花。因此这些物种中相应的COP1变体基因或变体蛋白也是能够实现本发明技术效果的技术方案，理应也处于本发明的保护范围之中。

因此，本发明的一个方面涉及促使植物早花的COP1变体蛋白，其为被子植物门植物COP1蛋白的如下变体，其中SEQ ID NO：2氨基酸序列中I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664位置上的1个、2个或更多个氨基酸缺失或被替换或者紧邻上述1个、2个或更多个氨基酸位置插入1个、2个或更多个氨基酸，或者基于与SEQ ID NO：2的蛋白质序列比对，其他被子植物COP1中对应于SEQ ID NO：2的I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664位置上的1个、2个或更多个氨基酸缺失或被替换或者紧邻上述1个、2个或更多个氨基酸位置插入1个、2个或更多个氨基酸。上述的其他被子植物是指除了拟南芥之外的其他被子植物，其中包括上述高山南芥、盐芥、亚麻荠、荠菜、萝卜、白芥、甘蓝、花椰菜、白菜型油菜、甘蓝型油菜、草莓、月季、苹果、桃、大豆、花生、小麦、大麦、玉米、高粱、粳稻、籼稻、烟草、番茄、马铃薯、胡萝卜、向日葵、棉花、黄瓜。

上述氨基酸替换或插入优选地以极性中性氨基酸或非极性疏水氨基酸进行替换或插入。优选地是S648位置上的丝氨酸被同类氨基酸替换，例如丝氨酸被替换为天门冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或者甘氨酸。最优选地是第648位置上的丝氨酸被替换为天门冬酰胺。

在另一方面中，本发明提供了编码COP1变体蛋白的核酸分子，所述核酸分子编码上述的COP1变体蛋白。众所周知，由于生物密码子的简并性，即一种氨基酸可由一个或多个密码子编码，所以编码本发明COP1变体蛋白的核酸分子非常多，无法一一列举，只要核酸分子能够表达出本发明所述的COP1变体蛋白，即能够实现使植物发生早花特性。因此，本发明使得植物早花的编码COP1变体蛋白的核酸分子并不仅限于拟南芥核苷酸序列SEQ ID NO：3。并且根据本发明的COP1变体蛋白设计和核酸分子合成是本领域众所周知的。

在本发明中，为了将本发明的COP1突变基因导入植物细胞，通常可以将所述的核酸分子插入到表达载体中形成表达构建体。可以通过常规的导入试剂或方法将本发明的表达构建体导入细胞，在目的植物细胞中经整合、转录和翻译后，产生本发明的COP1变体蛋白。适用于此目的的载体、导入试剂或方法有很多种，也是本领域众所周知的。

在又一方面中，本发明还涉及上述COP1变体蛋白、核酸分子在使植物早花中的用途。由上述可知，使用不同的技术手段使得植物能够表达出本发明所述的COP1变体蛋白，通过促进植物CO的积累，植物出现早花特性。如此产生的植物品种可以提早进入开花阶段，这具有非常重要的经济价值。并且如上所述，在所分析的植物中，特别是十字花科植物中，COP1的WD序列同一性非常高，因此对于每一种植物而言，来自其他物种的异源性COP1变体蛋白也具有使该植物早花的作用，尤其是植物物种的亲缘关系比较近时，例如同一科不同的物种，更近一步地，同一属不同的物种，因此这种异源性的应用也处于本发明的保护范围之内。

在本发明中，以通过体外培养细胞的方式进行繁殖培育具有早花特性的植株。具体而言，将本发明的COP1变体基因或者表达载体导入植物细胞，然后将植物细胞培育成植株。导入的变体基因经重组整合到植物基因组中，使得植物细胞能够表达本发明的COP1变体蛋白。用于该目的的表达载体、导入试剂或方法、基因重组整合以及体外培养的技术是本领域众所周知的。除此之外，也可以通过传统的杂交方法培育具有早花特性的植株。具体而言，将表达上述COP1变体蛋白的植物与不表达上述COP1变体蛋白的植物杂交，然后筛选出表达上述COP1变体蛋白的子代植株。

以下结合具体的实施例对本发明进行进一步的描述，但这些实施例无论如何也不构成对本发明保护范围的限制。实施例中使用的实验方法和技术如无特别指明，则均是本领域常规技术，所使用的试剂和材料如无特别指明，则均是可以商业购得的常规试剂和材料。

实施例

实施例1：cop1-21突变体的建立

本发明人通过野生型与报导的myc突变体(Fernandez-Calvo et al.,2011,PlantCell,23:701-715.)杂交的F₂代中中分离到早花突变体。具体地，在短日照条件下，F₂代群体出现明显的早花/晚花分离，且PCR检测发现开花时间的早晚与MYC基因的突变没有关系，表现为早花个体中MYC基因野生型、杂合与突变共存。为了确认导致早花表型的基因，本发明人分别收集F₂代群体中的早花个体(32株)和晚花个体(33株)，CTAB法提取基因组DNA，等量混合，进行BSA(Bulk Segregant Analysis)测序。对早花个体混池和晚花个体混池的测序结果进行SNP(Single Nucleotide Polymorphism)分析，最终发现10个基因的编码区因核苷酸突变导致氨基酸序列发生改变，其中一个是COP1基因的第1943位核苷酸G突变为A，该突变体命名为cop1-21，其CDS编码核苷酸序列示于SEQ ID NO.3，所编码的蛋白质序列示于SEQ ID NO.4。

实施例2：拟南芥COP1蛋白S648N突变的热力学稳定性分析

为了分析拟南芥COP1蛋白在发生S648N突变后的稳定性，本发明人以COP1的WD40结构域的三维结构(PDB ID：5IGO)为初始模型，应用FoldX软件计算WD40结构域的自由能，并对WD40的三维结构进行修正，使自由能降低，即使结构更稳定。在此基础上，将Ser648替换为Asn，计算自由能，并比较突变前后自由能的变化。

拟南芥COP1蛋白S648N突变的热力学稳定性分析结果如表1所示。突变发生后，WD40结构域的自由能增加了3.53022kcal/mol，形成高度不稳定状态。

表1拟南芥COP1蛋白S648N突变的热力学稳定性变化

	S648N
		SD	0.261816
Backbone H Bond	0.267406
		Sidechain H Bond	0.335354
Van der Waals	-0.790787
		Electrostatics	0
Solvation Polar	1.13185
		Solvation Hydrophobic	-1.21872
Van der Waals Clashes	1.83161
		Entropy Sidechain	0.255414
Entropy Mainchain	0.815172
		cis_Bond	0
Torsional Clash	0.902928
		Backbone Clash	0.170781
Helix Dipole	0
		Water Bridge	0
Disulfide	0
		Electrostatic kon	0
Partial Covalent Interations	0
		Energy Ionisation	0
Entropy Complex	0
		Stability(ΔΔG)＝	3.53022kcal/mol

实施例3：COP1野生型以及变体蛋白的立体结构模拟

为了分析S648N突变前后拟南芥COP1蛋白WD40结构域立体结构的变化，本发明人利用Pymol软件，以修正后的拟南芥COP1蛋白WD40结构域及其Asn648变体结构域为对象，分别对第648位氨基酸及其5埃范围内的氨基酸进行氢键形成分析。

拟南芥COP1蛋白质中S648为中心的局部立体结构以及所形成的氢键如图3所示。其中S648中侧链-OH中的H原子可与V374的-C＝O及A662的-C＝O形成2个氢键，S648的-NH₂与A662中-C＝O形成一个氢键。

拟南芥COP1变体蛋白的局部立体结构以及所形成的氢键如图4所示。其中N648中的侧链不能与周围的氨基酸基团形成氢键，仅N648的-NH₂与A662的-C＝O形成一个氢键。相对于野生型，变体蛋白质中该区域的氨基酸间形成的氢键数目减少，导致空间结构变得松散。

以S648为中心5埃范围内的氨基酸及其氢键分析结果示于图5。该范围内的氨基酸分别为I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、A649、V650、A662、N663、S664，围绕此区域共形成12个氢键。除S648参与形成的3个氢键外，还包括S375的-NH₂与A389的-C＝O、S376的-C＝O与A389的-NH₂、F646的-NH₂与S664的-OH、F646的-C＝O与S664的-NH₂、I647的-NH₂与S609的-C＝O、A649的-C＝O与A662的-NH₂、A649的-NH₂与A662的-C＝O、A663的-NH₂与T667的-C＝O及N663的-C＝O与G666的-NH₂之间形成的氢键。

实施例4：cop1-21突变型植株的早花表型

本发明进一步开展实验验证cop1-21突变型植株在短日照和长日照条件下提早开花。

首先将野生型Col-0和cop1-21突变型种子浸泡在水中，4℃放置3天，分别在长/短日照条件的培养间中播种于土盆中。土盆大小6cm×6cm×8cm，生长约10天后间苗，每盆保留1株，生长至突变型植株抽薹开花。每个基因型的植株约20株，用以计算开花时叶片的平均值。其中，野生型Col-0为拟南芥试验的必需参照，由本实验室繁殖保存，cop1-4和cop1-6突变型对照由邓兴旺教授实验室提供。

实验结果示于图6。其中，在长日照条件下生长约4周，突变型cop1-21植株已经抽薹开花，而野生型及突变型cop1-4和cop1-6植株刚刚出现开花迹象。与野生型植株相比，cop1-21突变型植株在生长发育上没有明显变化，而cop1-4和cop1-6突变型植株明显矮小。在短日照条件下生长约8周，突变型cop1-21及cop1-4和cop1-6的植株陆续抽薹开花，而野生型植株没有开花迹象。同样地，与野生型植株相比，cop1-21突变型植株在生长发育上没有明显变化，而cop1-4和cop1-6突变型植株明显矮小。

实施例5：等位性测验实验

本发明人开展等位性测验实验以验证cop1-21突变与植株早花是否具有直接关系。

以实施例1中得到的cop1-21为母本，分别将cop1-4和cop1-6的花粉涂抹到其未开放花朵的柱头上进行杂交，获得F₁代种子。因为短日照条件下野生型与突变体间开花时间差异更明显，所以本发明人在短日照条件下，以各亲本为对照，观察F₁代植株的开花表型。理论上，如果早花表型是由cop1-21突变导致的，与其它早花的cop1突变体的杂交后代仍为早花；反之，则表现为与野生型相似的表型。

实验结果示于图7。其中，cop1-21与cop1-4以及cop1-21与cop1-6杂交的F1代植株生长约8周后陆续开花，均表现出早花表型。由此说明，早花的cop1-21的确是由COP1的单碱基替换导致的。

实施例6：COP1下游基因验证

为了探索COP1的S648N突变导致植株早花的分子途径，本发明人开展了突变体杂交实验。首先，将花期一致的cop1-21与co-9进行杂交，获得杂合的F₁代种子。F₁代植株自交，获得分离的F₂代种子。在F₂代植株中，将开花时间晚的植株(co-9突变型)保留下来。针对cop1-2 1单碱基突变的特点，应用dCAPS方法(http://helix.wustl.edu/dcaps/)设计上下游引物5’-CGTGACATCGCACAGATTTGGATC-3’(SEQ ID NO.5)和5’-CATCGTGGGACTATCACTCTTCCAGCAAAgtGCA-3’(SEQ ID NO.6)，对保留下来的晚花植株的基因组DNA进行PCR扩增、Alw44I(Thermo)酶切扩增产物和琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增产物不能被Alw44I酶切开的为突变体cop1-21(即突变位点的核苷酸为A)。包含纯合点突变COP1基因的晚花植株即为cop1-21 co-9双突变型。co-9突变体种子是由德国George Coupland教授实验室提供的。本发明人分别在长/短日照条件下对野生型Col-0与单突变型cop1-21、co-9及双突变型cop1-21 co-9的开花时间进行观察和比较分析。

长/短日照条件下，Col-0、cop1-21、co-9及cop1-21 co-9植株的开花时间结果示于图8。其中，长日照条件下，cop1-21植株开花时间(RLN＝13.75)明显早于野生型Col-0(RLN＝17.08),而co-9(RLN＝39.08)及cop1-21 co-9(RLN＝40.13)明显晚于野生型。短日照条件下，cop1-21植株开花时间(RLN＝26.31)仍明显早于野生型Col-0(RLN＝81.84)，而co-9(RLN＝82.13)及cop1-21 co-9(RLN＝82.36)与野生型无明显差异。两种条件下，双突变型的开花表型都与co-9基本一致，说明CO基因在COP1的下游起作用。

实施例7：CO蛋白丰度实验

本发明人进一步开展实验以探索COP1的S648N突变导致植株早花的分子机制。将cop1-21与过表达系35S:myc-CO杂交，在F₂代分离群体中对每个植株进行PCR鉴定，筛选获得cop1-21 35S:myc-CO基因型，PCR鉴定方法同实施例6。过表达系35S:myc-CO由上海交通大学的李琳教授实验室提供。

在短日照条件下，将Col-0、cop1-21、35S:myc-CO及cop1-21 35S:myc-CO的种子表面消毒后播在1/2MS培养基上生长。两周后，取幼苗，液氮中研磨成粉末，提取总蛋白(参见冷泉港实验室方法，https://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/1/pdb.prot4680)，加热变性后，在12％的SDS-PAGE胶上分离蛋白(参见Bio-rad的

TetraCell使用手册)，转膜(参见Bio-rad的Mini/>

Electrophoretic Transfer Cell使用手册)，以anti-myc(GNI,GNI4110-MC)为一抗，进行Western blot分析。HRP化学发光显色(#PA112，Tiangen)后，天能4600全自动化学发光图像分析系统成像。根据条带的浓度比较CO蛋白的量。

Western blot分析结果示于图8。与野生型背景相比，cop1-21背景下，过表达CO产生的CO蛋白大量积累。由于CO具有促进FT基因表达的功能，导致植株最终表现为早花。由此表明，发生S648N突变的COP1降解CO蛋白的能力显著减弱，使得CO蛋白的稳定性增加。

实施例8：COP1^S648N与CO蛋白的互作实验

为了探索S648N突变对COP1-CO蛋白互作的影响，本发明人分别用免疫共沉淀方法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和酵母双杂交方法对COP1^S648N-CO的互作进行了实验。具体地，以野生型Col-0或cop1-21幼苗为材料，Trizol方法提取总RNA(Invitrogen)，反转录形成cDNA(HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)，#R312，Vazyme)，以引物5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctctATGTTGAAACAAGAGAGTAACGAC-3’(SEQ ID NO.7)和5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCCCTGCTGCGTTATGGGAAG-3’(SEQID NO.8)PCR扩增全长CO编码序列，以引物5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctctATGGAAGAGATTTCGACGGATC-3’(SEQ ID NO.9)和5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCGCAGCGAGTACCAGAAC-3’(SEQ ID NO.10)PCR扩增全长COP1或COP1^S648N编码序列，Gateway克隆方法创建pENSG-YFP-COP1或pENSG-YFP-COP1^S648N与pENSG-3×HA-CO载体(Gateway^TM LR Clonase^TMII Enzyme Mix，#11791，Invitrogen)。在短日照条件下培养cop1-21植株约1个月，选取完全展开的嫩叶，参照文献(Yoo et al.,2007,Nat Protoc(2):1565-1572)报道的方法制备原生质体。然后经由PEG介导的方法分别将质粒组合pENSG-YFP-COP1与pENSG-3×HA-CO或pENSG-YFP-COP1^S648N与pENSG-3×HA-CO转入原生质体。转化的原生质体室温下孵育过夜后裂解，以GFP琼脂糖珠(Chromotek,gtma-20)捕捉抗原抗体复合物。GFP琼脂糖珠加入等量的2×SDS-PAGE loading buffer[100mM Tris-HCl(pH6.8)，4％(W/V)SDS，0.2％(W/V)溴酚蓝，20％(V/V)甘油，2％β-巯基乙醇]，加热变性后，SDS-PAGE电泳、转膜、Western分析、化学发光显色及成像步骤参照实施例7。Western分析中以anti-HA抗体(#11867423001，Roche)检测HA-CO，以anti-GFP抗体(#ab290，Abcam)检测YFP-COP1或YFP-COP1^S648N。

酵母双杂交的方法是先把COP1或COP1^S648N和CO的编码区序列分别连接到pBridge(Takara)和pGADT7(Takara)载体上。具体地，以上述pENSG-3×HA-CO、pENSG-YFP-COP1或pENSG-YFP-COP1^S648N质粒为模板，使用引物5’-cgtaccagattacgctcatATGTTGAAACAAGAGAGTAACGAC-3’(SEQ ID NO.11)和5’-ctacgattcatctgcagctcgagTCACCCTGCTGCGTTATGGGAAG-3’(SEQ ID NO.12)PCR扩增全长CO编码序列，重组连接(

-Basic Seamless Cloningand Assembly Kit，#CU201，TransGen)到NdeI/XhoI(Thermo)酶切的pGADT7片段上，使用引物5’-ctgtatcgccggaattcATGGAAGAGATTTCGACGGATC-3’(SEQ ID NO.13)和5’-gaattagcttggctgcagTCACGCAGCGAGTACCAGAAC-3’(SEQ ID NO.14)PCR扩增全长COP1或COP1^S648N编码序列，重组连接到EcoRI/PstI(Thermo)酶切的pBridge片段上。再应用PEG介导的方法共同转化AH109酵母细胞(Takara)。具体方法参见Takara的Yeast Protocols Handbook。转化后的酵母细胞先在SD-Leu-Trp培养基(Takara)上生长，挑取SD-Leu-Trp平板上的单克隆进行培养，离心收集后，以无菌水稀释，调节OD₆₀₀的值到1.0，再取10ul菌液滴在SD-Leu-Trp-His(Takara)+1mM 3-AT培养基上，置于30℃培养，以检测其互作。

COP1^S648N与CO蛋白的免疫共沉淀实验结果示于图9。其中，与COP1蛋白质相比，COP1^S648N蛋白在共沉淀过程中结合的CO蛋白显著减少。由此表明，COP1^S648N与CO蛋白的结合能力明显下降，即COP1^S648N与CO的蛋白作用减弱。

酵母双杂交实验结果示于图10。其中，pGADT7-CO和pBridge-COP1共转化的酵母细胞能够在筛选培养基上生长，而pGADT7-CO和pBridge-COP1^S648N共转化的酵母细胞不能在筛选培养基上生长，说明COP1^S648N与CO蛋白互作显著减弱。这应该是导致COP1^S648N不能降解CO蛋白的直接原因。

实施例9：不同植物物种COP1蛋白WD40结构域内5埃CO结合区氨基酸序列比对

为了检验不同物种COP1蛋白WD40结构域内5埃CO结合区氨基酸的保守性，本发明人在GeneBank中搜索了21种常见经济植物COP1蛋白并使用ClustalW在线软件对这些蛋白与拟南芥COP1(ABF57293.1)进行氨基酸序列比对。该21种COP1蛋白序列分别是KAF7091270.1(小麦)、KAE8814141.1(大麦)、XP_008677082.1(玉米)、XP_021315078.1(高粱)、XP_015627602.1(粳稻)、EEC74080.1(籼稻)、XP_017228304.1(胡萝卜)XP_021989424.1(向日葵)XP_016503261.1(烟草)、AAC98912.1(番茄)、XP_006351972.1(马铃薯)、XP_004143233.1(黄瓜)、API61819.1(草莓)、XP_024173448.1(月季)、XP_028951334.1(苹果)、XP_007210464.2(桃))、XP_003545597.1(大豆)、XP_025609023.1(花生)、XP_016710447.2(棉花)、XP_018441855.1(萝卜)、CAF2096033.1(甘蓝型油菜)。

使用同样的方法，在GeneBank中搜索了十字花科中10种植物的COP1蛋白并使用ClustalW在线软件对这些蛋白与拟南芥COP1(ABF57293.1)进行氨基酸序列比对。这些序列分别是KFK31097.1(高山南芥)、XP_006410433.1(盐芥)、XP_010509945.1(亚麻荠)、XP_023640041.1(欧荠菜)、AEE81754.1(白菜型油菜)、CAF2096033.1(甘蓝型油菜)、XP_013637215.1(甘蓝)、KAF3554934.1(花椰菜)、KAF8049993.1(白芥)和XP_018441855.1(萝卜)。

序列比对结果示于图12和图13中，其中“*”表示所比较植物COP1的氨基酸序列相同，“:”表示氨基酸具有强保守性，“.”氨基酸具有弱保守性。结果显示，无论是在十字花科的11种植物中，还是在不同科的21种经济植物中，COP1蛋白WD40结构域内5埃CO结合区内的16个氨基酸完全相同。此外，十字花科的11种植物COP1蛋白WD40结构域(以拟南芥为例为第349至675位氨基酸)氨基酸序列比对结果显示具有95.7％的同一性，其中327个氨基酸中，有14个氨基酸发生的替换大多数为同类氨基酸，其中仅有一个是缺失一个A。这些高度保守的氨基酸对COP1蛋白的功能具有重要意义。

Claims

1.使植物早花的COP1变体蛋白，其为被子植物门植物COP1蛋白的如下变体，其中SEQID NO：2氨基酸序列中I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664位置上的1、2或更多个氨基酸缺失或被替换或者紧邻上述1、2或更多个氨基酸位置插入1、2或更多个氨基酸，或者基于与SEQ ID NO：2的蛋白质序列比对，其他被子植物COP1中对应于SEQ ID NO：2的I373、V374、S375、S376、Y554、F595、V596、G597、F646、I647、S648、A649、V650、A662、N663、S664位置上的一个或2个氨基酸缺失或被替换或者紧邻上述1、2或更多个氨基酸位置插入1、2或更多个氨基酸。

2.权利要求1所述的COP1变体蛋白，其中所述氨基酸替代是同类氨基酸替代。

3.权利要求2所述的COP1变体蛋白，其中所述同类氨基酸替代是SEQ ID NO：2的S648位置上或基于与SEQ ID NO：2的蛋白质序列比对，其他被子植物COP1中对应于SEQ ID NO：2的S648位置上丝氨酸被替换为天门冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或者甘氨酸。

4.权利要求1所述的COP1变体蛋白，其中所述的被子植物是十字花科、蔷薇科、豆科、禾本科、茄科、伞形科、菊科、锦葵科或葫芦科植物。

5.权利要求4所述的COP1变体蛋白，其中所述的十字花科植物是鼠耳芥属、南芥属、山萮菜属、亚麻荠属、荠属、萝卜属、白芥属或芸薹属植物。

6.权利要求5所述的COP1变体蛋白，其中所述鼠耳芥属植物是拟南芥、南芥属植物是高山南芥、山萮菜属植物是盐芥、亚麻荠属植物是亚麻荠、荠属植物是荠菜、萝卜属植物是萝卜、白芥属植物是白芥、芸薹属植物是甘蓝、花椰菜、白菜型油菜或甘蓝型油菜。

7.权利要求4所述的COP1变体蛋白，其中所述的蔷薇科植物是草莓、月季、苹果或桃，豆科植物是大豆或花生，禾本科植物是小麦、大麦、玉米、高粱、粳稻或籼稻，茄科植物是烟草、番茄或马铃薯，伞形科植物是胡萝卜，菊科植物是向日葵，锦葵科植物是棉花，葫芦科植物是的黄瓜。

8.一种核酸分子，其编码权利要求1-7任一项所述COP1变体蛋白。

9.权利要求1-7任一项所述的COP1变体蛋白、权利要求8所述的核酸分子在使植物早花中的用途。

10.权利要求9所述的用途，其中所述的变体蛋白是权利要求4所述的COP1变体蛋白，所述的核酸分子是编码权利要求4所述COP1变体蛋白的核酸分子，所述的植物是十字花科、蔷薇科、豆科、禾本科、茄科、伞形科、菊科、锦葵科或葫芦科植物。

11.权利要求10所述的用途，其中所述的变体蛋白是权利要求5所述的COP1变体蛋白，所述的核酸分子是编码权利要求5所述COP1变体蛋白的核酸分子，所述的十字花科植物是鼠耳芥属、南芥属、山萮菜属、亚麻荠属、荠属、萝卜属、白芥属或芸薹属植物。

12.权利要求11所述的用途，其中所述的变体蛋白是权利要求6所述的COP1变体蛋白，所述的核酸分子是编码权利要求6所述COP1变体蛋白的核酸分子，所述的鼠耳芥属植物是拟南芥、南芥属植物是高山南芥、山萮菜属植物是盐芥、亚麻荠属植物是亚麻荠、荠属植物是荠菜、萝卜属植物是萝卜、白芥属植物是白芥、芸薹属植物是甘蓝、花椰菜、白菜型油菜或甘蓝型油菜。

13.权利要求10所述的用途，其中所述的变体蛋白是权利要求7所述的COP1变体蛋白，所述的核酸分子是编码权利要求7所述COP1变体蛋白的核酸分子，所述的蔷薇科植物是草莓、月季、苹果或桃，豆科植物是大豆或花生，禾本科植物是小麦、大麦、玉米、高粱、粳稻或籼稻，茄科植物是烟草、番茄或马铃薯，伞形科植物是胡萝卜，菊科植物是向日葵，锦葵科植物是棉花，葫芦科植物是的黄瓜。

14.一种使植物早花的方法，其特征在于，

将权利要求8所述的核酸分子导入植物细胞并再生成植株，或者

将表达权利要求1-7任一项所述COP1变体蛋白的植物与不表达权利要求1-7任一项所述COP1变体蛋白的植物杂交，筛选表达权利要求1-7任一项所述COP1变体蛋白的植株。