CN111826376B

CN111826376B - 一种植物启动子及其应用

Info

Publication number: CN111826376B
Application number: CN202010587486.9A
Authority: CN
Inventors: 彭巍; 傅明辉; 邓志威; 陆梓晴; 周淑贤
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN111826376A

Abstract

本申请属于基因工程的技术领域，尤其涉及一种植物启动子及其应用。本申请提供了一种植物启动子，包括脱落酸响应元件、诱导厌氧响应元件、光响应元件、启动子和增强子区域作用元件、赤霉素响应元件、调控分生组织特异活性元件、茉莉酸响应元件、乙烯响应元件、干旱、高盐、低温响应元件、抗脱落酸响应元件、转录核心启动子元件、GGTGC功能区和转录起始点。本申请公开的新型植物启动子，该启动子能够在植物中启动目的基因的高效表达。

Description

一种植物启动子及其应用

技术领域

本申请属于基因工程的技术领域，尤其涉及一种植物启动子及其应用。

背景技术

随着国家建设的大力实施，工业化进程的快速发展，导致越来越多的河流湖泊等水体产生严重的富营养化现象。很久之前，人们就利用水生植物净化富营养化水体，这是一种普遍、经济而且高效的方法。但像水葫芦这种大型的水生植物容易造成堵塞航道难以打捞而且回收价值低，而放之任意生长又会造成二次污染等环境问题，利用水生植物净化富营养化水体具有非常广阔的发展前景，而紫萍有望解决这一困境。

紫萍别名鸭并草，多年生草本，一年四季都可在湖泊河流中生存，全球各地均有分布，广泛分布在热带、温带的淡水湖泊中和部分靠海的港湾中。紫萍是浮萍科、浮萍属的一种水面浮生植物，具有适应生长性强、净化富营养化水体好、易打捞回收等特点。紫萍净化水体的区域十分广泛，几乎可以吸收大部分的有机污水，如：家庭污水、人畜粪便废水，和食品等加工厂排放的废液废料。此外，紫萍可以吸收多种重金属元素、作为生物能源潜力巨大、良好药用价值。

因此，利用基因工程技术生产转基因紫萍受到广泛关注，而植物启动子是构建转基因植物的基础，植物启动子是一段位于基因起始密码子(ATG)5′端上游能与RNA聚合酶完成精准结合的DNA序列，决定着基因转录的方向与效率，是调控基因转录核心。但是，在紫萍中只有少数启动子被证实并广泛应用。

发明内容

有鉴于此，本申请研发了一种新型植物启动子，该启动子能够在植物中启动目的基因的高效表达。

本申请第一方面提供了一种植物启动子，包括脱落酸响应元件、诱导厌氧响应元件、光响应元件、启动子和增强子区域作用元件、赤霉素响应元件、调控分生组织特异活性元件、茉莉酸响应元件、乙烯响应元件、干旱、高盐、低温响应元件、抗脱落酸响应元件、转录核心启动子元件、GGTGC功能区和转录起始点。

作为优选，所述脱落酸响应元件选自AAGAA-motif和ABRE；

所述诱导厌氧响应元件选自ARE；

所述光响应元件选自Box 4、G-Box和TCCC-motif；

所述启动子和增强子区域作用元件选自CAAT-box；

所述赤霉素响应元件选自CARE；

所述调控分生组织特异活性元件选自CCGTCC-box；

所述茉莉酸响应元件选自CGTCA-motif和TGACG-motif；

所述乙烯响应元件选自ERE；

所述干旱、高盐、低温响应元件选自MYB；

所述抗脱落酸响应元件选自MYC；

所述转录核心启动子元件选自TATA-box；

所述转录起始点选自TSSP。

需要说明的是，所述GGTGC功能区的核苷酸序列为GGTGC。

作为优选，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一个：

(Ⅰ)如SEQ ID NO.1所示；

(Ⅱ)与如SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性的序列；

(Ⅲ)如SEQ ID NO.1所示序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列。

本申请的植物启动子可以通过人工合成的方式获得，也可以通过PCR方式获得。具体的，本申请的第一个植物启动子，其序列为SEQ ID NO.1所示，命名为SpPHT1启动子3，SpPHT1启动子3的核苷酸序列为： GGGCACTCGTTGCTCCATCTCGGCTAATTTAACGAAATAATTGGAATGAGAGAGATGC TAAAAAAGGGGTCTTCCGTTTGGATAGTGATGCATCCCTCTGTCTCTCTCTCCTCCGGT AGGGCCTTCAAGGTTTTCGTTGAAACTCATCGGAAGATCAGTCTAAAGTTAAGGCAA GTGTCGTGTCGTCTTTCTCTCTCACGTTCCTGGACCCGTGATCGTTTGATTCCAGGAA CTTTGGTGATCGATTGATTCTTGAGAGTCCAAAAATCGGTCAACGACTGCGAAATATT TTGAGCGGATTTTCATGTGCATCAATTTAAAATTGATATTTATTTATTTTGTGCTGTCTG GGCTTTTCAATTTCTTCAGAGAAATCCTGGGATCCTCTTCTTTCACCCTCGGATCTCAT CCTCTGGACCTTCCATCTCTCTGGTTTCTTCCTCTGTAATTCAACTTATTATATGTACAC ACCGTCCTCTAAGATTTTGTGGATTCTTTACTTTGCAGGATCTGAAGGAGATTAAAAG GGGGTTAGACCATGGCAAGAGATCAGCTTCAGGTCCTCACCGCGCTAGATGTCGCCA AGACGCAGTGGTATCACTTCACGGCGATCGTGATCGCCGGCATGGGGTTCTTTACCGACGCCTACGACC。

具体的，本申请通过PCR方式获得本申请的SEQ ID NO.1植物启动子方法为：以紫萍基因组总DNA为模板，扩增SpPHT1启动子3(紫萍SpPHT1基因启动子序列，SEQ ID NO.1)。PCR反应体系如下：DNA 2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，SpPHT1-Q1-F(SEQ ID No.4)1μL，dNTP(10mM each)1μL，SpPHT1-Q1-R(SEQ ID No.5)1μL，LA Taq 0.5μL， ddH₂O 17μL。PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，63.1℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。其中：SpPHT-Q1-F(SEQ ID No.4)核苷酸序列为：5’ -CCCAAGCTTGGGCACTCGTTGCTCCAT-3’(5’端带有Hind III酶切位点)； SpPHT1-Q1-R(SEQ IDNo.5)核苷酸序列为：5’-GCTCTAGAGGTCGTAGGCGTCGGTAA-3’ (5’端带有XbaI酶切位点)。

作为优选，其具有(Ⅳ)、(V)或(Ⅵ)所示的核苷酸序列中任意一个：

(Ⅳ)如SEQ ID NO.2所示；

(V)与如SEQ ID NO.2所示序列具有至少60％同源性的序列；

(Ⅵ)如SEQ ID NO.2所示序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列。

本申请的植物启动子可以通过人工合成的方式获得，也可以通过PCR方式获得。具体的，本申请的第二个植物启动子，其序列为SEQ ID NO.2所示，命名为SpPHT1启动子2，SpPHT1启动子2的5’端比SpPHT1启动子3多了数个作用元件，SpPHT1启动子2的核苷酸序列为： TTGTGGTCGTGCGTGTGACGCTATCTAGTTAATTTTTTCAATCCATGCCGGATCATTTTT TTTTTCTAGCATTAGATAGCGGATTGGGGCACTCGTTGCTCCATCTCGGCTAATTTAAC GAAATAATTGGAATGAGAGAGATGCTAAAAAAGGGGTCTTCCGTTTGGATAGTGATG CATCCCTCTGTCTCTCTCTCCTCCGGTAGGGCCTTCAAGGTTTTCGTTGAAACTCATC GGAAGATCAGTCTAAAGTTAAGGCAAGTGTCGTGTCGTCTTTCTCTCTCACGTTCCTG GACCCGTGATCGTTTGATTCCAGGAACTTTGGTGATCGATTGATTCTTGAGAGTCCAA AAATCGGTCAACGACTGCGAAATATTTTGAGCGGATTTTCATGTGCATCAATTTAAAAT TGATATTTATTTATTTTGTGCTGTCTGGGCTTTTCAATTTCTTCAGAGAAATCCTGGGAT CCTCTTCTTTCACCCTCGGATCTCATCCTCTGGACCTTCCATCTCTCTGGTTTCTTCCTC TGTAATTCAACTTATTATATGTACACACCGTCCTCTAAGATTTTGTGGATTCTTTACTTT GCAGGATCTGAAGGAGATTAAAAGGGGGTTAGACCATGGCAAGAGATCAGCTTCAG GTCCTCACCGCGCTAGATGTCGCCAAGACGCAGTGGTATCACTTCACGGCGATCGTGA TCGCCGGCATGGGGTTCTTTACCGACGCCTACGACC。

具体的，本申请通过PCR方式获得本申请的SEQ ID NO.2植物启动子方法为：以紫萍基因组总DNA为模板，扩增SpPHT1启动子2(紫萍SpPHT1基因启动子序列，SEQ ID NO.2)。PCR反应体系如下：DNA 2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，SpPHT1-Q2-F(SEQ ID No.6)1μL，dNTP(10mM each)1μL，SpPHT1-Q1-R(SEQ ID No.5)1μL，LA Taq 0.5μL， ddH₂O 17μL。PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，63.1℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。其中：SpPHT-Q2-F(SEQ ID No.6)核苷酸序列为：5’ -CCCAAGCTTTTGTGGTCGTGCGTGTGA-3’(5’端带有Hind III酶切位点)； SpPHT1-Q1-R(SEQ IDNo.5)核苷酸序列为：5’-GCTCTAGAGGTCGTAGGCGTCGGTAA-3’ (5’端带有XbaI酶切位点)。

作为优选，其具有(Ⅶ)、(Ⅷ)或(Ⅸ)所示的核苷酸序列中任意一个：

(Ⅶ)如SEQ ID NO.3所示；

(Ⅷ)与如SEQ ID NO.3所示序列具有至少50％同源性的序列；

(Ⅸ)如SEQ ID NO.3所示序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列。

本申请的植物启动子可以通过人工合成的方式获得，也可以通过PCR方式获得。具体的，本申请的第三个植物启动子，其序列为SEQ ID NO.3所示，命名为SpPHT1启动子1，SpPHT1启动子1的5’端比SpPHT1启动子2多了数个作用元件，SpPHT1启动子1的核苷酸序列为： ACTGGTAGTGCGGTATCCAGCAAGACAAGTGACAGCCAATTGGTGGCCTATATTAATC GTCGTTAGATCCAGAAGATCACTCCGAGGCGACTTCCGTCACGGCGGTGAGGACTTG CCGAGGAGTTTTGCCGAATTTCATACCGTCGTATCAAGCGGAAGCAGGGGTGGACGG AAGTTGAATTAGGAAGTTCGGCTGGGTCCCCGTCCTCACAAGTGTTGACTTTCAAGT TCAACACAGCGGATATTCCTTCATTTGATACCCATCCGAGGCCCACCACCTTGCCCCT CTCCCTCCCATAAGAATTCCTGGTTCTCCTCTTCCATGCAGCCAGTTCTCTCCCTTCCA TTCCATTATCCTCTCCCTCCCTCCCTCCCACCTTCCCATCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTGTTCCCTCCCTTCTTCCTGTTTGGCTGGACGTTCTTCGCGGTTGGAGAAGGTATGC TTCCGGAGTGAGTTGTGGATAATTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCTCTCGCTCTGTTAT CGGCCTGACTGTAGAAAGATCATGCGTTTGACGACTTGAACGCGGTCAAGAGAGGGT AGTTCAACAAGTTTGTGGTCGTGCGTGTGACGCTATCTAGTTAATTTTTTCAATCCATG CCGGATCATTTTTTTTTTCTAGCATTAGATAGCGGATTGGGGCACTCGTTGCTCCATCT CGGCTAATTTAACGAAATAATTGGAATGAGAGAGATGCTAAAAAAGGGGTCTTCCGTT TGGATAGTGATGCATCCCTCTGTCTCTCTCTCCTCCGGTAGGGCCTTCAAGGTTTTCGT TGAAACTCATCGGAAGATCAGTCTAAAGTTAAGGCAAGTGTCGTGTCGTCTTTCTCTC TCACGTTCCTGGACCCGTGATCGTTTGATTCCAGGAACTTTGGTGATCGATTGATTCTT GAGAGTCCAAAAATCGGTCAACGACTGCGAAATATTTTGAGCGGATTTTCATGTGCAT CAATTTAAAATTGATATTTATTTATTTTGTGCTGTCTGGGCTTTTCAATTTCTTCAGAGA AATCCTGGGATCCTCTTCTTTCACCCTCGGATCTCATCCTCTGGACCTTCCATCTCTCT GGTTTCTTCCTCTGTAATTCAACTTATTATATGTACACACCGTCCTCTAAGATTTTGTGG ATTCTTTACTTTGCAGGATCTGAAGGAGATTAAAAGGGGGTTAGACCATGGCAAGAG ATCAGCTTCAGGTCCTCACCGCGCTAGATGTCGCCAAGACGCAGTGGTATCACTTCAC GGCGATCGTGATCGCCGGCATGGGGTTCTTTACCGACGCCTACGACC。

具体的，本申请通过PCR方式获得本申请的SEQ ID NO.3植物启动子方法为：以紫萍基因组总DNA为模板，扩增SpPHT1启动子1(紫萍SpPHT1基因启动子序列，SEQ ID NO.3)。PCR反应体系如下：DNA 2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，SpPHT1-Q3-F(SEQ ID No.7)1μL，dNTP(10mM each)1μL，SpPHT1-Q1-R(SEQ ID No.5)1μL，LA Taq 0.5μL， ddH₂O 17μL。PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，63.1℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。其中：SpPHT-Q3-F(SEQ ID No.7)核苷酸序列为：5’ -CCCAAGCTTACTGGTAGTGCGGTATCC-3’(5’端带有Hind III酶切位点)； SpPHT1-Q1-R(SEQ IDNo.5)核苷酸序列为：5’-GCTCTAGAGGTCGTAGGCGTCGGTAA-3’ (5’端带有XbaI酶切位点)。

具体的，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2植物启动子在启动目的基因在植物的根组织特异性表达；SEQ ID NO.3植物启动子在启动目的基因在植物的根、茎组织特异性表达。

作为优选，所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、 10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17、18个、19个、20个、21个、22 个、23个、24个、25个、26个、27、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、 35个、36个、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65个核苷酸。

本申请第二方面公开了所述植物启动子在启动下游目的基因在植物中高效表达中的应用。

作为优选，所述植物选自紫萍、烟草或拟南芥。

作为优选，所述植物启动子在启动目的基因在在植物中表达具体为：所述植物启动子在启动目的基因在植物的根、茎或叶组织特异性表达。

本申请第三方面公开了一种表达载体，含有所述的植物启动子。具体的，所述表达载体可以为现有常规的表达载体，例如是重组T质粒植物表达载体。

本申请第四方面公开了一种宿主细胞，含有所述表达载体。

具体的，本申请启动的目的基因可以为有利于植物生长的基因，例如磷转运蛋白基因，磷转运蛋白是一种对磷(Pi)具有亲和力的转运蛋白，调节植物对磷的吸收和转运，对植物磷的利用率有相关影响。磷作为植物生长发育必需的大量营养素之一，约占植物干重的 0.2％。它在核酸和磷脂、能量代谢、代谢中间产物的激活、信号转导级联和酶的调节中作为结构元素发挥着各种基本的生物学功能，在植物中过表达有利于植物生长的基因，可以提高该植物的产量。

本申请第五方面公开了一种净化富营养化水体的方法，将含有上述宿主细胞的净化富营养化水体植物种植在富营养化水体中，所述宿主细胞包括上述植物启动子和促植物生长的目的基因。具体的，通过所述植物启动子促进净化富营养化水体植物在上述富营养化水体中大量生长，既能有效净化富营养化水体，又能提高净化富营养化水体植物的产量，从而保障农作户的经济收益等作用。

本申请公开的植物启动子来源于紫萍，本申请发现的植物启动子序列没有任何现有技术报道过，在GenBank等公开数据库也没有任何注释是启动子及何种特征的启动子。本发明为首次发现并鉴定该启动子的功能、启动效率。本发明首次克隆获得紫萍SpPHT1启动子(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)，利用植物转基因工程技术手段获得转基因植物，再通过组织化学染色、荧光分光光度法来测定报告基因GUS表达的位置和酶性，从而分析紫萍SpPHT1启动子的表达调控特点。本申请发现，本申请的紫萍SpPHT1 启动子序列中存在多种功能元件对调控下游目的基因表达密切相关，该结果可为净化富营养化水体及农作物育种提供一种新的基因资源。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本申请实施例SpPHT1启动子1的序列分析；其中AAGAA-motif：脱落酸响应元件；ABRE：脱落酸响应元件；ARE：诱导厌氧响应元件；Box 4：光响应元件；CAAT-box：启动子和增强子区域常见作用元件；CARE：赤霉素响应元件；CCGTCC-box：调控分生组织特异活性元件；CGTCA-motif：茉莉酸响应元件；ERE：乙烯响应元件；G-Box：光响应元件；G-box：光反应调节元件；MYB：干旱、高盐、低温响应元件；MYC：抗脱落酸响应元件；TATA-box：转录核心启动子元件；TCCC-motif：光响应元件；TGACG-motif：茉莉酸响应元件；GGTGC功能区(图中表示为Unnamed 1)：来自玉米，其功能未知； TSSP：转录起始点；

图2为本申请实施例提供的植物启动子(a为SpPHT1启动子3；b为SpPHT1启动子 2，c为SpPHT1启动子1)的电泳图；

图3为本申请实施例转基因烟草和野生型根的染色结果。a)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q1 的根、b)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q2的根、c)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q3的根、d)：转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121的根、e)：野生型WT烟草的根；

图4为本申请实施例转基因烟草和野生型茎的染色结果。a)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q1 的茎、b)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q2的茎、c)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q3的茎、d)：转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121的茎、e)：野生型WT烟草的茎；

图5为本申请实施例转基因烟草和野生型叶的染色结果。a)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q1 的叶、b)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q2的叶、c)：转基因烟草Z-SpPHT1-Q3的叶、d)：转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121的叶、e)：野生型WT烟草的叶；

图6为本申请实施例提供的BSA标准曲线；

图7为本申请实施例提供的MU标准曲线；

图8为本申请实施例转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121、转基因烟草Z-SpPHT1-Q1、Z-SpPHT1-Q2、Z-SpPHT1-Q3和野生型WT烟草在根、茎、叶三种不同组织中GUS酶活测定。

具体实施方式

本申请提供了一种新型植物启动子，该启动子能够在植物中根茎叶组织中特异性启动目的基因的高效表达。

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

其中，以下实施例所用原料或试剂为市售或自制。

实施例1的DNA提取试剂盒购自鼎国(北京)公司。LA Taq高保真酶购自Takara公司(广州)。

实施例2的DNA提取试剂盒购自鼎国(北京)公司。凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶Hind III和EcoR I、LA Taq高保真酶、克隆载体pMD19-T Vector都是购自Takara公司(广州)。实验所用的大肠杆菌由广东工业大学生物医药学院自制。

实施例3的LA Taq酶，限制性内切酶Hind III、EcoR I，T4-DNA连接酶都是购自日本Takara公司(广州)；抗生素：Kan(卡那霉素)、Rif(利福平)均购于北京普博欣生物公司；PBI121载体菌种、根癌农杆菌EHA105购于武汉淼灵生物科技有限公司。

实施例7的X-Gluc购于鼎国(北京)公司；4-MU、4-MUG购于麦克林公司；TU-1901 双光束紫外分光光度计、HuoroMax-4荧光分光光度计来自Thermo Scientific公司。实验所用的野生型烟草叶片由广东工业大学生物医药学院提供。

本申请实施例所用紫萍从广东省广州市珠江流域捕捞，然后经过实验室酒精清洁处理后无菌培育得到。

实施例1

本申请实施例提供了利用CTAB法提紫萍基因组总DNA，具体步骤如下：

1、取0.1g紫萍，不断加入液氮进行研磨，直至呈粉末状。

2、取800μL的Buffer GP1加入1.5mL灭菌的离心管中，置于金属水浴锅65℃下预热1分钟，然后加入0.8μL的β-Mercaptoethanol混匀。

3、将磨好的粉末加到以上准备的Buffer GP1中，65℃水浴30分钟，过程中每5分钟颠倒混匀样品一次。

4、向上述步骤2中的离心管加入500μl的氯仿，上下震荡3min。12000rpm，室温，离心5分钟。

5、小心吸取上层水相转入新的1.5mL离心管，700μL Buffer GP2，混匀。

6、将步骤5中混匀的液体分2次(每次不超过700μL)加入新的离心柱中，12000rpm，室温，离心1分钟。

7、将收集管中的滤液再次转入离心柱中，12000rpm，室温，离心1分钟，弃废液。

8、向离心柱中加入700μL Buffer WP1，12000rpm，室温，离心1分钟，尽量除净滤液。

9、向离心柱中继续加入700μL Buffer WP2，12000rpm，室温，离心1分钟，尽量除净滤液。

10、重复步骤9。

11、将步骤10中的离心管再次进行12000rpm，室温，离心2分钟。然后将离心柱置于新的1.5mL离心管中，室温静置管中没有无明显乙醇味即可。

12、向离心柱中加入已60℃预热50μL灭菌水，室温静置2分钟。12000rpm，室温，离心2分钟。

13、将上述溶液再转如步骤12中的离心柱，室温条件下静置1分钟。12000rpm，室温，离心2分钟，得到的溶液即为DNA样品。

实施例2

本申请实施例提供了植物启动子(下称SpPHT1启动子1，其序列为SEQ ID NO.3)的克隆，方法如下：

根据NCBI基因组数据中提供的紫萍序列(登陆号：PRJNA205940)，设计特异引物，扩增预测的SpPHT1基因上游序列，引物序列如下：

SpPHT-Q3-F(SEQ ID No.7)5’-CCCAAGCTTACTGGTAGTGCGGTATCC-3’；

SpPHT1-Q1-R(SEQ ID No.5)5’-GCTCTAGAGGTCGTAGGCGTCGGTAA-3’(SEQ IDNo.6)。

以紫萍基因组DNA为模板，扩增紫萍SpPHT1启动子1片段，PCR扩增反应体系如下：DNA 2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，SpPHT-Q3-F和/SpPHT1-Q1-R各1μL，dNTP(10 mM each)1μL，LA Taq 0.5μL，ddH₂O 17μL。PCR扩增反应条件如下：95℃预变性3min； 95℃变性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

将扩增得到的SpPHT1启动子1片段用1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图2的c所示，送样测序得知本申请SpPHT1启动子1序列长度为1331bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

将所得SpPHT1启动子1序列利用软件 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)和TSSP-TCM (http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝tssp&group＝programs&subgroup＝promoter)进行分析，预测SpPHT1启动子1序列中存在的顺式作用元件和转录起始位点位置。

SpPHT1启动子1的顺式作用元件和转录起始位点信息如图1所示，图1的启动子元件分析分析了SpPHT1启动子起始密码子ATG上游序列。图1可知，SpPHT1启动子1序列中存在：核心元件(CAAT-box、TATA-box)、光响应元件(Box 4、G-Box、G-box、 TCCC-motif)、激素响应元件(ABRE、TGACG-motif、ERE)、逆境调控元件(ARE)、分生组织特异性元件(CCGTCC-box)、其他功能元件(AAGAA-motif、GGTGC功能区)等。

实施例3

本申请实施例提供了植物启动子(下称SpPHT1启动子2，其序列为SEQ ID NO.2)的克隆，方法如下：

以上述得到的SpPHT1启动子1的SEQ ID NO.3序列为模板设计特异性引物，扩增SpPHT1启动子2片段。

其中：SpPHT-Q2-F(SEQ ID No.6)核苷酸序列为：5’ -CCCAAGCTTTTGTGGTCGTGCGTGTGA-3’(5’端带有Hind III酶切位点)； SpPHT1-Q1-R(SEQ IDNo.5)核苷酸序列为：5’-GCTCTAGAGGTCGTAGGCGTCGGTAA-3’ (5’端带有XbaI酶切位点)。

以紫萍基因组总DNA为模板，扩增得到SpPHT1启动子2片段。

PCR反应体系如下：DNA 2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，SpPHT-Q2-F和SpPHT1-Q1-R各1μL，dNTP(10mM each)1μL，LA Taq 0.5μL，ddH₂O 17μL。PCR扩增反应条件如下： 95℃预变性3min；95℃变性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

PCR扩增条件：SpPHT1启动子2片段：95℃预变性3min；95℃变性30s，63.9℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

将PCR产物切胶回收后，与pMD19-T载体相连接成为重组T质粒，利用CaCl₂法将重组T质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定及送样测序。将扩增得到的启动子缺失片段用1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图2的b所示，送样测序得知SpPHT1启动子2片段序列长度为739bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.2。

实施例4

本申请实施例提供了植物启动子(下称SpPHT1启动子3，其序列为SEQ ID NO.1)的克隆，方法如下：

以上述得到的SpPHT1启动子1的SEQ ID NO.3序列为模板设计特异性引物，扩增SpPHT1启动子3片段。

其中：SpPHT-Q1-F(SEQ ID No.4)核苷酸序列为：5’ -CCCAAGCTTGGGCACTCGTTGCTCCAT-3’(5’端带有Hind III酶切位点)； SpPHT1-Q1-R(SEQ IDNo.5)核苷酸序列为：5’-GCTCTAGAGGTCGTAGGCGTCGGTAA-3’ (5’端带有XbaI酶切位点)。

以紫萍基因组总DNA为模板，扩增得到SpPHT1启动子2片段。

PCR反应体系如下：DNA 2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，SpPHT-Q1-F和SpPHT1-Q1-R各1μL，dNTP(10mM each)1μL，LA Taq 0.5μL，ddH₂O 17μL。PCR扩增反应条件如下： 95℃预变性3min；95℃变性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

PCR扩增条件：SpPHT1启动子3片段：95℃预变性3min；95℃变性30s，63.9℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

将PCR产物切胶回收后，与pMD19-T载体相连接成为重组T质粒，利用CaCl₂法将重组T质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定及送样测序。将扩增得到的启动子缺失片段用1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图2的a所示，送样测序得知SpPHT1启动子3片段序列长度为653bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1。

实施例5

本申请实施例提供了构建SpPHT1启动子1片段植物表达载体试验，具体步骤包括：

1、酶切反应：利用Hind III和EcoR I这两种限制性内切酶，将重组T质粒与pBI121载体质粒分别进行酶切，切胶回收得到纯化的目的片段，分别得到SpPHT1启动子1片段和缺少启动子的pBI121载体，酶切反应体系如下：重组T质粒(pBI121质粒)20μL，HindIII 1μL，EcoR I 1μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O 3μL。反应条件：37℃反应22h。

2、酶连接反应：利用T4-DNA连接酶将实施例2的SpPHT1启动子1片段与采用相同的限制性核酸内切酶酶切后的PBI121载体目的片段连接。连接反应体系如下：SpPHT1 启动子1片段4μL，pBI121载体的目的片段10μL，T4 Buffer 2μL，T4 Ligation 1μL，ddH₂O 3μL。反应条件：16℃反应过夜。

将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂平板生长，通过抗性筛选和单菌落 PCR来鉴定，(筛选培养基：50mg/L Kan的LB固体培养基)。经抗性筛选确定的阳性转化子进行摇菌扩增，提取菌液质粒，再进行双酶切的鉴定。将构建完成的表达载体命名为PBI121-SpPHT1-Q3。

3、农杆菌的转化鉴定：

(1)将构建的表达载体PBI121-SpPHT1-Q3质粒和PBI121载体质粒导入农杆菌EHA105 的感受态细胞中，充分混合，冰上静置30分钟。

(2)然后立即将步骤(1)中的离心管置于液氮5分钟，水浴加热37℃，5分钟。

(3)加入500ul YEB液体培养基，于180r/min、28℃、振荡培养4h。

(4)5000rpm，室温，离心5分钟，留200ul菌液，取50μL，100μL分别涂于LB固体培养基(含50mg/L Kan和50mg/L Rif)，30℃、黑暗条件、培养至长出菌落。

(5)挑单个菌落进行PCR鉴定。

(6)将上述筛选通过的单菌落，混入25ml的LB液体培养基(含50mg/L Kan和50mg/LRif)，200r/min、28℃振荡过夜。

(7)取部分菌液提取质粒，并做质粒PCR鉴定。

(8)将经过提菌液质粒PCR鉴定的阳性克隆子摇菌扩增，加入甘油(20％的终浓度)，放置于-80℃超低温保存箱中保存备用，得到连上SpPHT1启动子1的pBI121载体(SpPHT1 启动子1连在GUS基因上游)，重组载体命名为Z-SpPHT1-Q3。

实施例6

本申请实施例提供了构建SpPHT1启动子2片段植物表达载体试验，具体步骤包括：

1、酶切反应：利用Hind III和EcoR I这两种限制性内切酶，将重组T质粒与pBI121载体质粒分别进行酶切，切胶回收得到纯化的目的片段，分别得到SpPHT1启动子2片段和缺少启动子的pBI121载体，酶切反应体系如下：重组T质粒(pBI121质粒)20μL，HindIII 1μL，EcoR I 1μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O 3μL。反应条件：37℃反应22h。

2、酶连接反应：利用T4-DNA连接酶将实施例3的SpPHT1启动子2片段与采用相同的限制性核酸内切酶酶切后的PBI121载体目的片段连接。连接反应体系如下：SpPHT1 启动子2片段4μL，pBI121载体的目的片段10μL，T4 Buffer 2μL，T4 Ligation 1μL，ddH₂O 3μL。反应条件：16℃反应过夜。

将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂平板生长，通过抗性筛选和单菌落 PCR来鉴定，(筛选培养基：50mg/L Kan的LB固体培养基)。经抗性筛选确定的阳性转化子进行摇菌扩增，提取菌液质粒，再进行双酶切的鉴定。将构建完成的表达载体命名为PBI121-SpPHT1-Q2。

3、农杆菌的转化鉴定：

(1)将构建的表达载体PBI121-SpPHT1-Q2质粒和PBI121载体质粒导入农杆菌EHA105 的感受态细胞中，充分混合，冰上静置30分钟。

(3)加入500ul YEB液体培养基，于180r/min、28℃、振荡培养4h。

(5)挑单个菌落进行PCR鉴定。

(7)取部分菌液提取质粒，并做质粒PCR鉴定。

(8)将经过提菌液质粒PCR鉴定的阳性克隆子摇菌扩增，加入甘油(20％的终浓度)，放置于-80℃超低温保存箱中保存备用，得到连上SpPHT1启动子2的pBI121载体(SpPHT1 启动子2连在GUS基因上游)，重组载体命名为Z-SpPHT1-Q2。

实施例7

本申请实施例提供了构建SpPHT1启动子3片段植物表达载体试验，具体步骤包括：

1、酶切反应：利用Hind III和EcoR I这两种限制性内切酶，将重组T质粒与pBI121载体质粒分别进行酶切，切胶回收得到纯化的目的片段，分别得到SpPHT1启动子3片段和缺少启动子的pBI121载体，酶切反应体系如下：重组T质粒(pBI121质粒)20μL，HindIII 1μL，EcoR I 1μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O 3μL。反应条件：37℃反应22h。

2、酶连接反应：利用T4-DNA连接酶将实施例4的SpPHT1启动子3片段与采用相同的限制性核酸内切酶酶切后的PBI121载体目的片段连接。连接反应体系如下：SpPHT1 启动子3片段4μL，pBI121载体的目的片段10μL，T4 Buffer 2μL，T4 Ligation 1μL，ddH₂O 3μL。反应条件：16℃反应过夜。

将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂平板生长，通过抗性筛选和单菌落 PCR来鉴定，(筛选培养基：50mg/L Kan的LB固体培养基)。经抗性筛选确定的阳性转化子进行摇菌扩增，提取菌液质粒，再进行双酶切的鉴定。将构建完成的表达载体命名为PBI121-SpPHT1-Q1。

3、农杆菌的转化鉴定：

(1)将构建的表达载体PBI121-SpPHT1-Q1质粒和PBI121载体质粒导入农杆菌EHA105 的感受态细胞中，充分混合，冰上静置30分钟。

(3)加入500ul YEB液体培养基，于180r/min、28℃、振荡培养4h。

(5)挑单个菌落进行PCR鉴定。

(7)取部分菌液提取质粒，并做质粒PCR鉴定。

(8)将经过提菌液质粒PCR鉴定的阳性克隆子摇菌扩增，加入甘油(20％的终浓度)，放置于-80℃超低温保存箱中保存备用，得到连上SpPHT1启动子3的pBI121载体(SpPHT1 启动子3连在GUS基因上游)，重组载体命名为Z-SpPHT1-Q1。

实施例8

本申请实施例提供了采用叶盘法获得阳性对照含PBI121表达载体农杆菌的转基因烟草，其中PBI121表达载体的启动子为CaMV35s；阴性对照野生型烟草；含Z-SpPHT1-Q1表达载体农杆菌转化烟草、含Z-SpPHT1-Q2表达载体农杆菌转化烟草和含Z-SpPHT1-Q3 表达载体农杆菌转化烟草，然后表达模式分析，包括以下步骤：

1、农杆菌活化：

(1)分别取上述实施例制得的Z-SpPHT1-Q1表达载体与农杆菌；Z-SpPHT1-Q2表达载体与农杆菌；Z-SpPHT1-Q3表达载体与农杆菌；PBI121商业购买表达载体与农杆菌置于25ml的LB液体培养基(含50mg/L Kan和50mg/L Rif)，200r/min、28℃振荡过夜，一次活化。

(2)分别取1ml上述菌液，置于20ml YEB液体培养基，180r/min、28℃摇床振荡至菌液OD600＝0.5-0.7，二次活化。

2、烟草叶片侵染：

(1)分别挑取生长30天的烟草无菌苗，用剪刀剪成1cm×1cm正方形烟草叶盘外植体。

(2)分别将部分烟草叶盘外植体投入到上述准备好的农杆菌中，浸泡10-15分钟。

(3)浸泡完后，取出叶片放至无菌的滤纸，吸收附着的菌液。

3、共培养：

(1)部分侵染烟草叶盘外植体放在共培养基，每瓶子放4-5片叶盘外植体，黑暗、温室、培养3天。

(2)部分未侵染烟草叶盘外植体放在共培养基，对照用于检测培养基有效性。

4、选择培养：

(1)经过共培养两天的叶盘外植体分别取出，无菌水洗涤2-3分钟，再放入含有400mg/L Tim的MS培养基中浸泡10分钟，期间不断振荡，并且每步洗涤两次，以便洗掉叶盘外植体周围附着的农杆菌。

(2)洗好的叶盘外植体置于干燥的无菌滤纸晾干，然后叶面朝上放置于选择培养基上，光照、温室培养，选择培养基约2-3周继代一次。

(3)部分未侵染烟草叶盘外植体放在选择培养基，对照实验检测抗生素有效性。

5、生根培养：

(1)当经过抗性筛选的烟草嫩芽长至1-1.5cm时，用灭菌剪刀将芽全部剪下，插入生根培养基中进行诱导生根。

(2)待生根后，即可放置于生长培养基中，光照、温室培养，生长培养基30d继代一次，转基因的植株分别命名为Z-SpPHT1-PBI121、Z-SpPHT1-Q1(含SpPHT1启动子3)、 Z-SpPHT1-Q2(含SpPHT1启动子2)、Z-SpPHT1-Q3(含SpPHT1启动子1)。

6、转基因烟草PCR检测

提取转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121、Z-SpPHT1-Q1、Z-SpPHT1-Q2、Z-SpPHT1-Q3和野生型烟草基因组DNA，实验以对应的表达载体质粒为阳性对照；以未转基因野生型烟草为阴性对照，然后进行PCR扩增检验目的基因片段是否转入烟草。

7、转基因烟草GUS组织化学染色法定性分析

分别提取转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121、Z-SpPHT1-Q1、Z-SpPHT1-Q2、Z-SpPHT1-Q3和野生型烟草的根、茎、叶三个组织，实验以对应的转化PBI121载体的转基因烟草 Z-SpPHT1-PBI121作为阳性对照，以对应的未转化的野生型烟草WT作为阴性对照，采用组织化学染色法，研究启动子缺失片段对于下游GUS基因在转基因烟草根、茎、叶三个不同组织中的调控表达情况。组织化学染色法具体步骤如下：

(1)将上述的5种转基因植株，标记清楚，取样，其中：根取5-8根，茎处理成1cm左右长，叶处理成1×1cm的正方形，放入10ml的离心管。

(2)向步骤1中的离心管中加入GUS染色液(完全浸没植物样品为止)。

(3)置于37℃培养箱中过夜反应(最长不超过14h)。

(4)小心取出植物样品置于培养皿中，加入70％乙醇进行脱色30分钟，然后再加入无水乙醇进行脱色(完全褪去叶绿素为止)，期间不断更换无水乙醇。

(5)最后植物样品用水保存，在体式显微镜下进行观察，拍照记录保存数据。

8、转基因烟草GUS荧光定量分析

GUS酶可催化底物MUG反应，产生荧光物质MU。利用荧光分光光度计设置激发波长为365nm，发射波长为456nm，狭缝3nm的条件下定量检测。得到的单位质量植物蛋白在单位时间内产生荧光物质的量称为GUS酶活性。计算公式如下：

本实施例提取转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121、Z-SpPHT1-Q2、Z-SpPHT1-Q3、 Z-SpPHT1-Q4和野生型烟草的根、茎、叶三个不同组织，以对应的转化PBI121载体的转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121作为阳性对照，以对应的未转化的野生型烟草作为阴性对照，研究启动子缺失片段对于下游GUS基因在转基因烟草根、茎、叶三个不同组织表达调控，具体步骤如下：

9、蛋白标准曲线的制备：

将1mg/ml BSA标准液配制不同浓度梯度BSA溶液，体系如下表1所示:

表1 BSA梯度稀释体系

BSA(μl)	0	2	4	8	12	16	20
								去离子水(μl)	1000	998	996	992	988	984	980
终浓度(mg/L)	0	2	4	8	12	16	20

取上述不同浓度样品800μL和考马斯亮蓝G250染液200μL加入石英比色皿，室温静置2分钟，测定不同浓度样品对应的吸收值，用Origin9.0软件绘制标准曲线。

10、MU标准曲线制作：

用0.2mol/L Na₂CO₃反应终止液配制不同浓度MU溶液，体系如下表2所示:

表2 MU梯度稀释体系

1mmol/L MU(μl)	0	0.01	0.5	1	5	10
							反应终止液(μl)	1000	999.9	999.5	999	995	990
终浓度(mmol)	0	0.1	0.5	1	5	10

取上述溶液不同浓度的样品加入干净的石英比色皿，放入荧光分光光度计，调置激发光365nm，发射光455nm，狭缝3nm，测定不同浓度的样对应的品荧光值，用Origin9.0 软件绘制标准曲线。

11、植物总蛋白的提取

(1)用液氮将转基因烟草的根茎叶速冻标号保存，研磨后各取0.1g样品置于1.5mL离心管(1ml GUS提取缓冲液)，充分混匀，12000rpm，4℃，离心10分钟。

(2)上清液为蛋白样品，吸取转运到1.5mL灭菌的离心管待用。

4.4样品的蛋白含量测定

取蛋白样品上清20μL、灭菌水20μL、考马斯亮蓝G250溶液960μL于干净的石英比色皿，室温静置2分钟。放入紫外分光光度计，调置595nm波长的光源，根据计算的蛋白标准曲线可以求出不同样品中的蛋白量。

12、样品的GUS酶活性测定

(1)取20μl待测样品上清(吸取样品的体积根据测定的蛋白含量进行调整)加入至480μl 的2mmol/L 4-MUG反应缓冲液(37℃预热)，混匀，立即取20μl加入至980μl的0.2mol/L Na₂CO₃反应终止液，此时刻记为酶促反应的0min；

(2)在20min、40min分别取出上述的100μl反应液，加入至900μl的0.2mol/L Na₂CO₃反应终止液；

(3)利用荧光分光光度计，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝3nm的条件下，测定不同时刻荧光值(每个样品设置三个重复)，计算出单位时间酶活变化率。

对5种转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121、Z-SpPHT1-Q1、Z-SpPHT1-Q2、Z-SpPHT1-Q3 和野生型烟草的根、茎、叶组织进行GUS组织化学法染色分析，如图3、图4、图5所示，结果表明：阳性对照Z-SpPHT1-PBI121转基因烟草的根、茎、叶组织均出现蓝色斑点；含 SpPHT1启动子3的Z-SpPHT1-Q1转基因烟草的根中出现蓝色斑点，而茎和叶中没有蓝色；含SpPHT1启动子2的Z-SpPHT1-Q2转基因烟草的根中出现蓝色斑点，而茎和叶中没有蓝色；含SpPHT1启动子1的Z-SpPHT1-Q3转基因烟草的根和茎中出现蓝色斑点，而叶中没有蓝色；阴性对照WT野生型烟草的根、茎、叶组织均未被染色。

根据上述表1配制不同浓度梯度BSA溶液，在双光束紫外分光光度计上测量液体在波长为595nm处吸收值。以不同浓度梯度BSA为横坐标，以不同浓度标准品在595nm光吸收值为纵坐标，绘制BSA的标准曲线(如图6所示)。蛋白的标准曲线的R²＝0.999≈1，说明蛋白的浓度与波长为595nm光吸收值具备线性相关性，所以可以先测出样品的吸收光值根据蛋白的标准曲线来计算对应样品的蛋白浓度。

根据上述表2配制不同MU梯度稀释体系，在荧光分光光度计，激发光365nm，发射光455nm，狭缝3nm的条件下，测定不同样品荧光值，以不同浓度梯度MU为横坐标，样品的荧光值为纵坐标，绘制MU标准曲线(如图7所示)。MU的标准曲线的R²＝0.995≈1，说明不同MU的浓度与样品荧光值具备线性相关性，所以可以先测出样品的荧光值根据 MU的标准曲线来计算对应样品的MU浓度。

对5种转基因烟草Z-SpPHT1-PBI121、Z-SpPHT1-Q1、Z-SpPHT1-Q2、Z-SpPHT1-Q3 和野生型烟草的根、茎、叶组织进行进行GUS酶活性分析，如图8所示，结果表明：GUS 定量检测结果与GUS组化染色结果基本一致，在根中，含SpPHT1启动子2片段和SpPHT1 启动子3片段的GUS活性较弱，仅为阳性对照的22％和42％，随着启动子长度的增加， GUS活性也逐渐增强，含SpPHT1启动子1片段的植物GUS酶活性最高，为阳性对照的 85％；在茎中，含SpPHT1启动子2片段和SpPHT1启动子3片段的转基因烟草根中的GUS 酶活几乎没有表达，只在含SpPHT1启动子1片段的植物中有表达，为阳性对照的27％；在叶中，3种SpPHT1启动子片段未能调控GUS基因在转基因植物叶中进行表达。

对上述结果进行分析，随着启动子缺失片段的长度逐渐增加，启动子的活性越强。而 3种SpPHT1启动子中只有含有SpPHT1启动子1片段的植物可以使得基因在茎中特异性表达，结合SpPHT1基因启动子中顺式作用元件预测可知(图1)，在启动子上游1368+的确存在调控分生组织特异活性的功能元件CCGTCC-box，结合GUS组化和定量检测表明， SpPHT1启动子1片段中存在根、茎组织特异性表达元件的功能元件，因此，SpPHT1启动子1片段能启动目的基因在根和茎组织的特异性表达。通过研究发现，本申请的紫萍 SpPHT1基因启动子序列中存在多种功能元件对调控下游基因表达密切相关，结果为紫萍 SpPHT1基因启动子的克隆和转基因提供了重要理论基础和实际手段，对启动子活性分析的应用提供参考。

以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 广东工业大学

<120> 一种植物启动子及其应用

<130> MP2013688

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 653

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

gggcactcgt tgctccatct cggctaattt aacgaaataa ttggaatgag agagatgcta 60

aaaaaggggt cttccgtttg gatagtgatg catccctctg tctctctctc ctccggtagg 120

gccttcaagg ttttcgttga aactcatcgg aagatcagtc taaagttaag gcaagtgtcg 180

tgtcgtcttt ctctctcacg ttcctggacc cgtgatcgtt tgattccagg aactttggtg 240

atcgattgat tcttgagagt ccaaaaatcg gtcaacgact gcgaaatatt ttgagcggat 300

tttcatgtgc atcaatttaa aattgatatt tatttatttt gtgctgtctg ggcttttcaa 360

tttcttcaga gaaatcctgg gatcctcttc tttcaccctc ggatctcatc ctctggacct 420

tccatctctc tggtttcttc ctctgtaatt caacttatta tatgtacaca ccgtcctcta 480

agattttgtg gattctttac tttgcaggat ctgaaggaga ttaaaagggg gttagaccat 540

ggcaagagat cagcttcagg tcctcaccgc gctagatgtc gccaagacgc agtggtatca 600

cttcacggcg atcgtgatcg ccggcatggg gttctttacc gacgcctacg acc 653

<210> 2

<211> 739

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

ttgtggtcgt gcgtgtgacg ctatctagtt aattttttca atccatgccg gatcattttt 60

tttttctagc attagatagc ggattggggc actcgttgct ccatctcggc taatttaacg 120

aaataattgg aatgagagag atgctaaaaa aggggtcttc cgtttggata gtgatgcatc 180

cctctgtctc tctctcctcc ggtagggcct tcaaggtttt cgttgaaact catcggaaga 240

tcagtctaaa gttaaggcaa gtgtcgtgtc gtctttctct ctcacgttcc tggacccgtg 300

atcgtttgat tccaggaact ttggtgatcg attgattctt gagagtccaa aaatcggtca 360

acgactgcga aatattttga gcggattttc atgtgcatca atttaaaatt gatatttatt 420

tattttgtgc tgtctgggct tttcaatttc ttcagagaaa tcctgggatc ctcttctttc 480

accctcggat ctcatcctct ggaccttcca tctctctggt ttcttcctct gtaattcaac 540

ttattatatg tacacaccgt cctctaagat tttgtggatt ctttactttg caggatctga 600

aggagattaa aagggggtta gaccatggca agagatcagc ttcaggtcct caccgcgcta 660

gatgtcgcca agacgcagtg gtatcacttc acggcgatcg tgatcgccgg catggggttc 720

tttaccgacg cctacgacc 739

<210> 3

<211> 1331

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

actggtagtg cggtatccag caagacaagt gacagccaat tggtggccta tattaatcgt 60

cgttagatcc agaagatcac tccgaggcga cttccgtcac ggcggtgagg acttgccgag 120

gagttttgcc gaatttcata ccgtcgtatc aagcggaagc aggggtggac ggaagttgaa 180

ttaggaagtt cggctgggtc cccgtcctca caagtgttga ctttcaagtt caacacagcg 240

gatattcctt catttgatac ccatccgagg cccaccacct tgcccctctc cctcccataa 300

gaattcctgg ttctcctctt ccatgcagcc agttctctcc cttccattcc attatcctct 360

ccctccctcc ctcccacctt cccatcctct ctctctctct ctctctctgt tccctccctt 420

cttcctgttt ggctggacgt tcttcgcggt tggagaaggt atgcttccgg agtgagttgt 480

ggataattct ctctctctct ctctctcgct ctcgctctgt tatcggcctg actgtagaaa 540

gatcatgcgt ttgacgactt gaacgcggtc aagagagggt agttcaacaa gtttgtggtc 600

gtgcgtgtga cgctatctag ttaatttttt caatccatgc cggatcattt tttttttcta 660

gcattagata gcggattggg gcactcgttg ctccatctcg gctaatttaa cgaaataatt 720

ggaatgagag agatgctaaa aaaggggtct tccgtttgga tagtgatgca tccctctgtc 780

tctctctcct ccggtagggc cttcaaggtt ttcgttgaaa ctcatcggaa gatcagtcta 840

aagttaaggc aagtgtcgtg tcgtctttct ctctcacgtt cctggacccg tgatcgtttg 900

attccaggaa ctttggtgat cgattgattc ttgagagtcc aaaaatcggt caacgactgc 960

gaaatatttt gagcggattt tcatgtgcat caatttaaaa ttgatattta tttattttgt 1020

gctgtctggg cttttcaatt tcttcagaga aatcctggga tcctcttctt tcaccctcgg 1080

atctcatcct ctggaccttc catctctctg gtttcttcct ctgtaattca acttattata 1140

tgtacacacc gtcctctaag attttgtgga ttctttactt tgcaggatct gaaggagatt 1200

aaaagggggt tagaccatgg caagagatca gcttcaggtc ctcaccgcgc tagatgtcgc 1260

caagacgcag tggtatcact tcacggcgat cgtgatcgcc ggcatggggt tctttaccga 1320

cgcctacgac c 1331

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

cccaagcttg ggcactcgtt gctccat 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 5

gctctagagg tcgtaggcgt cggtaa 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 6

cccaagcttt tgtggtcgtg cgtgtga 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 7

cccaagctta ctggtagtgc ggtatcc 27

Claims

1.一种植物启动子，其特征在于，所述植物启动子的序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3任一所示。

2.权利要求1所述的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的植物启动子在烟草的根中启动目的基因表达的应用。

3.权利要求1所述的序列为SEQ ID NO.3的植物启动子在烟草的根或茎中启动目的基因表达的应用。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求1所述的植物启动子。