CN110982925B - 白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因及应用 - Google Patents

白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因及应用。本发明经过严格的内参筛选程序，首次从6种候选内参基因中筛选出白掌不同发育时期佛焰苞中表达最稳定的两个内参基因EF1α和GAPDH，数据真实可靠。筛选出的内参基因适用于白掌不同发育时期佛焰苞中叶绿素代谢相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性。其应用较为普遍，操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高。

Description

白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因及应用。
背景技术
白掌是天南星科(Araceae)白鹤芋属(Spathiphyllum)植物，约有41个种，均为热带多年生草本，多种具有美丽且富有光泽的叶片，适宜观赏栽培。白掌原产于哥伦比亚，生长于热带雨林中，为欧洲最流行的室内观叶植物之一。佛焰苞是小盆栽白掌的主要观赏性状。白掌黄白色的肉穗花序外被洁白的佛焰苞片，佛焰苞背面还具有鲜绿色的脊脉，在深绿色的叶片衬托下，富有宁静、幽雅、清爽之感。像一片片白帆在绿色的海洋里飘荡，让人有顺风、顺利之感，人们因而给了它一个吉祥的名字“一帆风顺”。但花药成熟以后佛焰苞很快变绿，严重影响白掌的观赏品质。因此，弄清白掌佛焰苞变绿的机理，筛选关键的调控因子，利用转基因等技术调控佛焰苞变绿过程，选育佛焰苞不变绿的新品种可以大大增加白掌的市场竞争力。
在了解白掌佛焰苞生长规律分析及分期、叶绿素含量及荧光参数测定和叶绿体发育超微结构变化规律的基础上，明确了白掌佛焰苞变绿的关键时间节点。然后对白掌佛焰苞变绿前后的转录组差异基因进行分析，并对转录组结果的可靠性进行荧光定量PCR验证。
荧光实时定量PCR(qRT-PCR)由于其敏感性高及特异性好被广泛应用于基因表达研究，而其结果的准确性在很大程度上取决于内参基因的稳定性。理想的内参基因应该在不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官和不同胁迫条件下恒定表达，但事实上这样的理想内参基因很难存在。因此，需要根据不同物种及不同试验条件筛选合适的内参基因，这对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是筛选出白掌不同发育时期佛焰苞中表达最稳定的内参基因，能为白掌不同发育时期佛焰苞中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明首先提供了白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因，所述内参基因为EF1α和GAPDH；其中，
EF1α基因的特异性引物为：
EF1α-F：5’-GAAGAGCAATCACACCGCAC-3’
EF1α-R：5’-TTTGCTTTGCTCGTGTGTCG-3’
GAPDH基因的特异性引物为：
GAPDH-F：5’-CACTGTACGCCTGGAGAAGG-3’
GAPDH-R：5’-ATGCTCGACCTGCTATCACC-3’
优选地，所述白掌的品种为Spathiphyllum‘Parrish’。然而，本发明的内参基因不局限于白掌S.‘Parrish’品种，经研究发现，在白掌的其他品种中也适用，得到了相似的试验结果。
本发明的另一目的是提供白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明经过严格的内参筛选程序，首次从6种候选内参基因中筛选出白掌不同发育时期佛焰苞中表达最稳定的两个内参基因EF1α和GAPDH，数据真实可靠。筛选出的内参基因适用于白掌不同发育时期佛焰苞中叶绿素代谢相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性。其应用较为普遍，操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中6个候选内参基因在S.‘Parrish’不同时期佛焰苞中的Ct值。
图2为实施例1中geNorm软件分析内参基因表达稳定性。
图3为实施例1中geNorm软件分析最佳内参基因数目。
图4为实施例1中NormFinder分析内参基因表达的稳定值和排名。
图5为实施例2以GAPDH、EF1α和GAPDH+EF1α作为内参基因分析S.‘Parrish’不同时期佛焰苞中TRINITY_DN8766_c2_g2的表达量。
图6为实施例3以GAPDH、EF1α和GAPDH+EF1α作为内参基因分析RNA-seq差异表达基因与qRT-PCR验证结果
具体实施方式
本发明内参基因的具体筛选步骤为：
1.候选内参基因序列的获得：转录延伸因子的编码基因(EF1α)、α-tubulin(TUA)、β-tubulin(TUB)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、肌动蛋白(Actin)和Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)共6个内参基因作为内参基因的候选基因。
2.引物设计：根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物(扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，2％的琼脂糖胶检测条带单一)
3.PCR模板的准备：收集样品后，用RNA提取试剂盒(总RNA抽提试剂盒，B511321，生工生物)提取样品总RNA，然后用cDNA反转试剂盒(Maxima Reverse Transcriptase，EP0743，Thermo Scientific)按照说明书反转cDNA的第一链，作为荧光定量PCR的模板。
4.荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模版，用内参基因相应的特异引物在StepOne Plus型荧光定量PCR仪(ABI,Foster,CA,USA)中进行扩增。获得各个基因的表达数据Ct值。
5.根据所得Ct值采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper对6个候选内参基因在不同时期白掌苞片中表达稳定性进行统计学分析，根据统计结果筛选出本实验处理中最合适内参基因。最后根据geNorm软件计算的配对变异系数Vn/n+1来确定最佳内参基因数目。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细介绍。
实施例1
白掌不同发育时期佛焰苞中表达最稳定的内参基因的筛选，包括如下步骤：
1.实验材料取样：本实验选用的材料为白掌S.‘Parrish’，保存于联合培养单位广东省农业科学院环境园艺研究所观赏植物资源圃。分别取白掌佛焰苞刚展开至最大时期样品记为S3、白掌佛焰苞开始变绿时期样品记为S5和白掌佛焰苞完全变绿时期样品记为S7共3个时间节点取材，每个时间节点3个生物学重复，共9个样品。佛焰苞样品离体后速冻于液氮中，然后至于-80℃保存。
2.花序材料总RNA提取：采用总RNA抽提试剂盒(B511321，生工生物)按照说明书步骤提取佛焰苞样品总RNA。
3.cDNA的第一链的合成：
采用Maxima Reverse Transcriptase(EP0743，Thermo Scientific)按照说明书将步骤6获得的总RNA反转成cDNA，作为荧光定量PCR模板。
1)在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂：
Figure GDA0003785835390000041
2)轻轻混匀后离心3-5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3-5s；
3)将试管冰浴，再加入下列试剂：
Figure GDA0003785835390000042
4)轻轻混匀后离心3-5s；
5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应：25℃，10min；50℃，30min；85℃，5min；
6)将上述溶液-20℃保存。
4.以获得6个内参基因序列为基础，引物通过NCBI-blast设计，参数设计如下：扩增长度100-150个碱基对，引物序列长度18-25个碱基，GC含量45％-55％，TM值为(60±5)℃。实时荧光定量PCR特异引物序列如表1所示。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(PAGE纯化法)。
表1本发明中6个内参基因的基因名、引物序列、扩增长度、PCR扩增效率和回归系数
Figure GDA0003785835390000051
5.利用StepOne Plus型荧光定量PCR仪(ABI,Foster,CA,USA)进行qRT-PCR反应，采用20μL反应体系，其中2X SybrGreen qPCR Master Mix(Takara,Japan)10μL、ddH2O 7.2μL、10ng·μL-1cDNA 2μL、上游引物(10μM)和下游引物(10μM)分别为0.4μL。PCR过程为：第一步预变性：95℃3min；第二步扩增：95℃5s，60℃30s，45个循环。每个反应重复3次。
完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应。
通过观察ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪在PCR反应后生成的溶解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；实验得到定量Ct值(图1)用于后期内参基因稳定性分析。
分布图每个盒代表一个内参基因的一组处理，盒中的横线代表中位数，盒的上下分别代表上/下四分位，两端的盒须代表95％置信区间，“×”表示异常值。
利用3个软件分别评估6个候选内参基因在S.‘Parrish’不同时期佛焰苞中的表达稳定性。
1)GeNorm分析
geNorm算法是根据所有候选内参基因的成对变异值来计算各基因的表达稳定值M的，M值越大表明基因稳定性越差，只有M值小于1.5时，该候选内参基因才能做内参基因使用。
geNorm计算结果表明，6个候选内参基因的M值均小于1.5，表现出较高的稳定性。按照M值由高到低排列依次为：18S rRNA＞TUA＞EF1α＞GAPDH＞TUB＝Actin(图2)，表明TUB和Actin的稳定性最好，其次为GAPDH和EF1α。
为了得到准确可靠的qRT-PCR实验结果，有时需要2个或者多个内参基因。geNorm可以通过计算配对变异值(Pairwise Variation Value)来确定最适内参基因数目。当Vn/n+1＞0.15时，需要引入n+1个内参基因进行校正，若Vn/n+1＜0.15，则表明此时n个内参基因已满足准确校正目标基因表达量的需要，无需引入更多的内参基因。分析结果表明V2/3＜0.15(图3)，因此S.‘Parrish’不同时期佛焰苞中最适内参基因数目为2个。
2)NormFinder分析
NormFinder算法是基于方差分析对候选内参基因稳定性进行排序，并引入不同样品组间表达差异。与geNorm类似，候选内参基因的表达稳定值M越小，表达越稳定。结果表明，6个候选内参基因按照M值由高到低排列依次为：18S rRNA＞TUA＞TUB＞EF1α＞GAPDH＞Actin(图4)，表明Actin最稳定，其次为GAPDH和EF1α。
3)BestKeeper分析
BestKeeper软件是根据导入的Cp值计算获得候选内参基因在所有样品中Cp值的标准差(SD)，变异系数(CV)和基因间相关系数(r)等值，来评估候选内参基因的稳定性。SD值越小，表达越稳定。程序默认SD的临界值为1，当SD＞1时，表明该候选内参基因不适合作为内参基因使用。分析结果显示Actin、TUB和TUA的SD值均大于1，表明这3个基因不适合作为内参基因使用。18S rRNA的SD值最小，其次为EF1α和GAPDH(表2)。
综上所述3种软件分析结果，最适合作为内参基因的选择是EF1α和GAPDH。
表2 BestKeeper分析6个内参基因表达稳定性
Figure GDA0003785835390000071
注：CP：置信参数；Geo Mean：几何平均数；AM：算数平均数；Min：最小值；Max：最大值；SD：标准差。
综上所述3种软件分析结果，最适合作为内参基因的选择是EF1α和GAPDH。
实施例2EF1α和GAPDH应用案例
采用综合排名稳定的2个内参基因EF1α和GAPDH来校准不同发育时期的S.‘Parrish’苞片中TRINITY_DN8766_c2_g2的表达量。验证所筛选的内参基因的表达稳定性。
TRINITY_DN8766_c2_g2基因qRT-PCR扩增所用的上下游引物为：5-GTCCCCCTCTTGGTACTGCT-3和5-AGAGAGACTTCGGTCCACGA-3。
为了进一步验证筛选得到的内参基因的稳定性，选择其中稳定性最好的2个候选基因GAPDH和EF1α为内参基因，分析RNA-seq中筛选得到的上调表达基因Unigene TRINITY_DN8766_c2_g2在佛焰苞变绿过程中的表达模式(图5)。
分析结果表明，分别以GAPDH、EF1α和GAPDH+EF1α为内参基因进行校准时，UnigeneTRINITY_DN8766_c2_g2的相对表达量变化趋势基本一致，验证结果表明以GAPDH和EF1α作为内参基因的可靠性。
实施例3EF1α和GAPDH应用案例
为了进一步验证GAPDH和EF1α作为内参基因的具有可靠性(RNA-seq数据已上传至NCBI数据库SRA accession：PRJNA554701)。从RNA-seq差异显著表达基因中挑选9个与叶绿素合成相关的差异表达Unigene基因进行qRT-PCR验证。qRT-PCR为3次独立的生物学重复的结果。
用于验证的9个差异表达基因，图5中虚线左边为qRT-PCR结果，右边为RNA-seq结果，其中qRT-PCR结果为3次生物学重复的结果，每个生物学重复包含3次技术重复。S.‘Parrish’佛焰苞中EF1α、GAPDH和EF1α+GAPDH基因作为内参基因。Y轴表示GS与对照(WS)相比，相对表达量log2的值。
图6结果显示，所有挑选的Unigene的表达虽然在倍数上与RNA-seq结果有差异，但是表达趋势基本一致，说明GAPDH和EF1α作为内参基因的具有可靠性。
综上，本发明的白掌花序不同发育时期荧光定量内参基因EF1α和GAPDH基因是白掌不同发育时期佛焰苞中表达最稳定的两个内参基因，该两个基因表达的稳定性优于候选的另外4个内参基因，作为荧光定量内参基因能为白掌不同发育时期佛焰苞中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。
本发明的内参基因不局限于白掌S.‘Parrish’品种，经研究发现，在白掌的其他品种中也适用，得到了相似的试验结果，本发明在此不做赘述。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院环境园艺研究所
<120> 白掌佛焰苞不同发育时期荧光定量内参基因及应用
<130> 2015
<140> CN201911373252.8
<141> 2019-12-27
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaagagcaat cacaccgcac 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tttgctttgc tcgtgtgtcg 20
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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atgctcgacc tgctatcacc 20

Claims (1)

1.EF1α和GAPDH联合作为内参基因在白掌佛焰苞不同发育时期相对定量法实时荧光定量PCR中的应用，其特征在于，所述基因EF1α的上游特异性引物的核苷酸序列为：GAAGAGCAATCACACCGCAC，基因EF1α的下游特异性引物的核苷酸序列为：TTTGCTTTGCTCGTGTGTCG；所述GAPDH基因的上游特异性引物的核苷酸序列为：CACTGTACGCCTGGAGAAGG，GAPDH基因的下游特异性引物的核苷酸序列为：ATGCTCGACCTGCTATCACC。
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