CN105087508A - 茄子黄烷酮3-羟化酶SmF3H及其基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种茄子黄烷酮3-羟化酶SmF3H及其基因和应用，所属基因的cDNA和gDNA分别具有SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2中所示的核苷酸序列。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.3中所示。所述基因的启动子序列具有SEQ？ID？NO.4中所示的核苷酸序列。该基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，茎中的表达量显著高于其他组织。低温胁迫下，其表达量在12h达到最大值，为未处理的2.34倍。构建茄子SmF3H的过表达载体并将其转入拟南芥中，发现其茎和果荚中的花青素含量都得到了显著提高。本发明为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。

Description

茄子黄烷酮3-羟化酶SmF3H及其基因和应用
技术领域
本发明涉及茄子花青素合成途径中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种茄子黄烷酮3-羟化酶基因SmF3H，属于生物技术领域。
背景技术
人体内由于新陈代谢活动不可避免的会产生大量自由基，花青素作为一种强还原性物质，能够清除人体内的自由基，延缓机体衰老。花青素的合成途径是类黄酮合成途径的一部分，也是目前研究的非常广泛而深入的植物次生代谢途径，其在主要模式植物如拟南芥、矮牵牛中已被详细阐述。花青素的生物合成主要分为三个阶段：第一阶段由苯丙氨酸到香豆酰CoA，这是许多次生代谢共有的步骤；第二阶段由香豆酰CoA到二氢黄酮醇，这是类黄酮代谢的关键步骤，它合成花青素和其他黄酮物质的前体；第三阶段是各类花青素的合成。
F3H催化黄烷酮在C3位置羟化形成无色的黄烷酮醇，是类黄酮物质代谢途径上的关键酶。有研究表明，该基因在大多数物种中多以单拷贝形式存在。F3H基因的表达受光的诱导，持续光照后表达量会增加。将香石竹F3H基因反义抑制，导致原来的橙红色变淡甚至无色。
目前已从一些植物中克隆得到F3H基因，如荔枝、草莓、葡萄等。茄子是重要的蔬菜作物，且其果皮富含花青素。但因为缺少基因组相关信息，导致茄子花青素相关研究比较滞后。目前，未有任何与茄子F3H基因的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的在于填补茄子F3H基因的空白，提供了一种茄子F3H的cDNA以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子SmF3H基因在不同组织器官及低温下的表达模式。本发明提供了茄子SmF3H基因的亚细胞定位。本发明提供了SmCHI基因的启动子序列及其元件分析。本发明还提供了SmF3H转入拟南芥后花青素的含量得到了提高的结果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种茄子黄烷酮3-羟化酶蛋白，包括SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种编码所述茄子黄烷酮3-羟化酶蛋白的基因，所述基因的gDNA包括如SEQIDNO.2所示的碱基序列；
所述基因的cDNA序列包括：
(a)如SEQIDNO.1第1～1101位所示的碱基序列；或
(b)与SEQIDNO.1第1～1101位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列；或
(c)能与SEQIDNO.1第1～1101位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
优选地，所述cDNA序列包括SEQIDNO.1第1～1101位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸。
第三方面，本发明提供一种用于扩增所述茄子黄烷酮3-羟化酶蛋白的基因的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示。
第四方面，本发明提供了一种所述茄子黄烷酮3-羟化酶基因的启动子，所述启动子包括SEQIDNO.4中所示的碱基序列。
第五方面，本发明提供一种用于克隆所述启动子的特异性引物序列，所述引物序列如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示。
第六方面，本发明提供一种所述茄子黄烷酮3-羟化酶基因在提高植物花青素中的应用。
优选地，所述植物包括拟南芥。
在本发明中，术语“SmF3H蛋白编码序列”指编码具有茄子SmF3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示的第1～1101位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.1所示的第1～1101位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.1所示的第1～1101位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmF3H相同功能的蛋白的SEQIDNO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。
在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmF3H基因产物的表达模式，即分析茄子SmF3H基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，根据本发明的茄子SmF3H核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmF3H相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与茄子SmF3H相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对茄子SmF3H相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,PaloAlto,Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmF3H相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的茄子SmF3H相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
茄子是广泛种植的蔬菜作物，紫色茄子的果皮含有丰富的花青素。近年来的研究结果表明，紫色茄子的抗氧化保健作用在常见蔬菜作物中是最好的。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、将SmF3H基因在拟南芥中过量表达，拟南芥茎的花青素含量提高了6.59倍，果荚的花青素含量从没有到21.57mg/100gFW；
2、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，克隆得到茄子查尔酮异构酶基因SmF3Hx，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的茄子F3H基因与马铃薯F3H基因mRNA的同源比较(GAP)结果；
图2为本发明的茄子F3H蛋白与马铃薯F3H蛋白的氨基酸序列同源比较(FASTA)结果；
其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；
图3为本发明的茄子F3H基因的亚细胞定位；
图4为本发明的茄子F3H基因在不同组织的表达情况；
图5为本发明的茄子F3H基因在低温下不同处理时间的表达情况；
图6为转F3H基因拟南芥花青素积累情况；
其中，CK为对照，oe为过表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、茄子SmF3H基因的克隆
1.植物材料的获得
本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。蓝山禾线茄表型为紫茎、紫花、紫果。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子的果皮用于提取RNA和DNA。
2.RNA和DNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(ThermoScientificNANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。
采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
3.基因的全长克隆
基于Genbank中F3H基因的保守序列设计一对简并引物。将提取RNA进行反转录(PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物
F1(SEQIDNO.5)：5′-ATGGCACCTTCAACACTAACAKCTCT-3′
R1(SEQIDNO.6)：5′-TYAAGCAAGAATTTCCTCAATGGGC-3′
进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，得cDNA序列SEQIDNO.1。
根据测序结果设计一对引物
F2(SEQIDNO.7)：5′-ATGGCACCTTCAACACTAACATCTCTG-3′
R2(SEQIDNO.8)：5′-TTAAGCAAGAATTTCCTCAATGGGC-3′
以DNA为模板，扩增SmF3H的genomicDNA全长，扩增得到产物后回收并连接到pMD-19T载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，得genomicDNA序列SEQIDNO.2。
实施例2、茄子F3H基因的序列信息与同源性分析
本发明新的茄子F3H基因全长CDS开放读框序列为1101bp，详细序列见SEQIDNO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子F3H的氨基酸序列，共366个氨基酸残基，分子量为41077.9道尔顿，理论等电点(pI)为5.38，详细序列见SEQIDNO.3所示序列。SmF3H的基因组DNA包含3个外显子和2个内含子，详细序列见SEQIDNO.2所示序列。
将茄子F3H的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与马铃薯F3H基因(NM_001288001.1)在核苷酸水平上具有88.57％一致性，如图1所示(Query：茄子F3H的mRNA序列；Sbjct：马铃薯F3H的mRNA序列)；在氨基酸水平上，它们两者之间相似性为89.81％，如图2所示(Query：茄子F3H的氨基酸序列；Sbjct：马铃薯F3H的氨基酸序列)。由此可见，茄子F3H基因与马铃薯F3H基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。
实施例3、茄子F3H基因的启动子克隆与序列分析
采用GenomeWalkingKit试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，设计引物
SP1(SEQIDNO.9)：5′-CCCAATCTTCACATGCCTTAACAATAT-3′
SP2(SEQIDNO.10)：5′-CCATTCAACGATATGACTGGAATCTC-3′
SP3(SEQIDNO.11)：5′-AGCCACTTTTGGACGCTCTTCTTCG-3′
以DNA为模板，进行三轮PCR扩增，扩增得到产物后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。测序结果发现得到茄子F3H基因启动子395bp。序列提交到PLACE和PlantCARE两个顺式元件在线预测软件进行分析，发现其含有光响应元件ATCT-motif，此外还含有茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif。详细序列见SEQIDNO.4所示序列。
实施例4、茄子F3H基因的亚细胞定位
(1)载体的构建
设计上下游引物
5′-GCCGCCATGGCACCTTCAACACTAACATCTCT-3′
5′-GGACTAGTAGCAAGAATTTCCTCAATGGGC-3′
进行扩增。植物表达载体Pcambia1302具有GFP蛋白，可用于亚细胞定位观察。用NcoI和SpeI分别对带有酶切位点的扩增产物和Pcambia1302进行双酶切，经T4DNALigase(宝生物工程(大连)有限公司)连接后转化大肠杆菌DH5α，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。将测序结果正确的菌液提取质粒，转化农杆菌GV3101，经PCR验证后保存于-80℃冰箱，即成功构建SmF3H-1302载体。
(2)烟草的种植
将本式烟草种子撒入基质中，25℃全日照。生长约一周后单株转入盆中。约半个月后选取生长旺盛的叶片进行瞬时转化。
(3)瞬时转化
挑取SmF3H-1302载体的农杆菌单菌落，接种于10mlYEP液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用一定体积的MS液体培养基悬浮菌体至OD600值为0.6左右。用1ml无菌针管吸取菌液注射于烟草叶片下表面，做好标记后放于黑暗中12h，再移置于光下，于2天后采用激光共聚焦显微镜(Leica)观察，发现SmF3H在细胞质和细胞核上表达(图3)。
实施例5、茄子F3H基因在不同组织中的表达差异和在低温下的表达模式
1.植物材料的获得
在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。
将位于人工气候培养箱中同期播种且长势一致的茄子幼苗置于4℃，分别在0h、1h、3h、6h、12h、24h和48h取处理材料的叶片，用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。
2.RNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。
3.cDNA的获得
以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKitPerfectRealTime试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。
4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中和低温下的表达量。根据已经获得的茄子F3H基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-timePCR中SmF3H基因定量分析的特异性引物，
F3H-F：5′-GTGGTCCAAGACTGGCGTGAAAT-3′
F3H-R：5′-TTCTCTAACCCCATTGCTTCTGATA-3′
内参基因为Actin(GU984779.1)，其引物为
ACTIN-F：5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′
ACTIN-R：5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′
5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASYDilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-timePCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。
6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-timePCR反应在FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。
7.采用2-△△Ct法作相对定量分析。结果表明SmF3H基因在茄子的根、茎、叶、花、果皮、果肉中都有表达，其中在茎中的表达量最高，其次是叶和果皮，而在根中的表达量最低，说明SmF3H基因的表达具有明显的空间差异性(图4)。在低温胁迫下，SmF3H基因的表达量随着胁迫时间的延长不断上升，在12h达到最大值，为未处理的2.34倍，表明其受到低温的诱导而表达(图5)。
实施例6、茄子F3H基因转拟南芥的功能验证
所用转化载体为上述用于亚细胞定位的载体SmF3H-1302，拟南芥材料为Col0。将含有SmF3H-1302的农杆菌培养至OD0.8～2.0，6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用MS液重悬，调整OD600为0.8～1.2，侵染拟南芥花序10～60sec，暗培养12h后正常培养，收集成熟的种子。
收集的T0代转基因种子，铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，4℃春化3d，光照培养箱培养6-10d，选取根长的长，且长出真叶的健壮幼苗，移栽至土盆，培养。收集的T1代种子继续铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，选取抗性：不抗比为3:1的株系收集T2代种子。T2代在50mg/L潮霉素抗性平板上存活率为100％的认为筛选到纯和抗性植株。对获得的株系采用Real-timePCR检测SmF3H表达量，所用拟南芥actin(NM_179953)引物如下：
5′-GTCTGGATTGGAGGGTC-3′
5′-TGAGAAATGGTCGGAAA-3′
选择表达量最高的独立的三个株系用于检测花青素含量。结果显示，转SmF3H拟南芥茎的花青素含量比野生型提高了6.59倍，野生型果荚没有花青素，而转基因植株的果荚花青素含量为21.57mg/100gFW(图6)。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种茄子黄烷酮3-羟化酶蛋白，其特征在于，所述蛋白包括SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述茄子黄烷酮3-羟化酶蛋白的基因，其特征在于，所述基因的gDNA序列包括如SEQIDNO.2所示的碱基序列。
3.一种用于扩增权利要求2所述茄子黄烷酮3-羟化酶蛋白的基因的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示。
4.一种权利要求2所述茄子黄烷酮3-羟化酶基因的启动子，其特征在于，所述启动子包括SEQIDNO.4中所示的碱基序列。
5.一种用于克隆权利要求4所述启动子的特异性引物序列，其特征在于，所述引物序列如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示。
6.一种权利要求2所述茄子黄烷酮3-羟化酶基因在提高植物花青素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。
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