CN105037515B - 狗牙根‘C299’脱水素蛋白Dehydrin-L及其编码基因和探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种狗牙根‘C299’脱水素蛋白Dehydrin‑L及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有狗牙根‘C299’脱水素蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针；本发明为利用基因工程技术调控狗牙根‘C299’抗旱等逆境胁迫生理响应，从而达到提高草坪草抗旱能力的目的，为分子育种提供了理论依据，具有很大的应用价值。

Description

狗牙根‘C299’脱水素蛋白Dehydrin-L及其编码基因和探针

技术领域

本发明狗牙根‘C299’干旱胁迫响应过程中的一种重要保护蛋白脱水素蛋白Dehydrin-L及其编码基因和探针，具体涉及一种狗牙根‘C299’脱水素蛋白Dehydrin-L及其编码基因和探针。

背景技术

狗牙根(Cynodon dactylon)是非常重要的暖季型草坪草，为禾本科多年生草本植物，具有发达的根茎和匍匐茎，生长速度快、再生能力强、成坪快、耐热、耐践踏、质地纤细、色泽好等优点，在国内外广泛用于运动场、游憩场、公园及固土护坡草坪等。因此是暖季型草坪草中应用价值最高、应用最广的草种之一，享有暖季型草坪草“当家草种”之称，极具社会、经济和生态价值。狗牙根的抗旱能力十分强，年蒸散量低于400mm，仅是玉米、小麦等农作物年需水量的四分之一左右，因此是建植节水草坪的优良材料。在狗牙根中，‘C299’属于观赏性最佳的品种之一，但是其抗旱性较其他品种稍弱，因此提高狗牙根‘C299’的耐旱性，对暖季型草坪草的应用性及观赏性具有非常重要的意义。

脱水素(dehydrin)属于LEA-Ⅱ家族，是植物体内的一种具有高度热稳定性、亲水性的LEA蛋白(late embryogensis abundant proteins)，能够在植物胚胎发育后期以及逆境下大量表达，广泛存在于植物界。它能在植物处于干旱等逆境条件下表达，其在逆境下表达的强弱与植物抗逆能力有密切联系，在抗性植株中的表达量要高于对逆境敏感的植株。由此显示，它与植物的抗旱有着密切的关系。我们根据异源克隆的方法从狗牙根‘C299’中用克隆获得相似的脱水素基因，Q-PCR结果证明，该基因在‘C299’中随着干旱程度的增大而表达量升高，证实该基因在‘C299’抗旱过程中起重要作用。

脱水素的编码基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、水稻、大麦、橡树、红海榄等。但对于草坪草植物脱水素的克隆、表达模式及蛋白序列尚不清楚。目前，未有任何与狗牙根‘C299’脱水素蛋白结构及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于填补狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因的克隆、表达模式分析以及狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的空白，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白及其核酸序列在狗牙根‘C299’干旱胁迫过程中的表达模式，为今后利用基因工程技术对Dehydrin-L基因表达的时空特性进行调控，从而为提高狗牙根抗干旱胁迫能力与育种工作提供了理论依据，具有很大的应用价值。

一方面，本发明提供了具有干旱胁迫响应功能及保护功能的狗牙根‘C299’脱水素Dehydrin-L蛋白，所述蛋白质是由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有狗牙根‘C299’脱水素Dehydrin-L蛋白特征的蛋白质。该蛋白质在不同干旱胁迫阶段过程中在细胞中的表达量存在较大差异。

优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：(a)碱基序列如SEQ ID NO.3第1～546位所示；或(b)与SEQ ID NO.3第1～546位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；或(c)能与SEQ IDNO.3第1～546位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～546位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。

此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因相关的核酸分子。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白编码序列”指编码具有狗牙根‘C299’脱水素Dehydrin-L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示的第1～546位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3所示的第1～546位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3所示的第1～546位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的相同功能、SEQ IDNO.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白”指具有狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白活性的SEQ ID NO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“狗牙根‘C299’Dehydrin-L保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg

Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白或多肽的类似物。这些类似物与狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因产物的表达模式，即分析狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

本发明检测样品中是否存在狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的狗牙根‘C299’Dehydrin-L核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选狗牙根‘C299’cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自狗牙根‘C299’的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的狗牙根‘C299’Dehydrin-L相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白相关发生相互作用的物质，或抑制剂与拮抗剂等。狗牙根‘C299’作为常用草坪草，应用极为广泛，其市场需求也很大。本发明首次克隆狗牙根‘C299’干旱胁迫过程中的重要响应蛋白及保护性蛋白Dehydrin-L的编码序列，并采用荧光实时定量PCR的方法分析Dehydrin-L基因的表达模式，为今后利用基因工程技术调控Dehydrin-L基因的时空表达，从而为提高草坪草抗旱性、新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因与无芒隐子草(Cleistogenessongorica)dehydrin基因mRNA的核苷酸序列的同源比较(GAP)结果；

图2为本发明的狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白与长穗偃麦草(Lophopyrumelongatum)dehydrin蛋白的氨基酸序列的同源比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；

图3为狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因在干旱胁迫过程中的表达量变化；

图4为以狗牙根‘C299’Dehydrin阳性单克隆菌斑PCR验证；

图5为野生型与狗牙根‘C299’Dehydrin-L转基因拟南芥在不同干旱胁迫时间的植株相对失水率；

图6为野生型与Dehydrin-L转基因拟南芥植株干旱胁迫表型观察；

图7为野生型与Dehydrin-L转基因拟南芥在干旱胁迫4天时的植株相对电导率值；

图8为野生型与Dehydrin-L转基因拟南芥在干旱胁迫4天时的植株Dehydrin基因表达定量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因的克隆

1.植物材料的获得

取狗牙根‘C299’叶片组织，用于提取RNA；

2.RNA的抽提

用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA(Trizol：Invitrogen)，用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度；

3.基因的全长克隆

根据狗牙根‘C299’干旱胁迫过程中建立抑制消减文库(SSH)的分离得到的EST序列及蛋白功能注释结果，获得狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因核心片段。采用RACE方法(SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit:Clonetech)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR获得基因中间片段

将提取的RNA进行反转录(Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物Dehydrin-L F(SEQ IDNO.1)和Dehydrin-L R(SEQ ID NO.2)进行PCR，扩增得到203bp片段，回收并连接到pMD18-TSimple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的无芒隐子草、长穗偃麦草、鸭茅(Bermudagrass)、龙爪稷的Dehydrin基因的同源性很高，初步认为它是一个Dehydrin基因；

(2)3′RACE

二轮巢式PCR完成3′末端序列的扩增。

第一轮：UPM+3’-GSP1(5′-GCGAACAGTCCGTGATAACTGTCTGTCA-3′)

第二轮：NUP+3’-GSP2(5′-TCGTGTAACATGATAAGATGGTCAGCCA-3′)

UPM和NUP为试剂盒提供。3′RACE得到狗牙根‘C299’Dehydrin-L的3′末端序列(217bp)，回收，连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的无芒隐子草与鸭茅Dehydrin基因的同源性很高；

(3)5′RACE

以5′RACE ready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5′末端序列的扩增，

第一轮：UPM+5’-GSP1(5′-ACCATCTTATCATGTTACACGAACGTCG-3′)

第二轮：NUP+5’-GSP2(5′-GAACGTCGTGACAGACAGTTATCACGGA-3′)

UPM和NUP为试剂盒提供。5′RACE得到狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因的5′末端序列(710bp)，回收连接后用同上面一样的方法进行测序，将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从狗牙根‘C299’中新得到的Dehydrin基因的确为一个脱水素蛋白相关的基因，将测序结果结合NCBI的ORF Finding(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)预测，发现了狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因的起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物ORF-F(5′-ATGGAGCACCAGGGACAGTACGGC-3′)，ORF-R(5′-TTAGTGCTGGCCGGGGAGCTTCTC-3′)，以狗牙根‘C299’cDNA为模板进行PCR，扩增得到546bp狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因的序列信息与同源性分析

本发明的狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因全长开放读码框序列为546bp，详细序列见SEQ ID NO.3所示序列。根据开放读码框序列推导出狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的氨基酸序列，共181个氨基酸残基，分子量为18.2kDa，等电点(pI)为8.78，详细序列见SEQ IDNO.4所示序列；

将狗牙根‘C299’Dehydrin-L的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与无芒隐子草Dehydrin基因(登录号：FJ972827.1)在核苷酸水平上具有77％的相同性，如图1所示(Query：狗牙根‘C299’Dehydrin-L的编码基因序列；Sbjct：无芒隐子草Dehydrin的mRNA序列)；在氨基酸水平上，它与长穗偃麦草Dehydrin基因(登录号：AAC05922.1)也有67％的一致性和69％的相似性，如图2所示(Query：狗牙根‘C299’Dehydrin-L蛋白的氨基酸序列；Sbjct：长穗偃麦草Dehydrin蛋白的氨基酸序列)。由此可见，狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因与其它已知物种的Dehydrin基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因在干旱胁迫不同阶段的表达差异性

1.材料的获得：对狗牙根‘C299’干旱胁迫不同阶段(0天,5天,10天)材料的叶片进行取样。将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用；

2.RNA的提取：利用RNA prep pure植物总RNA提取(Trizol：Invitrogen)；提取狗牙根‘C299’不同样品组织中的总RNA；

3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定：用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2；％0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性，电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示rRNA样品的降解；纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右，用分光光度计测定OD值并计算RNA含量；

4.cDNA的获得：以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用；

5.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中的表达量，根据已经获得的狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中Dehydrin-L基因定量分析的特异性引物，引物qDHN F(5′-CGGAGGAAGAAGGGAATC-3′)，引物qDHN R(5′-GTAGGTGCCAGTTCCGG-3′)，内参基因为核糖体18S基因，引物为18S-F(5′-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3′)，18S-R(5′-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3′)；

6.制作目的基因及内参基因的标准曲线：用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数；

7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析：以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo 4实时定量仪上进行，反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着40个循环：94℃15s；58℃15s；72℃25s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生；

8.采用2^-△△Ct法作相对定量分析，结果表明狗牙根‘C299’随着干旱胁迫程度的加重，其Dehydrin-L表达水平显著上升(图3)。干旱胁迫的第5天，第10天时，该基因的表达水平分别为对照植株的10.2与10.6倍，说明该基因与干旱胁迫响应显著相关，具有明显的时空差异性。

实施例4、狗牙根‘C299’Dehydrin-L基因转化模式植物拟南芥

(1)构建转化载体

分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物Dehydrin_OFR-S(5′-AAGGATCCATGGAGCACCAGGGACAGTA-3′)，Dehydrin_ORF-A(5′-AACTAGTGTGCTGGCCGGGGAGCTT-3′)并在基因全长序列两侧分别引入Bam HI与Spe I酶切位点，以狗牙根‘C299’cDNA为模板进行PCR。回收PCR产物并连接到pMD18-T Simple vector载体上，挑取单克隆菌斑进行PCR验证。狗牙根‘C299’Dehydrin基因家族存在2个成员(Dehydrin-L,Dehydrin-S)，550bp左右的较长片段为Dehydrin-L(图4，泳道1-3)，提取阳性克隆菌液质粒。将目的片段质粒与PHB双元转化载体进行BamHI与Spe I双酶切，回收酶切后的PHB载体与Dehydrin-L片段，应用T4连接酶在16℃水浴中将Dehydrin-L与PHB载体连接过夜构建转化载体，并将载体转化农杆菌GV3101。

(2)Dehydrin-L转化拟南芥

1.预摇农杆菌：挑阳性单克隆至25ml含50mg/L Kan、50mg/L庆大霉素、25mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇菌24h；

2.扩培农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1:100扩培至含400mL Kan抗性YEP培养基中，28℃，200rpm，培养13-16h，培养至吸光度OD₆₀₀达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件是23℃，5000rpm，8min；

3.转化植株：(需要在转化前一天或是转化当天剪去植株上所有的角果和盛开以及露白的小花)配制500mL含5％蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液将收集的农杆菌沉淀悬起，摇匀，向剩余的蔗糖溶液中加入0.04％(v/v)的Silwet L-77与10μL 6-BA(母液为1mg/mL)，搅匀，在转化前将二者混匀，将植株茎部及花序浸泡在菌液中50s，取出沥干菌液，放入一次性塑料袋中，密封保湿。将所有植株转化完毕后，罩上黑盒子，避光培养24h。之后取出植株，将植株直立放置，浇水培养，保证植株水分充足。

(3)转基因阳性株系的筛选

转化后的植株待角果全部成熟后收种子，在垫有滤纸的干燥培养皿中室温放置一周，使种子全部干燥，之后用50目的不锈钢筛过滤种子，除去角果，收集转基因T0代种子并播种于穴盘中，用0.05％(v/v)草甘膦进行幼苗抗性筛选，获得T1代转基因植株，持续筛选直至获得T3代纯合体转基因植株。

实施例5、拟南芥Dehydrin-L转基因植株干旱胁迫生理学研究

(1)拟南芥Dehydrin-L转基因植株失水率检测

剪切拟南芥野生型与Dehydrin-L转基因植株叶片0.5g,放置于铝盒内，在不同阶段(0-12h)称取叶片重量，计算不同植物失水率。随时间推移，Dehydrin-L转基因植株失水率明显低于对照植株约5-12％(图5)，说明Dehydrin-L基因在离体干旱条件下对植物具有更好的水分保持作用。

(2)拟南芥Dehydrin-L转基因植株干旱胁迫表型观察

将拟南芥野生型与Dehydrin-L转基因植株种植于气温22℃、光强6000勒克斯、光周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱中，同时进行干旱胁迫处理进行表型对比观察。干旱胁迫4天时，野生型与Dehydrin-L转基因拟南芥植株表型具有显著性差异；野生型植物叶片干枯萎蔫，花葶出现倒伏；Dehydrin-L转基因植株叶片萎蔫程度较小，花葶直立，植株生长情况也优于野生型拟南芥(图6)。说明Dehydrin-L转基因植物在干旱条件下具有更好的抗旱性。

(3)拟南芥Dehydrin-L转基因植株电导率检测

剪切拟南芥野生型与Dehydrin-L转基因植株干旱胁迫4天的叶片0.2g，收集于50ml离心管中，加入20ml去离子水，放置于摇床上24h，测定电导率初始值；放入高压灭菌锅中(121℃)处理15分钟，测定电导率最终值。用初值比终值计算得出样品相对电导率值。干旱胁迫4天后的野生型植物相对电导率值为87.7％，Dehydrin-L转基因植株的相对电导率值为79.5％，明显低于野生型植株(图7)。说明Dehydrin-L转基因植物在干旱胁迫条件下细胞受害程度低于野生型植株。

(3)干旱胁迫条件下野生型与转基因拟南芥植株Dehydrin-L基因表达差异

剪切拟南芥野生型与Dehydrin-L转基因植株干旱胁迫4天的叶片0.2g，按实施例3中方法提取RNA、制备cDNA并进行实时定量PCR分析。Real-time PCR中Dehydrin-L基因定量分析的特异性引物为qDHN F(5′-CGGAGGAAGAAGGGAATC-3′)，引物qDHN R(5′-TCTCCTTGATCTTGTCCAT-3′)，内参基因为拟南actin2基因，引物为act-F(5′-CTTGCACCAAGCAGCATGAA-3′)，act-R(5′-CCGATCCAGACACTGTACTTCCTT-3′)。采用2^-△△Ct法作相对定量分析，结果表明干旱胁迫4天后的转基因拟南芥中Dehydrin-L的表达量较高，是内参基因actin2的33.8倍，是野生型植物的288438倍(图8)。表明Dehydrin-L没有在野生型植株中表达。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (3)

1.一种由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸。

3.如权利要求2所述的核酸，其特征是，所述核酸序列具体为：

碱基序列如SEQ ID NO.3第1～546位所示。