CN109280670A

CN109280670A - 调控脂肪酸合成基因并促进豆科植物菌根共生的方法

Info

Publication number: CN109280670A
Application number: CN201710600445.7A
Authority: CN
Inventors: 王二涛; 姜伊娜; 王万晓; 张晓伟; 王大鹏
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2019-01-29

Abstract

本发明涉及调控脂肪酸合成基因并促进豆科植物菌根共生的方法。本发明首次揭示了脂肪酸合成酶基因在菌根共生过程中的作用，基于这些基因的功能和基因工程技术可以提高豆科植物菌根定植的数目。

Description

调控脂肪酸合成基因并促进豆科植物菌根共生的方法

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及调控脂肪酸合成基因并促进豆科植物菌根共生的方法。

背景技术

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)是植物与球囊菌门真菌(Glomeromycota)的丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)之间形成的一种古老而普遍的共生体系，包含了80-90％的陆生植物的共生。在菌根共生过程中，寄主植物通过菌根真菌广泛分布于土壤中的菌丝提高了对水分和无机营养的吸收，如磷酸盐和氮，从而达到降低植物化肥用量，减少水土污染，维持生态系统平衡的目标。作为回报，植物通过光合作用固定的碳水化合物最多达到20％会被转移到共生的菌根真菌中，以维持其自身细胞物质的合成，为代谢过程提供能量，从而促进孢子萌发和菌丝生长。所以，研究植物与菌根真菌共生过程中营养代谢机理具有重大的理论和实践意义。

目前普遍认同的碳在丛枝菌根共生体中流动和代谢的基本模型是：宿主植物的光和产物以己糖(Hexose)的形式输送到真菌的内生菌丝中，在内生菌丝中经过一系列的代谢途径，最终合成糖原(Glycogen)和脂类(Lipid)。两者可以沿着菌丝由内生菌丝(Intraradicular mycelia，IRM)向外生菌丝(Extraradicular mycelia，ERM)运输，并在外生菌丝中分解释放能量来满足真菌的生长和发育。

值得注意的是，在菌根真菌中含有大量的脂类，以三酰甘油(Triacylglycerol，TAG)的形式作为最主要的碳元素流通方式。它的含量可以占到孢子干重的70％，在菌丝体中可以以脂质体(Lipid body)的形式进行转运。已有的研究证实，菌根真菌的外生菌丝并不能进行脂肪酸(Fatty acid，FA)的从头合成。然而，由于内生菌丝无法从寄主植物的根内细胞上分离，所以它是否具有脂肪酸合成的代谢能力难以确定。所以目前的观点虽然认为菌根真菌中的脂肪酸确实是在共生过程中由宿主植物诱导并在IRM中进行合成的，但从同位素标记的研究结果仍然缺乏直接的证据。

随着高通量测序技术的发展，菌根真菌Rhizophagus irregularis已经获得了大量有价值的基因组和转录组数据，其中包括覆盖率达到98％的全基因组测序、孢子的单核基因组测序(菌根真菌孢子为多细胞核结构)及孢子与外生菌丝的转录组测序。在真菌中，脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FAS)是由“I型”(FASI)和“II型”(FASI)两大亚基形成的一个蛋白复合物。然而，对R.irregularis所有的基因组序列信息重新分析后发现，其中并没有负责真菌长链脂肪酸(n≤16)合成的I型脂肪酸合成酶的同源基因。有趣的是，在R.irregularis基因组中却发现了参与甘油代谢途径、脂肪酸链延长(n＞16)和脂肪酸降解的酶，这些酶足以使该代谢途径正常运转。然而，在这些代谢途径中棕榈酸(16:0)是必要的底物，表明菌根真菌能利用脂肪酸作为营养并支持真菌生长。如果R.irregularis确实是FA合成缺陷型，那么真菌必然需要从它的宿主中获得脂质形式的碳源。这将推翻目前的模型中，真菌获得碳源的重要形式为糖。

根据目前豆科模式植物苜蓿M.truncatula基因表达图谱的结果(http://mtgea.noble.org/v3/index.php)，几乎所有的M.truncatula脂肪酸合成途径相关酶编码的基因，包括：丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，MtPK)、丙二酰基CoA-ACP转酰酶(MalonylCoA-ACP transacylase，MtMCAT)、酮脂酰-ACP合成酶I(Ketoacyl-ACP synthase I，MtKASI)、酮脂酰-ACP还原酶(Ketoacyl-ACP reductase，MtKAR)、烯酰-ACP还原酶I(Enoyl-ACPreductase I，MtENR I)、羟烷基-ACP脱水酶(Hydroxyacyl-ACP dehydratase，MtHAD)和酰基-ACP硫酯酶B(Acyl-ACP thioesterase B，MtFatM)，接种菌根真菌R.irregularis后，在含有丛枝结构的皮层细胞中表达量明显上调。前期研究认为这种脂肪酸合成的上调是共生过程中为了形成大量的丛枝膜前体(Peri-arbuscular membrane)用于后期营养交换所必需的。

因此，本领域需要对脂肪酸合成酶基因在菌根共生中的作用进行深入研究研究，以使得借助基因工程技术来提高菌根共生效率成为可能。

发明内容

本发明的目的在于提供调控脂肪酸合成基因并提高豆科植物菌根定植效率的方法，促进菌根共生。

在本发明的第一方面，提供一种调节豆科植物的菌根共生的方法，所述方法包括：调节豆科植物中脂肪酸合成酶的表达；所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶(Pyruvatekinase，MtPK)、酮脂酰-ACP合成酶II(Ketoacyl-ACP synthase II，MtKAS II)、酮脂酰-ACP还原酶(Ketoacyl-ACP reductase，MtKAR)、烯酰-ACP还原酶I(Enoyl-ACP reductase I，MtENR I)和酰基-ACP硫酯酶B(Acyl-ACP thioesterase B，MtFatM)。

在一个优选例中，所述的脂肪酸合成酶是MtPK,MtKAS II,MtKAR,MtENR I,MtFatM。

在另一优选例中，所述方法包括：上调植物中脂肪酸合成酶的表达，从而促进植物的菌根共生。

在另一优选例中，所述上调植物中脂肪酸合成酶的表达包括：将脂肪酸合成酶的编码序列转入植物细胞、组织或器官，从而上调脂肪酸合成酶的表达。

在另一优选例中，所述的组织或器官包括：根系；较佳地，所述的根系包括：自然根系与毛状根。

在另一优选例中，利用根基因本身表达启动子进行表达。更佳地，利用含有MtFatM基因5’上游序列的启动子或其活性片段作为启动子。

在另一优选例中，所述的菌是真菌，更具体地为菌根真菌，包括但不限于：Rhizophagus irregular，Glomus liquidambaris，Acaulospora delicate。

在另一优选例中，所述方法包括：下调植物中脂肪酸合成酶的表达，从而降低豆科植物的菌根共生。

在另一优选例中，通过RNAi方法下调植物中脂肪酸合成酶的表达。

在另一优选例中，所述的植物是豆科植物。

在另一优选例中，所述的豆科植物包括：苜蓿、百脉根、大豆、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、蚕豆、豇豆、紫云英、甘草或黄芪。

在另一优选例中，所述的脂肪酸合成酶是PK，其是(a)由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上(较佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的脂肪酸合成酶是KASII，其是(a)由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上(较佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的脂肪酸合成酶是KAR，其是(a)由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上(较佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的脂肪酸合成酶是FatM，其是(a)由SEQ ID NO:4所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上(较佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种脂肪酸合成酶或其编码基因用途，用于促进豆科植物的菌根共生；所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，MtPK)、酮脂酰-ACP合成酶II(Ketoacyl-ACP synthase II，MtKAS II)、酮脂酰-ACP还原酶(Ketoacyl-ACP reductase，MtKAR)和酰基-ACP硫酯酶B(Acyl-ACP thioesterase B，MtFatM)。

在一个优选例中，所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，MtPK)、酮脂酰-ACP合成酶II(Ketoacyl-ACP synthase II，MtKAS II)、酮脂酰-ACP还原酶(Ketoacyl-ACP reductase，MtKAR)和酰基-ACP硫酯酶B(Acyl-ACP thioesterase B，MtFatM)；更佳地，所述的脂肪酸合成酶是FatM。

在本发明的另一方面，提供一种脂肪酸合成酶或其编码基因用途，用于作为鉴定豆科植物的菌根共生的分子标记；所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶(Pyruvatekinase，MtPK)、酮脂酰-ACP合成酶II(Ketoacyl-ACP synthase II，MtKAS II)、酮脂酰-ACP还原酶(Ketoacyl-ACP reductase，MtKAR)和酰基-ACP硫酯酶B(Acyl-ACP thioesteraseB，MtFatM)。

在一个优选例中，若经检测豆科植物组织中脂肪酸合成酶表达高于一个特定值，则相对而言，所述豆科植物菌根定植效率高或菌根共生能力强；若经检测豆科植物组织中脂肪酸合成酶表达低于一个特定值，则相对而言，所述豆科植物的菌根定植效率低或菌根共生能力弱。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指豆科植物中相应脂肪酸合成酶表达量的平均值。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、脂肪酸合成酶基因在菌根共生过程中的表达量。

(A)脂肪酸合成酶基因(MtPK，MtKAS II，MtKAR，MtENR I，and MtFatM)在菌根真菌R.irregularis侵染后14，21，28，35及42天(dpi)的基因表达量分析。(B)不同时间点的菌根侵染效率。

图2、fatm突变体的遗传鉴定。

(A)模型显示Tnt1在基因上插入的位置；(B)通过PCR对NF7660进行基因分型鉴定显示1号和3号为纯合突变体；(C)QRT–PCR表达量分析(1为野生型，2、3为纯合突变体)。

图3、脂肪酸合成酶基因FatM在菌根共生过程中的作用。

(A)野生型(R108)，突变体fatm，ram2及fatm/FatM(fatm互补植株)在菌根真菌R.irregularis侵染后42天的菌根侵染效率。(B)R108，fatm及fatm/FatM根在菌根真菌侵染后42天的WGA-AF488染色结果。(C)明场与(D)GFP荧光下，受到R.irregularis侵染的根Promotor：GUS在cortical arbuscular细胞中的表达。arbuscule(a)。Bar＝50μm。

图4、过表达脂肪酸合成酶基因显著增加菌根真菌定植数目。

MtPK，MtKAS II，MtKAR及MtFatM基因过表达转化根中基因的表达量(A)与菌根侵染效率(B)。误差线代表标准误。差异显著性用t-test检测。**表示差异极显著(p<0.01)。三次重复实验均表现一致的结果。

图5、RNAi脂肪酸合成酶基因显著降低菌根真菌定植数目。

MtPK，MtKAS II及MtFatM基因RNAi转化根中基因的表达量(A)与菌根侵染效率(B)。误差线代表标准误。差异显著性用t-test检测。**表示差异极显著(p<0.01)，*表示差异显著(p<0.05)，ns表示差异不显著(p≥0.05)。三次重复实验均表现一致的结果。

具体实施方式

本发明人利用反向遗传学法鉴定到了脂肪酸合成酶，它们是：PK，KASII，KAR，FatM，基于这些酶的功能和基因工程技术可以改造豆科植物(如苜蓿)的真菌定植的效率，促进菌根共生。因此，可以将所述的脂肪酸合成酶应用于植物的培育中，选育出改良的植物新品种。

豆科植物与菌根真菌间菌根共生对环境和作物产量来说都非常重要。目前本领域对豆科植物菌根共生的分子机理的了解还很有限，如共生因子信号途径中各信号分子的作用机理，宿主植物是如何调控丛枝器官的发育等。本发明明确了植物脂肪酸合成酶基因在菌根真菌共生过程中的作用，为提高豆科植物的菌根定植效率提供了重要的理论依据和实验基础。

如本文所用，所述的“植物(作物)”是指具有菌根共生能力的植物。例如，所述的豆科植物选自：百脉根，苜蓿、大豆、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、蚕豆、豇豆、紫云英、甘草或黄芪。

如本文所用，所述的“菌”是真菌，更具体地菌根真菌，包括但不限于：Rhizophagusirregular，Glomus liquidambaris，Acaulospora delicate。

如本文所用，所述的“脂肪酸合成酶”包括：PK，KASII，KAR，FatM，ERN。在本发明中，术语“脂肪酸合成酶”指具有脂肪酸合成酶活性的由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列编码的蛋白。该术语还包括具有与脂肪酸合成酶相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

本发明所述的脂肪酸合成酶还包括脂肪酸合成酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的脂肪酸合成酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述的脂肪酸合成酶的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，脂肪酸合成酶的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的脂肪酸合成酶的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长脂肪酸合成酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长的脂肪酸合成酶的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

编码脂肪酸合成酶或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟脂肪酸合成酶的编码区序列可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。

术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

应理解，虽然本发明的脂肪酸合成酶基因优选获自豆科植物苜蓿，但是获自其它植物的与该脂肪酸合成酶基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或脂肪酸合成酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含脂肪酸合成酶编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

基于本发明人的新发现，本发明提供了所述的脂肪酸合成酶或其编码基因的用途，用于调节(包括上调或下调)豆科植物菌根定植效率，调节豆科植物的菌根共生。在一种方式下，上调豆科植物中脂肪酸合成酶的表达，从而提高豆科植物的菌根定植效率，促进豆科植物与菌根真菌之间的菌根共生。在另一种方式下，下调豆科植物中脂肪酸合成酶的表达，从而降低豆科植物对菌根真菌的碳源供给，抑制豆科植物与菌根真菌之间的菌根共生。因此，可基于脂肪酸合成酶对于植物性状的影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。

本发明还涉及脂肪酸合成酶或其编码基因的上调剂或下调剂(如反义的脂肪酸合成酶基因或如miRNA)及其用途。由于脂肪酸合成酶或其编码基因的上调剂或下调剂可调节脂肪酸合成酶或其编码基因的表达和/或活性等，因此，所述的脂肪酸合成酶或其编码基因的上调剂或下调剂也可通过对脂肪酸合成酶或其编码基因的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。

任何可调节脂肪酸合成酶的活性、调节脂肪酸合成酶的稳定性、促进或抑制脂肪酸合成酶的表达、延长或减少脂肪酸合成酶有效作用时间、或促进或降低脂肪酸合成酶基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节豆科植物的菌根定植效率，调节豆科植物与菌根真菌之间的菌根共生的有效物质。

在得知了所述的脂肪酸合成酶的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的脂肪酸合成酶的表达。比如可通过一定的途径将携带脂肪酸合成酶编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的脂肪酸合成酶。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低脂肪酸合成酶的表达或使之缺失表达，比如将携带反义脂肪酸合成酶基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达脂肪酸合成酶；或将脂肪酸合成酶基因进行敲除。

作为本发明的一种实施方式，将脂肪酸合成酶的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述脂肪酸合成酶的植物细胞中，使所述的植物细胞表达脂肪酸合成酶。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达脂肪酸合成酶的植物。优选的，利用农杆菌转化法将脂肪酸合成酶的编码基因转入植物中。

通常，脂肪酸合成酶的编码基因位于表达载体中启动子的下游，也即启动子的3’端下游连接该编码基因的5’端。所述的编码基因是可操作性地连接到表达载体上的。所述的“操作性连接”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加脂肪酸合成酶基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强脂肪酸合成酶基因的表达。或者通过增强子来增强该脂肪酸合成酶基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

本发明还涉及利用脂肪酸合成酶或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用脂肪酸合成酶或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中本发明所述的任一种或几种脂肪酸合成酶的表达情况，早期预测豆科植物与菌根真菌之间的菌根共生情况。

在本发明的具体实施例中，本发明人将野生型A17苜蓿分别种在含有或未含有菌根真菌的沙：珍珠岩＝1:1的穴盘中，在菌根侵染与非侵染对照组的不同时期(14、21、28、35、42天)，分析基因的表达变化并统计菌根的侵染效率。结果表明，随着不同时间点菌根侵染效率的提高(图1B)，苜蓿脂肪酸合成途径相关酶编码的基因MtPK，MtKAS II，MtKAR，MtERN I与MtFatM的表达量受到强烈的诱导(图1A)。验证了在菌根共生过程中，苜蓿脂肪酸合成途径相关酶编码的基因确实起到了重要作用，为本发明提供了理论支持。

并且，本发明人筛选到MtFatM的Tnt1突变体fatm(NF7660)，通过对其菌根共生表型与启动子表型分析(图2，3)，明确了MtFatM在苜蓿菌根真菌共生过程中的作用。

并且，本发明人利用基因工程技术，将MtPK，MtKAS II，MtKAR与MtFatM基因通过过表达或RNAi技术构建植物表达载体，然后将该表达载体通过发根农杆菌介导的苜蓿毛状根转化的方法，在野生型A17中获得相应基因的过表达或RNAi转化根材料。在菌根侵染6周后，分析基因的表达变化并统计菌根的侵染效率。结果发现，随着基因表达量的上升或下调(图4A，5A)，菌根侵染量也随之增加或减少(图4B，5B)。

本发明明确了植物脂肪酸合成酶基因在菌根真菌共生过程中的作用，为提高豆科植物的菌根定植效率提供了重要的理论依据和实验基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料和方法

1.实验材料

1.1植物材料

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)：生态型A17、R108与突变体ram2-1(获自上海植物生理生态研究所)，突变体fatm(NF7660)(筛选自Samuel Roberts Noble FoundationTnt1population)。苜蓿种子经砂纸充分打磨(看到种子表明有白色印迹)后，用10％(v/v)次氯酸钠表面消毒2～3min，无菌水冲洗5次，均匀种在1％琼脂平板上。培养皿用封口膜封口，于4℃冰箱黑暗处理2～4天后移至22℃、16h光照培养箱。

1.2菌株和载体

大肠杆菌菌株：DH5α、Ccdb3.1(购自Invitrogen)；

农杆菌菌株：Arqua1(购自Invitrogen)；

基因克隆载体：pENTR/SD/D-Topo(购自Invitrogen)；

转基因构建载体：

pK7WG2R(购自Invitrogen)；

pK7GWIWGIIR(购自Invitrogen)；

pBGWFS7(购自Invitrogen)。

2.实验方法

2.1.重组质粒的构建

以蒺藜苜蓿A17cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD-FX(购自Toyobo)，克隆MtPK(XM_003592110，1,731bp)，MtKAS II(XM_003608444，1,413bp)，MtKAR(XM_003601772，963bp)，MtFatM(XM_013614657，1,137bp)的cDNA序列，通过重组反应连接至入门载体pENTR/SD/D-Topo，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并测序验证。正确的构建体与pK7WG2R载体进行LR(购自Invitrogen)重组反应，获得的重组质粒分别称为：pK7WG2R-MtPK，pK7WG2R-MtKAS II，pK7WG2R-MtKAR，pK7WG2R-MtFatM，用于苜蓿毛根转化的基因过表达验证。

以蒺藜苜蓿A17cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD-FX，克隆MtPK(567bp，SEQID NO:1中第504～1070位)，MtKAS II(508bp，SEQ ID NO:2中第347～854位)，MtFatM(343bp，SEQ ID NO:4中第223～565位)的RNAi目标序列，通过重组反应连接至入门载体pENTR/SD/D-Topo，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并测序验证。正确的构建与pK7GWIWGIIR载体进行LR重组反应，获得的重组质粒分别称为：pK7GWIWGIIR-MtPK，pK7GWIWGIIR-MtKASII，pK7GWIWGIIR-MtFatM，用于苜蓿毛根转化的基因RNAi验证。

以蒺藜苜蓿A17总gDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD-FX，克隆MtFatM基因5’上游1,293bp的片段(SEQ ID NO:6)通过重组反应连接至入门载体pENTR/SD/D-Topo，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并测序验证。正确的构建与pBGWFS7载体进行LR重组反应，获得的重组质粒分别称为：pMtFatM-pBGWFS7用于苜蓿毛根转化的基因启动子验证。

通过HindIII，SpeI酶切及Klenow酶补平自连，将pK7WG2R载体上的35S启动子去除，获得质粒pK7WG2Rδ35S。以蒺藜苜蓿A17总gDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD-FX，克隆一条长度为3.7kb的片段，包含MtFatM基因5’上游1,293bp的片段(SEQ ID NO:6)和2.4kbgDNA(SEQ ID NO:5)。通过重组反应连接至入门载体pENTR/SD/D-Topo，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并测序验证。正确的构建与pK7WG2Rδ35S载体进行LR重组反应，获得的重组质粒分别称为：pK7WG2Rδ35S-pMtFatM:MtFatM用于苜蓿毛根转化的突变体互补验证。

引物序列如表1。

表1

2.2.植物遗传转化及筛选

苜蓿毛根转化：将蒺藜苜蓿A17种子用砂纸充分打磨(看到种子表明有白色印迹)和表面消毒后，种在1％琼脂平板上萌发。同时，将构建好的质粒pK7WG2R-MtPK，pK7WG2R-MtKAS II，pK7WG2R-MtKAR，pK7WG2R-MtFatM，pK7GWIWGIIR-MtPK，pK7GWIWGIIR-MtKAS II，pK7GWIWGIIR-MtFatM，pMtFatM-pBGWFS7，pK7WG2Rδ35S-pMtFatM:MtFatM用电击转化法转入Arqual农杆菌菌株，28℃培养2天。挑取单菌落接种到5ml含有相应抗生素的TY培养基中，28℃振荡培养过夜。第二天按1：50比例将农杆菌接种于100ml含有相应抗生素的TY培养基中，振荡培养10-16h，至OD600＝0.6～0.8。4000rpm离心收集菌体后，用5ml无抗TY培养基重悬菌体备用。取出萌发12～18h的苜蓿幼苗，切掉根尖3～5mm后，浸没在上述重悬的菌液中。依次将浸泡后的幼苗转入FP培养基中，22℃竖直、光照培养。7天后，将胚根附近长出的根完全切掉，再将幼苗依次转入Mod FP培养基中。22℃竖直、光照培养3～4周。

本实验所用培养基：

1)FP培养基：

母液：

CaCl₂·2H₂O：40.0g/L；

MgSO₄·7H₂O：40.0g/L；

KH₂PO₄：30.0g/L

Na₂HPO₄·12H₂O：45.0g/l L；

FeC₆H₅O₇：2.5g/L。

Gibson’s Trace：

H₃BO₃：2.86g/L；

MnSO₄·4H₂O：2.03g/L；

ZnSO₄·7H₂O：220mg/L；

CuSO₄·5H₂O：80mg/L；

H₂MoO₄：80mg/L。

用上述母液配制FP培养基(1L)：

CaCl₂·2H₂O：2.5mL；

MgSO₄·7H₂O：3.0mL；

KH₂PO₄：3.33mL；

Na₂HPO₄·12H₂O：3.33mL；

FeC₆H₅O₇：2.0mL；

Gibson’s Trace：1.0mL；

Agar 8-10g(根据实验需要加入)；

ddH₂O：加至1L

用NaOH调整pH至6.3-6.7。

2)Mod FP培养基

母液I：

CaCl₂·2H₂O：132.3g/L；

MgSO₄·7H₂O：123.2g/L；

KH₂PO₄：95.3g/L；

Na₂HPO₄：113.6g/L；

FeC₆H₅O₇：4.9g/L；

NH₄NO₃：40g/L。

母液II：

MnCl₂·4H₂O：100mg/L；

CuSO₄·5H₂O：100mg/L；

ZnCl₂：100mg/L；

H₃BO₄：100mg/L；

Na₂MoO₄·2H₂O：100mg/L。

用上述母液配制Mod FP培养基(1L)：

母液I：1mL；

母液II：1mL；

Agar：8g(根据实验需要加入)；

ddH₂O：加至1L；

用NaOH调整pH至6.0-6.3。

2.3.数据分析平台与软件

序列BLAST分析：NCBI在线分析平台，Medicago truncatula Gene ExpressionAtlas(MtGEA)Project。

RNAi目标片段设计：RNAi Target Sequence Selector(Clontech)。

引物设计：Primer3Plus在线分析平台。

定量PCR数据分析：LinRegPCR软件，qBaseplus软件

2.4.苜蓿根总RNA提取

为保障RNA提取质量，本实验所用枪头、离心管、试剂一律为RNase-free。

1)取约100mg植物材料，置于2mL离心管中；

2)在液氮中将植物材料充分研磨成粉末状，然后加入1mL Trizol试剂和20μLβ-巯基乙醇，立即涡旋混匀；

3)4℃、12000rpm离心15min，将上清转移至洁净的1.5mL离心管中；

4)加入200μL氯仿，剧烈混匀15sec，12000rpm离心10min；

5)小心地吸取300μL上层溶液至1.5mL RNase-free离心管中，再加入150μL氯仿，剧烈混匀15sec，12000rpm离心10min；

6)小心地吸取250μL上层溶液至1.5mL RNase-free离心管中，再加入625μL无水乙醇，剧烈混匀15sec，-20℃静置沉降30min；

7)4℃、12000rpm离心10min；

8)弃上清，加入500μL 75％乙醇，重悬沉淀，12000rpm离心10min；

9)弃上清，待沉淀完全干燥后，加入20-25μL RNase-free水溶解沉淀；

10)在RNase-free离心管中配制以下反应液：

Total RNA:20-25μL

10x DNase I buffer：5μL

Recombinant DNase I：2μL

RNase inhibitor：1μL

RNase-free H₂O：加至50μL

11)37℃反应30min；

12)向反应液中加入450μL RNase-free H2O定容至500μL后，加入等体积水酚/氯仿，涡旋混匀；

13)4℃、12000rpm离心5min；

14)将上清转移至RNase-free离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体积的冷异丙醇，涡旋混匀，-20℃沉降30-60min；

15)4℃、12000rpm离心5min；

16)弃上清，加入1mL 75％乙醇重悬沉淀；

17)4℃、12000rpm离心5min；

18)弃上清，待沉淀完全干燥后，加入20μL RNase-free水溶解沉淀；

19)取2μL RNA进行电泳或用分光光度法检测其质量和浓度；

20)将质量好的RNA分装，置于-80℃保存或者直接进行后续实验。

2.5.反转录及定量PCR

1)在RNase-free PCR管中配制以下反应液：

RNA：1μg；

Oligo(dT)12-18primer(50μM)：1μL；

RNase free H2O：加至6μL；

2)70℃保温10min后立即冰上急冷10min；

3)在上述反应液中加入以下转录反应液：

5x M-MLV Buffer：4μL；

dNTP mixture：4μL；

RNase Inhibitor：0.5μL；

RTase M-MLV(RNase H-)：1μL；

RNase free H2O：加至20μL；

4)42℃反应1h；

5)70℃反应15min后，取0.5μL cDNA作为模板，用跨内含子的引物，检测cDNA中是否存在gDNA污染。

6)将cDNA按5μL/管分装在PCR管中，保存于-80℃冰箱备用。

定量PCR引物序列如表2。

表2

II.实施例

实施例1、苜蓿脂肪酸合成途径基因的表达模式分析

将野生型A17苜蓿分别种在含有或未含有菌根真菌的沙：珍珠岩＝1:1的穴盘中，接种菌根真菌R.irregularis进行侵染。在菌根侵染与非侵染对照组的不同时期(14、21、28、35、42天)，提取苜蓿根的样品总RNA，通过RT-PCR验证基因的表达变化。同时，通过墨水染色在显微镜下观察并统计菌根的侵染效率。

结果表明，随着不同时间点菌根侵染效率的提高(图1A)，苜蓿脂肪酸合成途径相关酶编码的基因MtPK，MtKAS II，MtKAR，MtERN I与MtFatM的表达量受到强烈的诱导(图1B)。

上述结果说明，在菌根共生过程中，苜蓿脂肪酸合成途径相关酶编码的基因起到了重要作用。

实施例2、fatm突变体的菌根共生水平分析

通过Samuel Roberts Noble Foundation Tnt1population，本发明人筛选到MtFatM的Tnt1突变体fatm(NF7660)，该基因在第5个外显子处由于Tnt1转座子插入导致基因无法正常转录翻译(图2A，2B)。定量PCR分析显示，fatm突变体纯和株系中MtFatM的表达量显著下调(图2C)。

为了确认fatm突变体菌根共生水平，本发明人将植株R108，ram2，fatm突变体幼苗和fatm突变体互补材料fatm/FATM同时接种R.irregularis，并于接种6周后分别统计菌根共生水平。如图3A和3B所示，ram2及fatm突变体均一致表现出菌根共生水平显著低于R108植株的表型，fatm突变体互补材料fatm/FATM(在突变体中转入了pK7WG2Rδ35S-pMtFatM:MtFatM载体)表现出菌根共生水平的恢复。

为了确认MtFatM在苜蓿菌根真菌共生过程中的作用，本发明人克隆获得了长度为1,293bp的基因5’上游片段，并通过苜蓿毛状根转化获得MtFatM启动子表达的材料。本发明人将MtFatM启动子表达的材料接种R.irregularis，通过GUS染色与WGA染色。结果发现，MtFatM启动子在菌根侵染的部位特异表达。

以上实验表明，MtFatM在苜蓿菌根真菌共生过程中起到重要作用。

实施例3、苜蓿脂肪酸合成途径基因的过表达对菌根共生的影响

克隆MtPK，MtKAS II，MtKAR，MtFatM的cDNA序列并构建植物表达载体pK7WG2R-MtPK、pK7WG2R-MtKAS II、pK7WG2R-MtKAR、pK7WG2R-MtFatM，然后将该表达载体通过发根农杆菌介导的苜蓿毛状根转化的方法，在野生型A17中获得相应基因的过表达转化根材料。在R.irregularis菌根侵染6周后，通过RT-PCR验证基因的表达变化。同时，通过墨水染色在显微镜下观察并统计菌根侵染的效率。

结果发现，随着基因表达量的上升(图4A)，菌根侵染量也随之增加(图4B)。以上结果表明，通过基因工程手段提高脂肪酸合成途径基因的表达量，可以提高苜蓿菌根定植的效率。

实施例4、苜蓿脂肪酸合成途径基因的RNAi对菌根共生的影响

克隆MtPK(567bp)，MtKAS II(508bp)，MtFatM(343bp)的RNAi目标序列并构建植物表达载体pK7GWIWGIIR-MtPK、pK7GWIWGIIR-MtKAS II、pK7GWIWGIIR-MtFatM，然后将该表达载体通过发根农杆菌介导的苜蓿毛状根转化的方法，在野生型A17中获得相应基因的RNAi转化根材料。在菌根侵染6周后，通过RT-PCR验证基因的表达变化。同时，通过墨水染色在显微镜下观察并统计菌根侵染的效率(包括Internal hyphae数目及丛枝(Arbuscules)发育情况)。

结果发现，随着基因表达量的下调(图5A)，菌根侵染量也随之减少(图5B)，特别是Arbuscules发育情况严重受损。

以上结果表明，脂肪酸合成途径在菌根共生过程中，特别是Arbuscules发育过程中确实起到了重要的作用，通过基因工程手段调控脂肪酸合成途径基因的表达量，可以改变苜蓿菌根定植的效率。

小结

1、苜蓿脂肪酸合成途径基因在菌根共生过程中受到诱导

本发明人在菌根侵染与非侵染对照组的不同时期，分析苜蓿脂肪酸合成途径相关酶基因的表达变化。结果表明，随着不同时间点菌根侵染效率的提高(图1B)，苜蓿脂肪酸合成途径相关酶编码的基因MtPK，MtKAS II，MtKAR，MtERN I与MtFatM的表达量受到强烈的诱导。验证了在菌根共生过程中，苜蓿脂肪酸合成途径相关酶编码的基因确实起到了重要作用。

2、MtFatM在苜蓿菌根真菌共生过程中起到重要作用

本发明人筛选到MtFatM的Tnt1突变体fatm(NF7660)，其菌根共生水平显著降低且MtFatM启动子在菌根侵染的部位特异表达，表明了MtFatM在苜蓿菌根真菌共生过程中的重要作用。

3、苜蓿脂肪酸合成途径基因的调控可以影响菌根共生的效率

本发明人利用基因工程技术，将MtPK，MtKAS II，MtKAR与MtFatM基因通过过表达或RNAi技术，在野生型A17中获得相应基因的过表达或RNAi转化根材料。在菌根侵染6周后，随着基因表达量的上升或下调，菌根侵染量也随之增加或减少。结果表明，通过基因工程手段调控脂肪酸合成途径基因的表达量，可以改变苜蓿菌根定植的效率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调控脂肪酸合成基因并促进豆科植物菌根共生的方法

<130> 173641

<160> 37

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1731

<212> DNA

<213> 苜蓿

<400> 1

atgtctcagg ttcgatccat tcaaacctcc ttctcacgcc ccacttcagg atctacacat 60

gacaggtctc aaaccttgtt aaagcctcca tctttttcct ccaaaatctt cccacctaag 120

tctaacaatc cccccaagct ttgcttcaca acctccccca tcaatgcaag aaagtcctca 180

tctgctgaag ttgtccctgt ctcacccgaa gacgattcaa agattgaaga ggagttgcag 240

aagttacacg ttttgcaaca agttggtaat gtttctggtg gaatctggtc taagccaatg 300

attaaaagaa agactaacat tgtttgtact attggtcctt ctactaatac aaaggaaatg 360

atttggaaac ttgctgaggc tggaatgaat gttgctcgta tgaatatgtc tcatggtgat 420

catgcttctc ataagaaagt tattgatttg gtgaaagagt ataatgcaca atctaaagat 480

aatgttattg caatcatgct tgacaccaag ggtcctgagg ttaggagtgg ggatttacca 540

caaccaatca tgttaaaaac tggccaggaa ttcactttta ctatccagag cggtgttgga 600

actgctgatt gtgtcagcgt gaactatgat gattttgtca acgatgttga agaaggggac 660

atgcttcttg ttgatggtgg tatgatgtcg ttcttggtta agtccaagac agcggattcc 720

gtgaaatgcg aagttattga tggaggagag ctcgcgtcac ggaggcattt gaatgttaga 780

ggaaaaagtg caacactgcc ttcaatcact gaaaaggatt gggatgacat caaatttgga 840

gtcgataatg aagttgattt ctatgccgtt tctttcgtta aggatgcaca agtagttcat 900

gagctgaaga attatttgaa aagctgtggt gctgatatac atgtaattgt aaaaattgaa 960

agtgcagact ctataccgaa cttgcattca attattactg catctgatgg ggctatggtt 1020

gcaagaggag atcttggtgc agaactccct attgaggagg ttccgctttt gcaggaagag 1080

ataataagga tatgccgtag catgggaaag gccgttattg tagccacaaa tatgctggaa 1140

agtatgattg ttcaccccac gccaaccaga gcagaggtat ctgatattgc aattgctgtt 1200

cgagaaggtt ccgatggaat aatgctttct ggagaaactg cacatggaaa gtttccaatt 1260

aaagctgcga aagtaatgca caccgtagca ttacggacag aagccgcttt accaaatggg 1320

cagatgccac ctaatattgg ccaagtattc aagaaccaca tgagcgagat gtttgcatac 1380

catgcaacca tgatgtccaa tacccttgga acatcaactg ttgtcttcac tagatcgggt 1440

ttcatggcta ttctattgag ccattatcga cctgcaggca ccatatttgc ttttactgat 1500

cagaaaaggg tacaacagag gttggctttg tatcaaggtg tctgtcctat ttacatggaa 1560

ttctctgatg atgctgaaga gacattcaca aaagccttgg atttgttgca gaagaatgga 1620

atggttaaag aaggagaaga agtagccctt gtacaaagtg gaaggcaacc tatatggagg 1680

ttccattcca ctcacaatat tcaggtccga acagtagctg ccacaaatta a 1731

<210> 2

<211> 1413

<212> DNA

<213> 苜蓿

<400> 2

atgcaatcac ttcagcatca actacccttc actcttcgcc cttcaccact cgaaccactt 60

cgcaaaaaac cctccaatgc ggccaccacc gccgccagaa ccccaaagag actctccgtc 120

gtctcttcct ccgtcaccac cgccgctcct caaagagaga aggatcccaa gaagcgtgtc 180

gtgatcactg gcatgggtgg cgtcactgta catggcaacg atgtcgacat tttctacgaa 240

aagcttctcg ccggtgatag tgggatcaca ttgattgata ggtttgatgc ttccaaattc 300

cctactcggt tcgctggtca gatccgtggg tttagctccg agggttacat cgacgggaag 360

aatgaccgga ggcaggatga ttgtctccgg tactgcaatg tcgccgggaa gaaagcactt 420

gaagatgctg gtctcggtgc cgaaaatctt gataagattg ataaagaacg tgctggtgtt 480

ttggttgggt caggaatggg tggtttaacg gtgttttctg atggagttaa gaatctgatt 540

gaaaagggac atagaaagat atcacctttt tttattccct atgctattac caatatggct 600

tcagctttac ttgggattga tttaggtttc agaggtccaa attattctat ttcaactgct 660

tgtgctactt caaattattg ctttgttgct gctgccaatc acattcgtag gggtgaagct 720

gatttgatga ttgcgggtgg tactgaagct gctattattc ctattggttt ggggggtttt 780

gttgcttgca gggcactttc tcagagaaat gatgacccta aaacggcttc taggccttgg 840

gataaagacc gtgatggatt tgttatgggt gaaggtgctg gagttttggt gatggaaagc 900

ctggaacatg ccatgaagcg aggtgcgcct atcattgctg aatacttggg aggtgctgta 960

aactgtgatg cttatcatat gactgatcca agatctgatg ggcttggcgt gtcttcatgc 1020

atccagagca gtcttgtaga tgccggtgtg tcacccgagg aggtcaatta cataaatgca 1080

catgcaactt ccactcttgt tggtgacttg gcagagatca atgctatcaa aaaggttttc 1140

aagaacccat ctggcatcaa aattaatgcc accaagtcta tgatagggca ctgccttggc 1200

gcagctgggg gtttggaagc tattgccaca ataaaagcca taacaacagg atggctgcat 1260

ccatcaatca atcaattcaa tccagaacct gcagttgatt ttgatacggt ggcaaatgtc 1320

aagcagcagc atgaaatcaa tgttggcatt tcaaattcat ttggatttgg tggacacaac 1380

tctgtcgtgg ctttttccgc tttcagaccc tga 1413

<210> 3

<211> 963

<212> DNA

<213> 苜蓿

<400> 3

atggcttctc ttaccggatc caattgcgtc gctctccgtt ccgccacttt cgccgccacc 60

ggtaaccgta aaatcactca gatccgccat tactctccac ttctcaatca tccccgtctg 120

gtttccggtc ttcactctag atccaacact tcgtttaact ccaccggttt gagagcacag 180

gttgctacac tggcggaagc gtcaaccgaa gcagttcaga aagtggaatc gccggttgtg 240

attgttaccg gagcttccag aggtattgga aaagcaattg cgttagcgtt aggtaaagca 300

ggttgcaagg ttttggtcaa ctatgcaaga tcatccaagg aagctgaaga ggtttccaag 360

gagattgagg cactcggtgg gcaagctcta acatatggtg gagatgtttc taatgaagct 420

gatgtgaact ctatgattaa aactgcagta gatgcttggg gaaccattga tgtattgata 480

aacaatgccg gaataaccag agatggttta ttgatgagaa tgaagaagtc tcagtggcag 540

gaggttattg atctaaatct cactggtgtt tttctttcca cacaggcagc tgctaagatt 600

atgatgaaga ataaaaaggg aaggataatc aacatttcat cagttgttgg tttgattggc 660

aatgctggac aagccaatta tgctgctgca aaagcaggag taattggcct gacaaaatct 720

gttgcaaagg aatattctag cagaggcatc actgttaatg ctgttgctcc aggattcatt 780

gcatctgaca tgactgccaa gttaggaaat gaccttgaga aaaagatttt ggaggcaatt 840

ccattaggac ggtatggcca accagaagaa gttgctggac tagtggaatt cttggcgctt 900

agtcaagctg ccagttacat cactggacag gttttcacca ttgatggagg tatggtgatg 960

taa 963

<210> 4

<211> 1137

<212> DNA

<213> 苜蓿

<400> 4

atggctgtta ctaattttac atgttcagct tcttcctttc ttgtaaggtg ttgctctatg 60

aaagataacc atcatgacca attgaacagt aacaacagca ttagaatgaa tggaagttat 120

aggtctccga ttaaagttga atctcttagt caaacagctg aagctgcacc tacaactctt 180

gttgaaaatg gtctgcgcca aaacataccg acaaagaaac aattggttga tcctcatcgt 240

caaggtctca ttgttgaagg tggtgttggt tatagacaaa ctgttgttat taggtcttat 300

gaagaaacag cattaaacca tgtatggatg tctggactac tcagtgatgg atttggagca 360

acacatggaa tgatgaggaa tgatctcatt tgggttgtat caagaatgca agttctcatt 420

gattattatc ccatttgggg agaggtactt gaaattgaca catgggttgg agcatcggga 480

aagaatggta tgcgacgaga ctggctcata aggagtcaag ccacgggcca tatttttgct 540

cgtgcaacaa gcacatgggt gatgatgaac agcaaaacaa gacgcctctc caaaatgcca 600

gaagaggtga gggatgaact tacaccttgg tttattgaga agcaagcaat aaaagaagat 660

gctcccgaaa aaatcatcaa attaaacaaa gaagcaaaat acatgaattc caatttgaag 720

cccaagagaa gtgatttgga catgaaccaa catgttaaca atgtaaagta tctaaggtgg 780

atgctagaga ccattccaga ccaaattcta gagagtcacc aattatctgg tatcacacta 840

gaatatagaa gggaatgtgg aagttcagat atagttcaat cactatgtga acctgaagaa 900

gatgaaatag ttcttaatgg tatggttgaa ccagattact gcacaaatct gcttaatgga 960

ttgtcttttg taaaatcaga tattataaat ggtggtggag ttttgagcta ccttgagcaa 1020

aggccaataa ggtatacaca tcttttacaa gcaaagggag aaaaacaaaa tgaagaaatt 1080

gttagaggaa agactacatg gaagaggaaa ttcactacat gtccattttc tacatag 1137

<210> 5

<211> 2367

<212> DNA

<213> 苜蓿

<400> 5

atggctgtta ctaattttac atgttcagct tcttcctttc ttgtaaggtg ttgctctatg 60

aaagataacc atcatgacca attgaacagt aacaacagca ttagaatgaa tggaagttat 120

aggtctccga ttaaagttga atctcttagt caaacagctg aagctgcacc tacaactctt 180

gttgaaaatg gtctgcgcca aaacataccg acaaagaaac aattggttga tcctcatcgt 240

caaggtctca ttgttgaagg tggtgttggt tatagacaaa ctgttgttat taggtcttat 300

gaagttggtc ctgataaaac tgctacactt gagagcatcc tcaatcttct acaggcaaat 360

cgatctttat tattacactt ttctaattga attcaatttt atatgcattg taattgtaat 420

caaattttac acatgcatcg agtcacttct cagttctcac agcttcgata acattttttg 480

cgctgatata caaagttaaa ttttttctat tatctaaatt tttttaattt cgtgcaggaa 540

acagcattaa accatgtatg gatgtctgga ctactcagtg atggatttgg agcaacacat 600

ggaatgatga ggaatgatct catttgggtt gtatcaagaa tgcaagttct cattgattat 660

tatcccattt ggtaagaccc tcttttttag aattatttat tatacataga cacaaattta 720

tgtccattag tcctcttgtt ggaagacaga attgaatttg ataactttca tgccatcctt 780

tgacaaaaaa tgtactattt cttagggttc tcctaggaat tttctccata ttaatcaaga 840

tcttttgtcc tatacctttt tggtggcaga caactatctc ttttaaattt aaatatagat 900

atgtgttgtc aaaaatatac attgcataga gtttcactaa aacattccat attttaatcc 960

atcatgggcc atggcaatcc caaatcatag ccagaacaga ataccttgtt gtacataacc 1020

attggaaatt tactgaagat tcaaaaccaa ttttaatgaa ttaaccgaag ttttattttt 1080

actaccatct accaagtatc ataatttatc atggcataaa taacataata acaagtacag 1140

acttaacatg tgacagggga gaggtacttg aaattgacac atgggttgga gcatcgggaa 1200

agaatggtat gcgacgagac tggctcataa ggagtcaagc cacgggccat atttttgctc 1260

gtgcaacaag gtattgtata catatataat acctatgtcc ctttttataa gcaccttttt 1320

gttctcgcaa aaatgtactt gcaaaaaagg acagaggtaa tactagtcta gcacaatttc 1380

gcaaacattc tttaaaccct tttcataagt attttgactg atattgacac ataaaacagc 1440

acatgggtga tgatgaacag caaaacaaga cgcctctcca aaatgccaga agaggtgagg 1500

gatgaactta caccttggtt tattgagaag caagcaataa aagaagatgc tcccgaaaaa 1560

atcatcaaat taaacaaaga agcaaaatac atgaattcca atttgaaggt atgccatcat 1620

tttaatcgcg gtcataccgc aatccttaac attgcgaata acaacggtca aatgcagatt 1680

gatgtcgagg ttgcaaaaaa ataaaataaa aaccttaatg tcgcagcctt gattgtgctc 1740

gaaaacattt tttaaaaccc tgcattatat tttaattgaa cgcttccacg acacaatatt 1800

tacgaataat gattttgtgt cactgtccat tttgcagccc aagagaagtg atttggacat 1860

gaaccaacat gttaacaatg taaagtatct aaggtggatg ctagaggtaa attcaaaaca 1920

atattaatat actcattatc attcttcaat atttatacca ttattagaat ataatcaaat 1980

agttaacttt catttttttt attattgatt attttacaga ccattccaga ccaaattcta 2040

gagagtcacc aattatctgg tatcacacta gaatatagaa gggaatgtgg aagttcagat 2100

atagttcaat cactatgtga acctgaagaa gatgaaatag ttcttaatgg tatggttgaa 2160

ccagattact gcacaaatct gcttaatgga ttgtcttttg taaaatcaga tattataaat 2220

ggtggtggag ttttgagcta ccttgagcaa aggccaataa ggtatacaca tcttttacaa 2280

gcaaagggag aaaaacaaaa tgaagaaatt gttagaggaa agactacatg gaagaggaaa 2340

ttcactacat gtccattttc tacatag 2367

<210> 6

<211> 1293

<212> DNA

<213> 苜蓿

<400> 6

agaccacaac tgtttgctgc ctcacattgg tcgacacttt tccttgatta ccaaagttaa 60

tatatatgga atgaatatga ttccaaattt tgataagatc aacttgtttg tgaactgtaa 120

tttgtttagt caacactttt ccttgattat aaattcataa ttgatgtacg tcagtacgtg 180

tatatgttca tactctcgtg tattgccaag ttatgccatc aaaattattt agctagatac 240

ctcttaattg tttttacttg cacacgcatg aggtgtatat cagtatatgt agtttttttt 300

tttttcttct agaaaattta aaatcagtcc aatccaaacc aatataaatt tgattacatt 360

ggaaaggatt tgacttaaaa tcgaactgac tgtacaacca aagaactaag tcaaatatat 420

tggatcgaag ttcaaatgat atataccaat tcaatcttca caaatatccc tactttagaa 480

taaatattgt gttttgattc tgaaggggaa tacatacaat catctttcat gttactttca 540

atccttagtt aacggtgtga tctatgaact ttattaaaat attacaagta tttagtttga 600

cggttgggta tataaataat ttgacatttt atcttttaac ccatttattg gaatctaaag 660

gatatagaaa gctaacggag acaagaaacg agattcatag acccaatcga agaagtcacc 720

taaaacaaca ctctgcatac caataagcac aaaaatgaaa tgtgtctttt actaatagaa 780

aaaaccaagg agacgttaat tcggttggtg cataaccatg ataatgtata tgtctctccg 840

cagctttcta atcaaccata acaatacgta ataagcataa tgaatgtagc tggaagagga 900

caaggtttat gatgtcaagt tagtagagca gctagtgttc aaagagaatt cctattttat 960

gtctatattt cactaaaaca caaaatttcc ctgacacaaa ctaaatagtt gcttttgtcc 1020

cactctagct aatcgatcag ttcaaggtta tgcattgatt tcctttctca atttggacag 1080

ctacttccac aagcatcaaa aaccatgcaa tccctctttg atttgtcagc taaatcacaa 1140

ggttcacatc tttgtctctc attcttttta agtcctcctt tgttcattcc gtccaaactt 1200

taaactataa ataacaagtt tcatttccaa cctcactccc cttccatatc ctttggagag 1260

tgaaagtgaa aaaataaaaa aaggaacaga aca 1293

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

atgtctcagg ttcgatccat tcaaac 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 8

ttaatttgtg gcagctactg ttcgg 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 9

atgcaatcac ttcagcatca actac 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 10

tcagggtctg aaagcggaaa aagcc 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 11

atggcttctc ttaccggatc c 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 12

ttacatcacc atacctccat caatg 25

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 13

atggctgtta ctaattttac atgttca 27

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 14

ctatgtagaa aatggacatg tagtga 26

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 15

caccaagggt cctgaggtta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 16

aaaagcggaa cctcctcaat 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 17

acatcgacgg gaagaatgac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 18

tcacggtctt tatcccaagg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 19

ttggttgatc ctcatcgtca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 20

tcatcaccca tgtgcttgtt 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物

<400> 21

agaccacaac tgtttgctgc ctc 23

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 22

ctatgtagaa aatggacatg tagt 24

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物

<400> 23

agaccacaac tgtttgctgc ctc 23

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 24

tgttctgttc ctttttttat tttttca 27

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 25

tcttgttaat taccgtatct cggtgctaca 30

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 26

atgattttgt gtcactgtcc 20

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物

<400> 27

ctatgtagaa aatggacat 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 28

caccaagggt cctgaggtta 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 29

acttcgcatt tcacggaatc 20

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 30

gggataaaga ccgtgatgga t 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 31

acacaccggc atctacaaga c 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 32

tccaaggaga ttgaggcact 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 33

cctcctgcca ctgagacttc 20

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 34

gtattacctg atggttcgtt aatgg 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 35

aagagagtgg acaaggatgt ctatg 25

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 36

ttgagcaaag gccaataagg t 21

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 37

ctatgtagaa aatggacatg tagtga 26

Claims

1.一种调节豆科植物的菌根共生的方法，其特征在于，所述方法包括：调节豆科植物中脂肪酸合成酶的表达；所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶、酮脂酰-ACP合成酶II、酮脂酰-ACP还原酶、烯酰-ACP还原酶I和酰基-ACP硫酯酶B。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸合成酶是MtPK，MtKAS II，MtKAR，MtENR I，MtFatM。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：上调植物中脂肪酸合成酶的表达，从而促进植物的菌根共生。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述上调植物中脂肪酸合成酶的表达包括：将脂肪酸合成酶的编码序列转入植物细胞、组织或器官，从而上调脂肪酸合成酶的表达。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：下调植物中脂肪酸合成酶的表达，从而降低豆科植物的菌根共生。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过RNAi方法下调植物中脂肪酸合成酶的表达。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是豆科植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的豆科植物包括：苜蓿、百脉根、大豆、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、蚕豆、豇豆、紫云英、甘草或黄芪。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸合成酶是PK，其是(a)由SEQ IDNO:1所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸合成酶是KASII，其是(a)由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸合成酶是KAR，其是(a)由SEQID NO:3所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸合成酶是FatM，其是(a)由SEQID NO:4所示核苷酸序列编码的多肽；(b)将(a)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

13.一种脂肪酸合成酶或其编码基因用途，用于促进豆科植物的菌根共生；所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶、酮脂酰-ACP合成酶II、酮脂酰-ACP还原酶和酰基-ACP硫酯酶B。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶、酮脂酰-ACP合成酶II、酮脂酰-ACP还原酶和酰基-ACP硫酯酶B；更佳地，所述的脂肪酸合成酶是FatM。

15.一种脂肪酸合成酶或其编码基因用途，用于作为鉴定豆科植物的菌根共生的分子标记；所述的脂肪酸合成酶选自：丙酮酸激酶、酮脂酰-ACP合成酶II、酮脂酰-ACP还原酶和酰基-ACP硫酯酶B。