CN103642821A - 蝴蝶兰PhEFP1基因、其编码的蛋白及其启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蝴蝶兰PhEFP1基因、该基因编码的蛋白质和引导该基因进行表达的启动子。本发明的蝴蝶兰PhEFP1基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所编码的蛋白质具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；引导该基因表达的启动子具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。本发明也提供了一种用于检测蝴蝶兰PhEFP1基因在蝴蝶兰不同组织和器官中的表达量方法，和用于该方法的DNA引物。启动子序列分析表明，蝴蝶兰PhEFP1基因的启动子序列存在多种启动子元件，包含花分生组织特异基因LEAFY和AGAMOUS响应元件、与花发育相关的MADS类AGL15响应元件，及与光调控、激素信号、抗病、抗逆境和生理节律等相关响应元件。启动子功能活性分析表明，该基因的启动子具有驱动GUS基因在烟草中表达的能力。

Description

蝴蝶兰PhEFP1基因、其编码的蛋白及其启动子

技术领域

本发明属于分子生物学中的基因领域，具体涉及在蝴蝶兰中与开花时间相关的PhEFP1（early flowering protein1）基因及其启动子、含有该基因或该基因的启动子的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的转基因植物转化体，以及PhEFP1基因在促进植物开花上的应用，还有应用Real-time PCR检测PhEFP1基因在蝴蝶兰植株不同部位中表达量的方法。 

背景技术

蝴蝶兰属兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）植物，其花色艳丽，色泽丰富，具极高观赏和经济价值。由于大部分蝴蝶兰品种的营养生长阶段比较长，为提高商品价值，须调节蝴蝶兰的花期，使其达到全年开花，特别是应中国传统节日春节开花。目前，生产上多采用低温处理来调节蝴蝶兰的花期，以应对消费者在不同时间的需求（Chen et al.,2008）。因此，研究低温诱导蝴蝶兰花芽分化和发育相关的分子机理一直是蝴蝶兰研究的热点领域之一，如将蝴蝶兰不同品种（P.aphrodite subsp.formosana，P.equestris和P.bellina）的不同组织，如花序、花芽、根、嫩叶、老叶、冷胁迫叶、病菌浸染叶、原球茎、低温诱导的花梗芽和盛开5天的花，混合后进行转录组测序，共获得8,233个contigs和34,630个singletons（Hsiao et al.，2011）。此外，将低温诱导的P.aphrodite subsp.formosana花芽进行了小RNA的测序，共获得11129条miRNA序列（An et al.，2011）。尽管这些转录组和smRNA数据在基因组学和生物技术方面提供了有益的信息，但是这些基因和smRNAs的全长和功能尚未阐明。 

为分离和鉴定低温诱导蝴蝶兰生殖转变的相关基因，本实验室以低温诱导的蝴蝶兰的花梗芽和处于营养生长阶段的顶叶为检测方和驱动方，利用抑制消减杂交法构建了正向cDNA文库。通过EST测序、生物信息学分析及Real-time PCR检测，获得了一批开花调控相关的基因片段，包括蝴蝶兰early flowering protein1基因（PhEFP1）片段FS33（GenBank登录号JK720330）。在芦笋中，其early flowering protein1基因在营养生长期向生殖生长转变的早期，有很高水平的表达，而且开花速率与early flowering protein1的蛋白量呈相关性（Yeo et al.，1996）。然而，蝴蝶兰PhEFP1的全长cDNA序列和启动子序列没有被公开，也没有任何蝴蝶兰PhEFP1的启动子被鉴定。 

为进一步了解蝴蝶兰PhEFP1基因的表达调控规律，我们克隆了蝴蝶兰PhEFP1基因的全长cDNA序列和上游的启动子序列，并分析了PhEFP1基因的组织表达模式、鉴定了PhEFP1基因的功能和启动子活性，为阐明蝴蝶兰PhEFP1的表达调控机理和在其它植物中的应用奠定 基础。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种在蝴蝶兰中表达的、与蝴蝶兰花梗芽分化与发育密切相关的PhEFP1基因的cDNA全长序列，及其编码的氨基酸序列。 

本发明的第二个目的是提供了应用Real-time PCR检测PhEFP1基因在蝴蝶兰植株不同组织和器官中的表达量的方法。 

本发明的第三个目的是提供了一种新克隆的来源于蝴蝶兰的PhEFP1基因的启动子，用于驱动外源基因在转基因植物中表达。 

本发明的第四个目的是提供了一种含有上述启动子序列的植物基因表达载体、含有上述启动子序列的植物表达载体的转基因细胞系、组织和植物个体。 

本发明的另一个目的是提供了PhEFP1基因在缩短植物开花时间中的应用。 

本发明是通过授权专利“蝴蝶兰FT基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列”（专利号201110158978.7）中所述的抑制消减杂交文库，从该文库中筛选到克隆子FS33（GenBank登录号JK720330，含5’非编码区，5’UTR），根据FS33序列设计基因特异引物，利用RACE技术克隆到蝴蝶兰杂交种Phalaenopsis hybrid Fortune saltzman的early flowering protein1基因的全长cDNA序列。该cDNA序列全长720bp，其序列如序列表中SEQ ID NO:1所述，将该基因命名为PhEFP1。PhEFP1的开放阅读框为从5’端第36位至第512位碱基，共477bp，其编码蛋白的氨基酸序列具有158个氨基酸残基，将该蛋白命名为PhEFP1，其序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。 

将PhEFP1蛋白在NCBI数据库进行Blastp搜索，结果显示，PhEFP1蛋白具有SRPBCC（START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/CoxG/CalC）superfamily保守结构域、Bet v I-like（Pathogenesis-related protein Bet v I family，主要花粉过敏原）保守结构域、多个氨基乙酸富含环和配基结合位点。PhEFP1蛋白分别与油棕的early flowering protein1（ACF06553.1）有58%的同源性、与风信子的pathogenesis-related protein（AAS20971.1）有54%的同源性，与芦笋的early flowering protein1（AAB09084.1）有53%的同源性。 

本发明所述的检测PhEFP1基因在蝴蝶兰植株不同组织和器官中的表达量的方法，包括如下步骤： 

（1）分别提取各样品的总RNA，再将不同样品的RNA分别反转录为cDNA第一链； 

（2）根据核苷酸序列SEQ ID NO:1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为186bp的特异区段： 

PhEFP1-F：5’-TCCTCCCCGACATCATCACC-3’<SEQ ID NO:5>， 

PhEFP1-R：5’-ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’<SEQ ID NO:6>， 

以蝴蝶兰的actin（AY134752.1）作为内参基因，设计特异引物： 

actin-F：5’-CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’<SEQ ID NO:7>， 

actin-R：5’-TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’<SEQ ID NO:8>， 

扩增长为139bp目的片段； 

（3）Real-time PCR反应体系的组成、PCR扩增、数据分析及作图。 

根据Real-time PCR试验结果，获得PhEFP1基因在蝴蝶兰不同组织和器官中的表达量。 

在本发明的实施例中，是通过分别提取了蝴蝶兰40mm大小的花梗芽、5个不同发育阶段的花蕾、开花2d内的花、及花器官如子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱、营养阶段的顶叶、成熟叶及根的总RNA，再将不同样品的RNA（1.0ｕg）分别反转录为cDNA第一链；根据前述的核苷酸序列SEQ ID NO:1，设计Real-time PCR引物来扩增其特异区段，PhEFP1-F：5’-TCCTCCCCGACATCATCACC-3’和PhEFP1-R：5’-ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’，目的片段长为186bp。以蝴蝶兰的actin(AY134752.1)作为内参基因，设计特异引物actin-F：5’-CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’和actin-R：5’-TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’，目的片段长为139bp，其中，蝴蝶兰的actin（AY134752.1）作为内参基因是通过登录GenBank而获取。根据Real-time PCR试验结果，图4所示，可判断PhEFP1基因在蝴蝶兰不同组织和器官中的表达量。从图4可看出，PhEFP1基因在所检测的组织中都有不同丰度的表达。与在营养生长阶段的根和叶中的表达量相比，PhEFP1基因在40mm大小的花梗芽中的表达量明显上升，而在花蕾发育后期（FS2-FS5）、整花及花器官中的表达量均显著下降（图4）。基于这些结果，推测PhEFP1基因既参与蝴蝶兰的营养生长，又参与蝴蝶兰的生殖生长，且其与花梗芽的发育有着密切关系。 

本发明人将上述PhEFP1基因的编码区与植物表达载体连接，通过农杆菌介导，将含有PhEFP1基因的重组植物表达载体转化到拟南芥中，通过抗性筛选获得含有PhEFP1基因的转基因拟南芥。实验发现，在开花时间上，转PhEFP1基因的拟南芥比野生型拟南芥提前开花，20株转化株的平均开花时间为22天，而野生型的平均开花时间为27天。由此表明，PhEFP1基因在拟南芥中超量表达能缩短开花时间。因此，PhEFP1基因具有调控开花时间的功能。 

本发明实施例中提供的启动子的DNA序列，如SEQ ID NO:3所示，代表的是蝴蝶兰PhEFP1基因的起始密码子ATG上游2961bp的DNA片段。在线启动子元件预测分析发现，PhEFP1基因转录可能位于翻译起始位点（ATG）上游35bp的碱基（ATCCACACC）处，转录起始位点上游-33bp处有1个TATA-box，-99bp处含有1个CAAT-box顺式作用元件，说明PhEFP1基因起始密码子ATG上游2961bp的DNA序列具有明显的启动子特征（图7）。 分析还发现，该DNA序列中含花分生组织特异基因LEAFY和AGAMOUS响应单元CCAATGT1个，与花发育相关的MADS类AGL15基因响应元件CWWWWWWWWG有5个（表1和图7）。此外，还含有多个光强、脱水、黄化、伤害、金属离子、低温、植物激素、抗病相关响应元件（表1和图7）。 

本发明人将上述PhEFP1基因的启动子序列与GUS报告基因连接构建植物表达载体，通过农杆菌介导，将含启动子序列的重组植物基因表达载体转化到烟草的叶片中，经共培养、分化培养和筛选后，获得烟草转基因株系；然后，GUS组织化学染色检测瞬时表达。结果发现，转化含PhEFP1基因的启动子序列的重组植物基因表达载体的烟草的叶片显示蓝色，而未转化的植株叶片无蓝色。由此表明，PhEFP1基因的启动子能够调控GUS基因在烟草内进行瞬时表达。因此，PhEFP1基因的启动子具有启动子活性。 

从上述结果分析可表明，本发明所阐述的来自于蝴蝶兰PhEFP1基因的启动子区域的序列可作为一个启动子元件插在DNA双元载体中而用于所有能够使用该启动子的植物的转化来表达目的基因。在构建的表达载体中，与该启动子连接的可以是任何目的基因序列。 

因此，本发明提供的PhEFP1基因、其编码蛋白及其启动子在植物基因工程领域具有潜在应用价值。 

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。 

图1蝴蝶兰PhEFP1基因3’RACE电泳结果。M，DL2000DNA marker，泳道1为PhEFP1基因的3’RACE PCR产物。 

图2蝴蝶兰PhEFP1基因序列同源性比对图。 

图3蝴蝶兰PhEFP1基因cDNA全长及其对应的氨基酸序列；ATG为起始密码子，TAA为终止密码子，下划线AATAA为加尾信号。 

图4氨基酸序列比对；A，蝴蝶兰PhEFP1基因编码的蛋白通过NCBI保守结构域数据库注释结果。B，各GenBank登录号分别为Asparagus officinalis（AAB09084.1）、Elaeis guineensis（ACF06553.1）和Hyacinthus orientalis（AAS20971.1）；‘-’，‘*’，‘:’和‘.’分别表示缺口，一致性，相似性和半相似性的氨基酸残基。 

图5蝴蝶兰PhEFP1基因的表达量分析；A，蝴蝶兰不同组织和器官：FS1-FS5，为不同发育时期的花蕾；FS6，盛开的整花；FS7，花萼；FS8，花瓣；FS9，唇瓣；FS10，合蕊柱；FS11，子房；FS12-FS14，分别为营养生长阶段的根、成熟叶和顶叶；FS15，为40mm大小的花梗芽；B，real-time PCR检测结果。 

图6蝴蝶兰PhEFP1基因启动子克隆的PCR产物电泳结果；M1，DL2000DNA marker，泳 道1，2，3，4分别为基因组DNA被Dra Ⅰ、EcoR V、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ酶切后为模板，进行的第2次PCR的产物；M2，1kb DNA marker。 

图7A蝴蝶兰PhEFP1基因启动子序列及预测转录因子结合位点。 

图7B蝴蝶兰PhEFP1基因启动子序列及预测转录因子结合位点（图7B为图7A续表）。 

具体实施方式

植物材料蝴蝶兰杂交种Phalaenopsis hybrid Fortune saltzman，在人工智能温室栽培。试验用的大肠杆菌DH5α菌株购自鼎国公司，LA Taq、rTaq、pMD-18Tvector、1kb DNA Marker和DNase Ⅰ（RNase free）购自TaKaRa公司，DNA胶回收试剂盒购自TIANGEN公司，SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit、Advantage2PCR Kit、Advantage2Polymerase Mix和Genome Walker^TM Universal Kit购自Clontech公司，DL2000DNA Marker购自普博欣公司；测序和引物合成均由Invitrogen公司完成。 

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。 

实施例1总RNA和基因组DNA的提取 

以蝴蝶兰40mm大小的花梗芽为材料，采用改良异硫氰酸胍法提取花梗芽的总RNA。RNA用Nanodrop ND-1000分光光度计（Thermo，USA）分析浓度和质量，结合1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。 

以蝴蝶兰40mm大小的花梗芽为材料，采用改良CTAB法提取蝴蝶兰的基因组DNA。DNA用Nanodrop ND-1000分光光度计分析浓度和质量，结合0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 

实施例2cDNA第一链和第二链的合成 

cDNA第一链的合成：按照SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit（Clontech，USA）的操作步骤，取蝴蝶兰花梗芽的总RNA1.0μg，与反转录引物3’SMART CDS Primer Ⅱ A(12μM)1.0μl混合均匀，PCR仪上72℃，3min，接着42℃，2min，快速取出，放于室温，然后加入5×First Strand Buffer2μl，DTT(100mM)0.25μl，dNTP Mix(10mM of each dNTP)1μl，SMART Ⅱ A Oligonucleotide(12μM)1μl，Rnase inhibitor0.25μl，Power Script Reverse Transcriptase(100U)1μl，反应体系为10μl。反应程序为42℃60min，72℃7min，-20℃保存备用。 

cDNA第二链的合成：将PCR仪预热到95℃，取2μl稀释10倍的第一链cDNA为模板，Deionized H₂O82μl，10×Advantage2PCR Buffer10μl，50×dNTP(10mM of each dNTP)2.0μl，5’PCR Primer Ⅱ A(12μM)2.0μl，50×Advantage2Polymerase Mix2.0μl，反应体系为100μl。PCR扩增程序为95℃1min；95℃15s，65℃30s，68℃，6min，20cycles。扩增后，-20℃保存备用。 

实施例3PhEFP1基因cDNA全长的克隆 

根据FS33序列（含5’UTR），设计正向基因特异引物扩增3’端，引物为PhEFP1.FP15’TGTGAAGGAGCGGCTTGATT3’<SEQ ID NO:4>，然后以稀释10倍的双链cDNA为模板，以PhEFP1.FP1和3’SMART CDS Primer Ⅱ A为引物扩增目的基因片段。PCR扩增程序为：94℃4min；94℃30s，58.5℃30s，72℃，1min，30cycles；72℃，7min。 

PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的片段。将回收产物连接到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌液PCR验证，阳性克隆送公司进行双向测序。测序所得序列再与FS33序列利用Clustal X（1.8）软件进行拼接。 

实施例4PhEFP1基因及其编码蛋白序列的生物信息学分析 

将拼接序列用BLAST软件进行同源性比对，以确定为蝴蝶兰early flowering protein1基因（PhEFP1）的同源序列。通过blastx分析可知，PhEFP1的全长cDNA序列与油棕（Elaeis guineensis）early flowering protein1基因编码蛋白ACF06553.1的序列同源性最高，达到58%（如图2所示）。 

该PhEFP1基因的cDNA全长为720bp（图3），其序列如SEQ ID NO：1所示，其开放阅读框为从5’端第36位至第512位碱基，共477bp，其编码蛋白的氨基酸序列具有158个氨基酸残基（图3），其序列如SEQ ID NO：2所示。该PhEFP1蛋白的等电点和分子量分别为6.30和16879.29。将PhEFP1蛋白在NCBI数据库进行Blastp搜索，结果表明，PhEFP1蛋白具有SRPBCC（START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/CoxG/CalC）superfamily保守结构域、Bet v I-like（Pathogenesis-related protein Bet v I family，主要花粉过敏原）保守结构域、多个氨基乙酸富含环和配基结合位点（图4）。Blastp也表明，该PhEFP1蛋白与油棕（E.guineensis）early flowering protein1（ACF06553.1）有58%的同源性、与风信子（Hyacinthus orientalis）pathogenesis-related protein（AAS20971.1）有54%的同源性，与芦笋（Asparagus officinalis）early flowering protein1（AAB09084.1）有53%的同源性。比对结果如图4所示。 

实施例5PhEFP1基因的表达模式分析 

取蝴蝶兰分化发育出的40mm大小的花梗芽、5个不同发育阶段的花蕾Fs1-Fs5、开花2d内的花Fs6及花器官如子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱、营养阶段的顶叶、成熟叶及根为材料（图5），分别提取各样品的总RNA，方法如前述。分别取各样品的RNA1.0μg，然后分别反转录为cDNA第一链（PrimeScript^TM Reverse Transcriptase kit,Takara）。根据前述的核苷酸序列SEQ ID NO:1，设计Real-time PCR引物来扩增其特异区段，PhEFP1-F：5’-TCCTCCCCGACATCATCACC-3’<SEQ ID NO:5>和PhEFP1-R：5’-ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’<SEQ ID NO:6>，目的片段长为186bp。以GenBank登录的蝴蝶兰的actin(AY134752.1)作为内参基因，设计特异引物actin-F：5’- CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’<SEQ ID NO:7>和actin-R：5’-TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’<SEQ ID NO:8>，目的片段长为139bp。将前述的第一链cDNA稀释10倍作为Real-time PCR反应的模板；Real-time PCR反应体系为：SYBR premix Ex taq^TM(2×)10.0μl，正反向引物（10μM）各0.5μl，灭菌ddH₂O7.0μl，稀释的第一链cDNA2.0μl。利用Light Cycler480荧光定量PCR仪（Roche）进行PCR扩增，反应程序为95℃30s;95℃5s，59℃15s，72℃30s，40个循环，72℃读取荧光值；循环结束后65℃60s，进行熔解曲线分析；最后40℃冷却10s。分别使用PhEFP1和actin基因的4个浓度梯度稀释的标准品，用作标准曲线制备的PCR模版。将待测样品和标准品同时进行PCR反应，得到待测样品中PhEFP1和actin基因的浓度，然后用待测样品中的PhEFP1基因浓度值去除actin基因的浓度值，得到一个相对值。每份样品3次PCR重复。用Excel2007录入相对值数据和绘图。根据Real-time PCR试验结果，如图5所示，判断PhEFP1基因在蝴蝶兰不同组织和器官中的表达量。从图5可看出，PhEFP1基因在所检测的组织中都有不同丰度的表达。与在营养生长阶段的根和叶中的表达量相比，PhEFP1基因在40mm大小的花梗芽中的表达量明显上升，而在花蕾发育后期（FS2-FS5）、整花Fs6及花器官中的表达量均显著下降（图5）。根据这些结果，推测PhEFP1基因既参与蝴蝶兰的营养生长，又参与蝴蝶兰的生殖生长，且其与花梗芽发育关系密切。 

实施例6PhEFP1基因在拟南芥中的表达及转基因植株的表型鉴定 

以pCAMBIA1303(CAMBIA,Canberra)为基础，构建35S启动子驱动PhEFP1基因的植物表达载体，并转入农杆菌EHA105，具体步骤如下： 

根据PhEFP1基因的cDNA序列，设计引物PhEFP1.5'Nco Ⅰ:5’-CCATGGATGGCTTCCAACTGGTCGGTA-3’（下划线为Nco Ⅰ酶切位点）<SEQ ID NO:9>和PhEFP1.3'Spe Ⅰ:5’-ACTAGTTGCATAGGTTCCAGGATTGG-3’（下划线为Spe Ⅰ酶切位点）<SEQ ID NO:10>。以实施例2合成的第二链cDNA为模板，以PhEFP1.5'Nco Ⅰ和PhEFP1.3'Spe Ⅰ为引物，扩增PhEFP1基因的不含终止密码子的编码区片段。然后，电泳PCR产物、割胶回收连接到pMD-18T载体上，转化DH5а菌株，挑取阳性克隆经菌液PCR和测序鉴定正确后，提取质粒获得pMD-18T-PhEFP1。 

取20μl pMD-18T-PhEFP1用Nco Ⅰ和Spe Ⅰ在37℃双酶切4h，酶切产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，回收编码区片段;将pCAMBIA1303载体同样用Nco Ⅰ和Spe Ⅰ在37℃双酶切4h，65℃水浴10min后，加入碱性磷酸酶CIP37℃放置0.5h，65℃水浴10min，酶切产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳并回收大片段；分别取回收的收编码区片段和酶切处理pCAMBIA1303回收的片段进行连接，连接体系为20μl，各组份如下:10×T4连接缓冲液2μl， 酶切pCAMBIA1303处理的片段6μl，回收的编码区片段11μl，T4DNA连接酶1μl，连接反应于4℃条件下过夜。然后，取8μl连接产物转化DH5а菌株，并涂于含有50μg/ml Kan（卡那霉素）的LB平板上，37℃培养箱过夜培养。挑取单菌落于液体LB培养液（含50μg/ml Kan）中，37℃进行振荡培养，然后进行菌液PCR验证，选择阳性克隆提取质粒酶切验证，并进一步测序确认收编码区序列的正确性，并命名为pCAMBIA1303-35S-PhEFP1。 

将构建的由35S启动的PhEFP1基因植物表达载体（pCAMBIA1303-35S-PhEFP1）采用冻融法转入农杆菌EHA105，具体方法参照Cui W等[Rapid,high efficient transformation of foreign DNA to Agrobacterium tumefaciens.Chinese Journal of Biotechnology,1995,11(4):350-355]。 

采用农杆菌介导的改良花序侵染法对拟南芥（Ler型）进行转化，具体方法参照Logemann等[An improved method for preparing agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.Plant Methods,2006,2:16]。经过潮霉素抗性筛选后，获得转基因候选拟南芥株系。提取候选转基因拟南芥植株的叶片基因组DNA，以其为模板，未转化植株为对照，以PhEFP1.5'Nco Ⅰ和PhEFP1.3'Spe Ⅰ为引物，进行PCR检测。然后，在长日照条件(16-h light/8-h dark，湿度60-80%，温度22℃)下种植转基因拟南芥植株（T2代）和野生型（Ler型），用于形态分析。结果发现，在开花时间上，转PhEFP1基因的植株比野生型提前开花，20株转化株的平均开花时间为22天，而野生型的平均开花时间为27天。 

由上述结果分析表明，PhEFP1基因在拟南芥中超量表达能缩短开花时间；PhEFP1基因具有调控开花时间的功能。 

实施例7PhEFP1基因启动子的克隆及分析 

根据Genome Walker^TM Universal Kit操作说明，基因组DNA用平末端限制酶EcoR V、Dra I、Stu I和Pvu II酶切过夜，分别纯化回收；回收产物与Genome Walker Adaptor连接，16℃连接过夜，连接产物稀释10倍，置于-20℃保存，作为步移PCR的扩增模板。根据PhEFP1基因的cDNA序列，设计两条巢式引物（PhEFP1.GSP1，PhEFP1.GSP2），与接头上的两个引物AP1、AP2形成两对引物。Genome Walking至少要经过两轮PCR扩增。第一轮，以连接产物为模板，AP1和GSP1为引物进行扩增，程序为：94℃25s，72℃3min，7个循环；94℃25s，67℃3min，32个循环；67℃延伸7min。以第一轮的PCR产物为模板，AP2和GSP2为引物进行第二轮扩增，程序为：94℃25s，72℃3min，5个循环；94℃25s，67℃3min，21个循环；67℃延伸7min。第2次PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图6所示。电泳分离后回收合适片段，然后连接到pMD18-T载体中，16℃连接过夜。连接产物用热击法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于含Amp(氨苄青霉素)50μg/mL的LB平板，37℃培养16-20h，挑取单克隆菌 落于含Amp50μg/mL的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养16h，菌液PCR鉴定阳性克隆，然后送测序公司测序。 

AP1：5’GTAATACGACTCACTATAGGGC3’；AP2：5’ACTATAGGGCACGCGTGGT3’； 

PhEFP1.GSP1:5’TTGATCTGTCTGATGCTCCCTGGATTACC3’<SEQ ID NO:11>； 

PhEFP1.GSP2:5’GCTCCCTGGATTACCATCGCCGGAAAGTG3’<SEQ ID NO:12>。 

通过测序，确定PCR扩增出PhEFP1基因起始密码子ATG上游2961bp的DNA片段。应用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）在线启动子元件预测分析。分析发现，PhEFP1基因转录可能位于翻译起始位点（ATG）上游35bp的碱基（ATCCACACC）处，转录起始位点上游-33bp处有1个TATA-box，-99bp处含有1个CAAT-box顺式作用元件，说明PhEFP1基因起始密码子ATG上游2961bp的DNA序列具有明显的启动子特征（图7）。 

分析还发现，该DNA序列中含花分生组织特异基因LEAFY和AGAMOUS响应单元CCAATGT1个，与花发育相关的MADS类AGL15基因响应元件CWWWWWWWWG有5个（表1）。此外，还含有多个光强、脱水、黄化、伤害、金属离子、低温、植物激素、抗 

表1应用PLACE在线预测蝴蝶兰PhEFP1基因启动子区顺式作用元件 

病相关响应元件。其中光调控元件TATTCT和GATAAG分别有3个和1个；光敏色素响应元件AACCAA、GCCAC和GGGCC分别有6个、3个和2个；生理节律相关元件CAANNNNATC有5个；Dof转录因子结合元件AAAG有34个；MYB转录因子结合元件WAACCA、GTTAGTT、YAACKG、CNGTTR、AACGG、MACCWAMC、CCWACC和GGATA分别有2个、1个、1个、3个、1个、2个、4个和4个（表1）。抗逆性相关的调控元件有多个：脱水黄化相关单元ACGTG、CATGTG和CACATG分别有2个、1个和1个；钙离子上调响应单元MACGYGB有2个；厌氧响应单元AAACAAA有6个；低温响应元件RYCGAC和CCGAC分别有11个和8个；热击响应元件CCAAT有4个；冷胁迫响应元件GTCGAC和RCCGAC分别有2个和8个；伤害诱导响应元件TGACY有11个；与抗病相关的G-box单元CACGTG和YTGTCWC分别有2个和1个；与抗病相关的茉莉酸信号单元GCCGCC、水杨酸信号单元TTGAC、TGACG、赤霉素信号单元TGAC分别有1个、5个、1个和21个（表1）。 

另外，不同激素（脱落酸、生长素、赤霉素、水杨酸、茉莉酸、乙烯等）响应顺式作用元件也在上游序列中有发现。生长素响应元件TGTCTC、ACTTTA和CATATG分别有2个、4个和4个；与细胞分裂素相关的元件TATTAG有2个；脱落酸响应元件ACGTGKC有2个；与赤霉素信号传递相关元件TATCCAC、CAACTC和TAACAAR各有1个；与乙烯响应相关元件AWTTCAAA有1个（表1）。 

PhEFP1基因上游的DNA序列分析表明，多种启动子元件的存在暗示PhEFP1基因可能在蝴蝶兰花芽分化与花发育、光调控、激素信号、抗病、抗逆境和生理节律方面起到一定的作用。 

实施例8pPhEFP1-GUS植物表达载体的构建及活性分析 

以pCAMBIA1301(CAMBIA,Canberra)为基础，构建PhEFP1基因上游调控序列启动的GUS基因植物表达载体，并转入农杆菌EHA105，具体步骤如下： 

根据实施例7中得到的PhEFP1基因启动子片段序列设计引物PhEFP1PF:5’-GAATTCCCTAAAATAAAATGAAAAAAAATTC-3’（下划线为EcoR I酶切位点）<SEQ ID NO:13>和PhEFP1PR:5’-AGATCTGTTTGTAGAAGGTGGTATGGCTGTG-3’（下划线为Bgl II酶切位点）<SEQ ID NO:14>。以实施例1中提取的蝴蝶兰40mm大小花梗芽的DNA为模板，以PhEFP1PF和PhEFP1PR为引物，扩增PhEFP1基因的全长启动子片段。然后，电泳PCR产物、割胶回收连接到pMD-18T载体上，转化DH5а菌株，挑取阳性克隆经菌液PCR和测序鉴定正确后，提取质粒获得pMD-18T-pPhEFP1。 

取20μl pMD-18T-pPhEFP1用EcoR Ⅰ和Bgl II在37℃双酶切4h，酶切产物在1.0%的 琼脂糖凝胶上电泳，回收启动子片段;将pCAMBIA1301载体同样用EcoR Ⅰ和Bgl II在37℃双酶切4h，65℃水浴10min后，加入碱性磷酸酶CIP37℃放置0.5h，65℃水浴10min，酶切产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳并回收大片段;分别取回收的启动子片段和酶切处理pCAMBIA1301回收的大片段进行连接，连接体系为20μl，各组份如下:10×T4连接缓冲液2μl，酶切pCAMBIA1301处理的大片段6μl，回收的启动子片段11μl，T4DNA连接酶1μl，连接反应于4℃条件下过夜。然后，取8μl连接产物转化DH5а菌株，并涂于含有50μg/ml Kan（卡那霉素）的LB平板上，37℃培养箱过夜培养。挑取单菌落于液体LB培养液（含50μg/ml Kan）中，37℃进行振荡培养，然后进行菌液PCR验证，选择阳性克隆提取质粒酶切验证，并进一步测序确认启动子序列的正确性，并命名为pPhEFP1-GUS。 

将构建的由PhEFP1基因上游调控序列启动的GUS基因植物表达载体（pPhEFP1-GUS）采用冻融法转入农杆菌EHA105，具体方法参照Cui W等[Rapid,high efficient transformation of foreign DNA to Agrobacterium tumefaciens.Chinese Journal of Biotechnology,1995,11(4):350-355]。 

采用农杆菌介导的叶盘法对烟草叶片进行转化，具体方法参照Horsch等[Analysis of Agrobacterium tumefaciens virulence mutants in leaf discs.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,1986,83:2571-2575]。经过共培养、分化培养、潮霉素生根筛选后，获得烟草转基因候选株系。提取候选转基因烟草植株的叶片基因组DNA，以其为模板，未转化植株为对照，以PhEFP1PF和PhEFP1PR为引物，进行PCR检测。然后，GUS组织化学染色检测瞬时表达结果，方法参照Jefferson等[GUS fusion:Beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.The EMBO Journal,1987,6(13):3901-3907]。结果发现，转化pPhEFP1-GUS的烟草的叶片显示蓝色，而未转化的植株叶片无蓝色，这表明PhEFP1基因的启动子片段能够调控GUS基因在烟草内进行瞬时表达，具有启动子活性。 

Claims (8)

1.一种蝴蝶兰PhEFP1基因，它具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述的蝴蝶兰PhEFP1基因编码的多肽，其特征在于，具有如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。

3.一种用于引导如权利要求1所述的蝴蝶兰PhEFP1基因进行表达的启动子，它具有SEQID NO:3所示的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求1所述的PhEFP1基因编码区序列的重组植物表达载体。

5.一种含有权利要求1所述的PhEFP1基因编码区序列的植物转基因细胞、组织或个体。

6.一种含有权利要求3所述的启动子序列的重组植物表达载体。

7.一种含有权利要求3所述的启动子序列的植物转基因细胞、组织或个体。

8.一种用于检测PhEFP1基因在蝴蝶兰不同组织器官中的表达量的方法，其特征在于包括如下步骤：

分别提取了蝴蝶兰不同组织器官的总RNA，再将不同组织器官的RNA分别反转录为cDNA第一链；根据核苷酸序列SEQ ID NO:1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为186bp的特异区段：

PhEFP1-F：5’-TCCTCCCCGACATCATCACC-3’，

PhEFP1-R：5’-ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’，

根据Real-time PCR试验结果，获得PhEFP1基因在蝴蝶兰不同组织和器官中的表达量。

Images