CN101993870B - 月季热激蛋白启动子、其克隆方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，涉及一种热诱导型启动子RcHSP17.8P核苷酸编码序列的克隆，此启动子重组表达载体的构建，以及转入草本植物的双子叶植物中启动下游蛋白表达的方法。本发明利用分子生物学方法分析该片段控制下的报告基因GUS的表达模式，结果表明产生的转基因拟南芥幼苗在37℃热激处理下诱导下游基因GUS的表达，并且表达活性随着发育时期而变化。本发明的月季启动子RcHSP17.8P将可作为一种有效的温度感应的生物传感器系统的基础。

Description

月季热激蛋白启动子、其克隆方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，涉及一种热诱导型启动子RcHSP17.8P核苷酸编码序列的克隆，此启动子重组表达载体的构建，以及转入草本植物的双子叶植物中启动下游蛋白表达的方法。

背景技术

启动子可以与依赖于DNA的RNA聚合酶识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，是基因表达调控的重要元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处.在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。诱导型启动子与另外两类相比特点在于：它可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或特定的生长环境下，诱导基因准确而又选择的起始转录。

温度效应启动子是受温度诱导活性的启动子，可分为热效应和冷效应启动子两类。热效应启动子对高温产生响应，含HSE、CCAAT-盒、AT-rich等活性元件序列。HSE含有一个3碱基的5’-GAA-3’序列，或反方向的5’-TTC-3’序列，这种三核苷重复序列相间排列，两者之间被两个碱基隔开，形成5’-[nGAAn][nTTCn]-3’结构。Coca等(Maria A.Coca，ConcepciónAlmoguera，Terry L.Thomas and Juan Jordano(1996)Differential regulation ofsmall heat-shock genes in plants：analysis of a water-stress-inducible anddevelopmentally activated sunflower promoter.Plant Molecular Biology，31：863-876)将向日葵的HaHSP17.7G4基因的启动子与gus连接，转化烟草，发现其对对高温(42℃)、脱落酸都有应答，在胚胎形成过程中也有积累。拟南芥AtHsp90-1基因启动子CCAAT-box缺失表明，CCAAT-box自身对热激无反应，只有与启动子中其它的热激元件，如：HSEs或STREs(stressresponse elements)共同作用才能增加热诱导启动子的特性(Haralampidis K.，Milioni D.and Rigas S.(2002)Plant Physiol，129，1138-1149.)。将大豆热激蛋白GmHSP17.3B启动子与gus、GFP-talin融合，转入苔藓。通过控制热激温度和来调节GUS的表达量(Younousse Saidi，Andrija Finka，MickhailChakhporanian，Jean-Pierre

Didier G.Schaefer and Pierre Goloubinoff，(2005)Plant Molecular Biology，59，697-711)，这使将启动子调节功能应用于生物技术，使在植物细胞中表达可控制数量的内源或重组蛋白成为可能。

与本发明相关的参考文献有：

1.Concepción Almoguera，Pilar Prieto-Dapena and Juan Jordano(1998)Dual regulation of a heat shock promoter during embryogenesis stage-dependentrole of heat shock elements.The plant Journal，13(4)，437-446

2.D.CRONE，J.RUEDA，K.L.MARTIN，D.A.HAMILTON and J.P.MASCARENHAS(2001)The differential expression of a heat shock promoter infloral and reproductive tissues.Plant.Cell and Environment，24，869-874

3.Dorothea K.Thompson and Charles J.Daniels(1998)Heat shockinducibility of an archaeal TATA-like promoter is controlled by adjacentsequence elements.Molecular Microbiology，27(3)，541-551

4.Maria A.Coca，Concepción Almoguera，Terry L.Thomas and JuanJordano(1996)Differential regulation of small heat-shock genes in plants：analysis of a water-stress-inducible and developmentally activated sunflowerpromoter.Plant Molecular Biology，31：863-876

5.Haralampidis K.，Milioni D.and Rigas S.(2002)Combinatorialinteraction of Cis elements specifies the exp ression of the A rabidopsisAtHsp90-1 gene  Plant Physiol，129，1138-1149.

6.Ralf Prandl and Fritz Schoffl(1996)Heat shock elements are involved inheat shock promoter activation during tobacco seed maturation.Plant MolecularBiology，31，157-162

7.Younousse Saidi，Andrija Finka，Mickhail Chakhporanian，Jean-Pierre

Didier G.S chaefer and Pierre Goloubinoff，(2005)Controlled expressionof recombinant proteins in Physcomitrella patens by a conditional heat-shockpromoter：a tool for plant research and biotechnology.Plant Molecular Biology，59，697-711

8.夏江东等(2006)高等植物启动子功能和结构研究进展，云南农业大学学报，第21卷第1期P7-14

9.伊淑莹等(2007)番茄多胁迫诱导型LeMTshsp启动子的分子克隆及其功能分析，云南植物研究，29(2)，223～230

发明内容

本发明的目的在首先在于提出一种从月季中分离出的编码细胞质I型小分子热激蛋白17.8的基因RcHSP17.8的启动子，该启动子是热诱导型，是月季中一种新的热诱导型启动子。

本发明的第二目的是提供这种RcHSP17.8的启动子的制备方法。

本发明的第三目的是提供这种RcHSP17.8P启动子的应用。

本发明提供了一种月季热激蛋白启动子，其核苷酸编码序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的月季热激蛋白启动子是月季细胞质I型小分子热激蛋的基因RcHSP17.8上游的一段转录区，全长1.91kbp，本发明中称为RcHSP17.8P。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，也包括与SEQ ID NO.1序列同源度75％甚至在90％以上，与SEQ ID NO.1编码的DNA具有相同功能的核酸分子。

本发明的月季热激蛋白启动子的顺式作用元件：3个热激元件(

际识)和2个冷感应元件(

标识)，以及1个对干旱产生响应的调控元(______标识)。具体位置见图7中的标识元件。

本发明还提供了上述月季热激蛋白启动子的克隆方法，依次包括如下步骤：

(1)取月季嫩叶，抽提DNA；

(2)选择月季热激蛋白ORF中无酶切位点的限制性内切酶，对(1)所得DNA充分酶切，酶切产物经沉淀纯化后环化自连；

(3)根据月季热激蛋白ORF的序列，采用反式PCR方法克隆得到权利要求1所述的月季热激蛋白启动子。

上述克隆方法中，所述的月季嫩叶是温室中正常培养4周的月季组培盆苗的嫩叶。例如，本发明的一个实施例中采用温室中正常培养4周的月季‘曼海姆宫殿’(Schloss mannieim，以下简写为SM)组培盆苗，取其嫩叶。

上述克隆方法中，所述的月季热激蛋白ORF中无酶切位点的限制性内切酶是Bgl II、Apa I、BamH I、Sal I、Sph I、Sca I、Eae I、Hpa I、NotI、Rsa I中的一种或者几种。

上述克隆方法中，步骤(3)中利用反式PCR引物进行三轮PCR扩增获得所述的月季热激蛋白启动子。

反式PCR(I-PCR)可以快速、高效地扩增cDNA或基因组中已知序列两侧位置的片段。其基本实验程序是：基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物(流程如图8所示)。

上述克隆方法中，采用三对反式PCR引物进行扩增。较好的，第三对反式PCR引物中一条即为ORF的5’端序列，另一条尽量靠近月季热激蛋白ORF的3’端。

本发明提供了用于调取获得RcHSP17.8(月季热激蛋白)的三对核苷酸引物。该引物根据RcHSP17.8的ORF设计，使用此引物对BglII酶切过的月季基因组DNA进行三次反式PCR扩增可获得长2.2kbp的DNA片段。具体的引物序列信息参见SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.7。

上述克隆方法中，克隆此启动子的PCR酶可以采用LA Taq，buffer为相应的GC缓冲液(LA-Taq专用)。

上述克隆方法中，克隆此启动子的PCR程序中采用68℃进行复性及延伸。例如，可以设定为94℃预变性4min；98℃变性10s，68℃复性及延伸15min，30个循环；最后72℃延伸10min。

本发明还提供了含有所述月季热激蛋白启动子的重组载体。即将本发明的月季热激蛋白启动子根据常规方法与适当的植物表达载体连接，例如本发明实施例中采用的pCAMBIA1300植物表达载体等等。

最后，本发明提供了所述月季热激蛋白启动子的应用，即将所述启动子的重组载体转入植物中，以启动下游基因的表达。

根据月季启动子RcHSP17.8P序列1910bp，设计扩增出完整序列的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。将PCR产物与经过同样双酶切的改造过的植物表达载体连接，转化，测序，确保序列正确。将其转入农杆菌中，对正常培养(生长条件为光周期16h/8h(L/D)，22℃)的目标植物进行转基因，采用浸花法转化适当花期的该植物。正常培养，收取种子，获得T1代幼苗后GUS显色。

以双子叶植物拟南芥为例，具体步骤如下：

(1)将含有所述月季热激蛋白启动子的重组表达载体转入共转化农杆菌GV3101。

(2)于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10μl∶10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30h，次日下午6点将已摇活的菌按(1∶400)及750μl菌液转至汉100ml YEP+Kan+Rif中培养28℃，300rpm约14h，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.2时，可收集菌体于50ml离心管(灭菌)，4℃，4000g离心10min。用5％蔗糖(含0.03％silwet)稀释至OD600约为0.8～1.0左右，用5％蔗糖作对照。转化时将花苞在溶液中浸泡5s左右，暗培养24h。转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水至透。

(3)将转化好的苗正常培养，每3d浇水1次。

(4)收取转化拟南芥，烘干(37℃24h)。用乙醇消毒后并撒于抗生素潮霉素筛选培养基上，4℃春化2d，正常培养，一周后获得转化植株的T1代幼苗。

(5)将T1代幼苗移到土中培养。

(6)PCR鉴定其HYG基因的表达，样品分别为转基因和野生型的拟南芥基因组DNA。

(6)鉴定后的植株GUS显色。

本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。

本研究分离的月季启动子RcHSP17.8P，是新型的诱导型启动子，是一种温度依赖型基因RcHSP17.8的上游一段DNA序列，具体为一种编码月季细胞质I型小分子热激蛋RcHSP17.8的启动子，记为RcHSP17.8P。将本发明所获基因通过农杆菌介导的转基因的方法，转入双子叶植物拟南芥中，启动下游重组基因在转化细胞中具有高温诱导表达的特性。本发明利用分子生物学方法分析该片段控制下的报告基因GUS的表达模式，结果表明产生的转基因拟南芥幼苗在37℃热激处理下诱导下游基因GUS的表达，并且表达活性随着发育时期而变化。本发明的月季启动子RcHSP17.8P将可作为一种有效的温度感应的生物传感器系统的基础。

附图说明

图1月季SM基因组酶切结果。1-10泳道分别为BglII、Apa I、BamHI、Sal I、SphI、Sca I、Eae I、Hpa I、Not I、Rsa I酶切产物电泳检测。

图2为第二轮反式PCR电泳检测结果。

图3为第三轮反式PCR电泳检测。

图4为转基因拟南芥潮霉素基因(HYG)和启动子片段的PCR鉴定结果，其中，左右两幅分别用潮霉素基因和启动子片段的一对特异引物PCR鉴定样品中潮霉素(图左)和启动子(右)；M为DL2000Marker从上至下：2000bp，1000bp，750bp，500bp；+：拟南芥转基因阳性植株苗鉴定；-：未转化启动子序列拟南芥阴性苗鉴定。

图5为不同发育时期转基因拟南芥植株苗热处理下进行GUS显色鉴定结果，其中，aa、bb、cc、dd为没有处理的12h、24h、2d、6d的苗的GUS染色情况，ee、ff、gg、hh为12h、24h、2d、6d的苗37℃处理1h后GUS染色情况。

图6为花和果荚中GUS显色鉴定结果。a、b、e为对照，c、d、f为37℃热激1h后染色。

图7为启动子RcHSP17.8P序列中作用元件的标示图，图中有正、负两条互补链，有3个热激元件(标识)，2个冷感应元件(

标识)，1个对干旱产生响应的调控元(_____标识)。

图8为反式PCR的基本流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。所用试剂材料如非特别标注，则是从上海生工、上海前尘生物科技有限公司购得。

实施例1月季RcHSP17.8启动子RcHSP17.8P基因的克隆

1月季(Rosa chinensis)品种曼海姆(Japonica)来自上海植物园；生长条件为光周期16h/8h(L/D)，27℃。

2基因组DNA提取。取0.05g嫩叶片，加入少许不溶性PVP，液氮中充分研磨，迅速转移至1.5ml的EP管中；加入500μl 65℃预热的提取缓冲液，快速混匀；65℃水浴20min(期间倒置混匀1-2次)，冷却至室温；加入500μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻柔混匀，静置1-2min；12000rpm、室温离心10min，上清转移至新管；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻柔混匀，静置1-2min；同上离心，上清转移至新管；加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2倍体积冰冷的无水乙醇(-20℃)，轻柔混匀，-20℃静置40min；同上离心，弃上清，沉淀用70％乙醇(4℃预冷)洗涤2次；室温凉干，25μlTE(含1％(V/V)RNA酶)充分溶解沉淀；65℃水浴消化RNA 1h；取5μl用于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

3启动子的克隆。选择在RcHSP17.8的ORF中无酶切位点(non-cutting)的限制性内切酶：Bgl II、Apa I、BamH I、Sal I、Sph I、Sca I、Eae I、Hpa I、Not I、Rsa I对SM基因组DNA进行充分酶切(图1)，酶切产物经沉淀纯化后用于环化自连。依据RcHSP17.8的ORF序列设计SM与KP的RcHSP17.8启动子克隆使用的引物，第三对反式PCR引物IN3-F即为ORF的5’端序列，IN3-R尽量靠近ORF的3’端设计。以上述连接产物为模板，以反式PCR引物进行三轮PCR扩增，从Bgl II酶切产物中扩增到一条2.2Kb的片段(图3)，小量胶回收法将PCR产物进行割胶回收。

反式PCR引物序列如下：

第一对：

IN1-F 5’-AGGACAAGAACGACAAGTGG-3’

IN1-R 5’-GTCATCTTCAATCTCAACCT-3’

第二对：

IN2-F 5’-C GAGAGAAGCAGCGGCAAGT-3’

IN2-R 5’-CCTCTTCTTTCTTCAGCCCC-3’

第三对：

IN3-F 5’-AGGCTGCTATGGAGAATGGA-3’

IN3-R 5’-GGAAATTTGGGATAAGCGACAT-3

实施例2月季启动子RcHSP17.8P核苷酸编码区的顺式作用元件分析

登陆PlantCARE数据库在线进行预测RcHSP17.8启动子DNA序列上的顺式作用元件，分析其区域上的与热激、低温、干旱等胁迫相关，信息参见发明内容，具体序列如图7不同标注。

实施例3

转化月季启动子RcHSP17.8P的拟南芥植株潮霉素基因(HYG)和启动子片段的PCR鉴定

以SDS方法小量抽提转基因和野生植株的基因组DNA。利用潮霉素基因和启动子片段的特异引物，进行PCR鉴定。检测结果如图4所示，PCR结果都表明携带启动子基因的载体质粒已经整合到拟南芥基因组中。

实施例4

转化月季启动子RcHSP17.8P的双子叶植物-拟南芥幼苗进行GUS显色鉴定

根据月季启动子RcHSP17.8P序列1910bp，设计扩增出完整序列的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，在5’端和3’端分别加入EcoR I和SacI酶切位点。经EcoR I和SacI双酶切的PCR产物与经过同样双酶切的改造过的pCAMBIA1300植物表达载体连接，转化，测序，确保序列正确。将其转入农杆菌中。将含有RcHSP17.8P启动子序列的农杆菌，对正常培养(生长条件为光周期16h/8h(L/D)，22℃)的拟南芥进行转基因，采用浸花法转化适当花期的拟南芥。正常培养，收取种子，获得T1代幼苗后GUS显色。

具体步骤如下：

(1)将含有所述月季热激蛋白启动子的重组表达载体转入共转化农杆菌GV3101。

(2)于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10μl∶10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30h，次日下午6点将已摇活的菌按(1∶400)及750μl菌液转至汉100ml YEP+Kan+Rif中培养28℃，300rpm约14h，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.2时，可收集菌体于50ml离心管(灭菌)，4℃，4000g离心10min。用5％蔗糖(含0.03％silwet)稀释至OD600约为0.8～1.0左右，用5％蔗糖作对照。转化时将花苞在溶液中浸泡5s左右，暗培养24h。转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水至透。

(3)将转化好的苗正常培养，每3d浇水1次。

(4)收取转化拟南芥，烘干(37℃24h)。用乙醇消毒后并撒于抗生素潮霉素筛选培养基上，4℃春化2d，正常培养，一周后获得转化植株的T1代幼苗。

(5)将T1代幼苗移到土中培养。

(6)PCR鉴定其HYG基因的表达，样品分别为转基因和野生型的拟南芥基因组DNA。

(6)鉴定后的植株GUS显色(方法同前所述)。

通过与未转基因的对照组相比，可看到转基因阳性植株在37℃高温处理1h后GUS活性上升，但仅限于不到6d的小苗，6d后不进行处理，GUS活性也很高(图6)。花中，37℃热激处理1h后，萼片、花丝、柱头等部位GUS活性增强。果荚两端的GUS表达量在热激后也会上升。转此基因的植株与野生型营养生长没有区别，生长良好。

序列表

<210>1

<211>1910

<212>DNA

<213>月季

<220>

<221>热激元件

<222>(1804)..(1817)

<223>

<400>1

ccaagattca ctttagtgag ccctattaga tttaggctag aatatatatc tttttaatta    60

tccgattcgg catttaatat ttttaggcta gttttacatt tgttttagga ttctttttat    120

ttttaggttc ttagtttcct tttaaatttg gatcctttag gattccttgt tagattatga    180

ttttaggtct tggatgccta tatatgcatc atcatgcttt gtattagaat cagtttatca    240

tatcaaattt aataaaaatt gagagttttt tctcaagttc tctggtggac tctagattta    300

tcgttttaga gtatattgat tgtaaactta ggttacttca gactttgtca aattcaattt    360

agttgctatt ttgtttgagc ttgatacaat aaagatatcg gagaggtctg ttttgtattt    420

gatttgaaaa actcatgcca tctcttgctc tcactcttgc gaaccctcac aacgccgcca    480

caggtttcaa gcacgttgcg cacgatctcg gtagcgcttc tacctttcgc gatcacccaa    540

aacgattgtg tatattgacc tctccttttt gttggtttcc tgatggtttc ctttggcttt    600

ctttaggctg gagaggatgg ccatgaagag ggcggctgga gggtggcctt cagtttcgat    660

gggttggaac tcagatggat tggttgagaa ggatggcgac gctatggatt gtgagacttt    720

tggccaggca gatgctgttg gcagcatggg gygcatatct gcctaggttt ggtggcggtc    780

tgcatcgctt aggtgtccac atcaagagct tgggcttctt ggttgggctg tgtttggacc    840

caaagtagat gagtgtccag ataagaagat ggattcttcc aggtgtctaa gggacttgga    900

tttgggatcc aggaggtttg ctatatattc tattcaatgt catagttgtt acttgtttgg    960

gtgtgttgtt cttaattttt ggtaaagtga tgctctctat attctatgaa gactctaatt    1020

ttagtttgaa attttgttga ttgctctgct ctttcttatt gatataaata agaaaaataa    1080

ggacaaaatg ttgcattatt cgacattatt atattaattg tgtatccagg tcattttttt    1140

ccaaaccttt cacaacatgt tttcggacca aaaaataaag ttaacatttt tttttggata    1200

aatttcagtt tagtacccct tgtgggtttg ggggttatat catgttagtc catgctcttt    1260

caatttgatc agtaacaccc ctgtgctttc aatttcaatc agccgtgccc aaatttactg    1320

ttccgtccaa ttttgaacgt taactttgac tggattgaca aagtaaaatt tagacgaaac    1380

agtaaaattt gggcacggct gattgaaatt gaaagcacag gggtgttgtt gatcaaattg    1440

aaagagcaga cactgacatg atattacccc caaaccccaa ggtactaaat tgaaatcaat    1500

cctttttttt ttttgagaat aaataaatgt caacttatgt gagagtaaaa tcccaagaaa    1560

agtatgagcc aacgtttaat tccgctcccc atccctactc tcatctgact tcaagagccc    1620

ataatgtaac ctactttggg cccatatttt tattctcaac attcctagac agtttcctga    1680

ccattcttcc gttccattgt atgagcccac gattatggaa cctactttcg gccgactttc    1740

tcattctcag gagtcctgga aagttcgaga gaacagaaaa acgttttcaa gtccgagcat    1800

tctccagaag attcttgggt ctccttataa atacgcatcc aatcttcccg tccaatcacc    1860

aaaccagtta agcaaatact caaacattct gatcgtgcaa tccattcaca               1910

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

aggacaagaa cgacaagtgg    20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gtcatcttca atctcaacct    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cgagagaagc agcggcaagt    20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

cctcttcttt cttcagcccc    20

Claims (8)

1.一种月季热激蛋白启动子,其特征在于，其核苷酸编码序列如SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述月季热激蛋白启动子的克隆方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤：

（1）取月季嫩叶，抽提DNA；所述的月季是曼海姆宫殿月季；

（2）选择月季热激蛋白ORF中无酶切位点的限制性内切酶，对（1）所得DNA充分酶切，酶切产物经沉淀纯化后环化自连；所述的月季热激蛋白ORF中无酶切位点的限制性内切酶是Bgl II、Apa I、BamH I、Sal I、Sph I、Sca I、Eae I、Hpa I、Not I、Rsa I中的一种或者几种；

（3）根据月季热激蛋白ORF的序列，采用反式PCR方法克隆得到权利要求1所述的月季热激蛋白启动子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的月季嫩叶是温室中正常培养4周的月季组培盆苗的嫩叶。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中利用反式PCR引物进行三轮PCR扩增获得权利要求1所述的月季热激蛋白启动子。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，克隆此启动子的PCR酶为LA Taq，buffer为GC缓冲液。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，克隆此启动子的PCR程序为94℃预变性4min；98℃变性10s，68℃复性及延伸15min，30个循环；最后72℃延伸10min。

7.含有如权利要求1所述月季热激蛋白启动子的重组载体。

8.如权利要求1所述月季热激蛋白启动子的应用，其特征在于，将所述启动子的重组载体转入植物中，以便在热激条件下启动下游基因的表达。

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