CN102250922A - 蝴蝶兰FT基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蝴蝶兰FT基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列。另外，本发明还公开了获取蝴蝶兰FT基因基因克隆的方法。同时，本发明提供了一种用于检测蝴蝶兰FT基因在低温诱导出的蝴蝶兰花芽的不同发育阶段的表达量的方法。本发明提供的蝴蝶兰FT基因，不仅有利于揭示低温诱导蝴蝶兰花芽分化与发育的分子机制，还可为基因工程改良植物的生命进程，尤其是植物的花期调控提供了一定的依据。

Description

蝴蝶兰FT基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列

技术领域

本发明属于分子生物学中的基因领域，具体涉及蝴蝶兰FT（Flowering locus T）基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列。

背景技术

遗传分析表明，小麦和大麦在春化过程中，有3个基因控制着其对春化的需求，这3个基因分别是VRN1，VRN2和FT（Flowering locus T，简称FT）（VRN3）（Trevaskis et al., 2007）。近年来，FT基因已在多种植物中被克隆鉴定，然而在兰科（Orchidaceae）植物中，尤其在蝴蝶兰中鲜有报道。

蝴蝶兰属于兰科蝴蝶兰属(Phalaenopsis)植物，其体态轻盈，花色艳丽，色泽丰富，具有极高的观赏和经济价值。由于大部分蝴蝶兰品种的花期在3-5月份，为提高商品价值，必须调节蝴蝶兰的花期，使其达到全年开花，特别是应中国传统节日春节开花。研究表明，蝴蝶兰的花芽分化和发育主要受温度的调节，成熟植株经夜温15-20℃，日温20-25℃处理，才能进行花芽分化和发育（小西国义等，1996）。蝴蝶兰的花期调节方法主要采用空调和高山低温处理等，其中高山低温处理催花效果好，已广泛应用于生产。因此，弄清蝴蝶兰如何对低温的响应，特别是生理生化方面的响应已经引起科学界的普遍关注。然而，低温诱导蝴蝶兰花芽分化与发育的基因调控机制的研究尚无报道。

本研究以在低温环境下诱导的蝴蝶兰花芽为检测方（tester），以在常温条件下生长的蝴蝶兰的顶端生长组织为驱动方（driver），先构建正向抑制消减杂交文库，然后随机挑取克隆进行测序，根据测序结果并在NCBI数据库进行Blast比对分析，获得了蝴蝶兰的FT（Flowering locus T）的基因序列，希望为低温诱导蝴蝶兰花芽分化与发育的基因调控机制提供一定的依据。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种蝴蝶兰FT基因的cDNA序列。

本发明所解决的技术问题在于提供一种蝴蝶兰FT基因的cDNA序列编码的氨基酸序列。

本发明所解决的技术问题在于提供一种获取蝴蝶兰FT基因克隆的方法。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种分离出的蝴蝶兰FT基因的cDNA序列，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

所述的蝴蝶兰FT基因的cDNA序列，该cDNA序列包含5’端非编码区1bp-58bp、蛋白编码区59bp-589bp和3’端非编码区590bp-809bp，编码包含176个氨基酸的多肽。

另一方面，本发明还提供了蝴蝶兰FT基因的cDNA序列编码的多肽，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

另外，本发明还提供了一种获取蝴蝶兰FT基因克隆的方法。具体而言，本发明以蝴蝶兰杂交种Phalaenopsis hybrida cv. Fortune saltman的成熟植株为材料，分别置于常温温棚（白天28±3 ℃，湿度70-95%；夜晚25±1.5 ℃，湿度100%）和低温温棚（白天28±3 ℃，湿度70-95%；夜晚21±1.5 ℃，湿度100%）中种植，其栽培和施肥管理都一样。低温温棚中的植株在40-60天内，分化出0-40 mm大小不等的花芽，而常温温棚中的植株仍然处于营养生长阶段。因此，以40 mm蝴蝶兰花芽为检测方（tester），以常温温棚下生长的蝴蝶兰顶端生长组织为驱动方（driver），分别提取总RNA，再根据SMART^TM PCR cDNASynthesis Kit和PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit（Clontech，USA）的操作步骤构建低温诱导蝴蝶兰花芽的正向抑制削减文库，如图1-图5，然后随机挑取阳性克隆进行测序，这些表达序列标签（EST）编码各种不同功能的蛋白，其中之一在NCBI数据库中匹配到Flowering locus T（FT）基因。该cDNA序列全长为809bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框为从5’端第59位至第589位碱基，共531bp，其编码的蛋白的氨基酸序列具有176个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示。

将蝴蝶兰的FT基因的cDNA序列在NCBI数据库进行搜索，如表1所示的同源性比较结果表明该FT基因与文心兰（Oncidium Gower Ramsey）的FT基因同源性高达89%，以及与春兰（Cymbidium goeringii）FT基因同源性高达87%，同时，将蝴蝶兰的FT基因编码的蛋白在NCBI进行比对，结果显示如图6，具有FT类蛋白的PEBP_euk保守结构域。

本发明还提供了一种用于检测蝴蝶兰FT基因在低温诱导出的蝴蝶兰花芽的不同发育阶段的表达量的方法，包括如下述步骤：

分别提取了不同发育阶段的蝴蝶兰花芽的总RNA，再将不同花芽的RNA分别反转录为cDNA第一链；

根据核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为120bp的特异区段：

FT-F：5’- ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG-3’ <SEQ ID NO.3>，

FT-R：5’- CGACTGGCGAACCGAGATTA-3’<SEQ ID NO.4>，

以蝴蝶兰的actin(AY134752.1)作为内参基因，设计特异引物：

actin-F：5’- CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ <SEQ ID NO.5>，

actin-R：5’- TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ <SEQ ID NO.6>，

扩增长为139 bp目的片段；

根据Real-time PCR试验结果，获得FT基因在低温诱导出的蝴蝶兰花芽的不同发育阶段的表达量。

在本发明的实施例中，是通过分别提取了0-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-35 mm大小的蝴蝶兰花芽的总RNA，再将不同花芽的RNA（1ｕg）分别反转录为cDNA第一链；

根据核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为120bp的特异区段：

FT-F：5’- ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG-3’ <SEQ ID NO.3>，

FT-R：5’- CGACTGGCGAACCGAGATTA-3’<SEQ ID NO.4>，

以蝴蝶兰的actin(AY134752.1)作为内参基因，设计特异引物：

actin-F：5’- CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ <SEQ ID NO.5>，

actin-R：5’- TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ <SEQ ID NO.6>，

扩增长为139 bp目的片段，其中，蝴蝶兰的actin(AY134752.1)作为内参基因是通过登录GenBank而获取；

根据Real-time PCR试验结果，如图7所示，判断FT基因在低温诱导出的蝴蝶兰花芽的不同发育阶段的表达量。从图7可以看出，与在常温的顶端生长组织（STM）的表达量相比，蝴蝶兰FT基因在0-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-35 mm花芽中的表达量都升高，其中在0-3、3-5、5-10、10-15和15-20 mm的花芽中表达量都极显著上升，在20-35 mm的花芽中表达量显著上升；在0-3 mm的花芽中表达量最高，为在常温STM表达量的33.92倍。这些结果表明，蝴蝶兰FT基因与低温诱导蝴蝶兰花芽分化与发育的过程有着密切的关系。

从上述结果分析表明，本发明的蝴蝶兰FT基因是一个新的与低温诱导花芽分化与发育的相关基因，该基因既参与植物的营养生长，又参与低温诱导的生殖生长，可使植物提前开花。因此，本发明提供的蝴蝶兰FT基因，不仅有利于揭示低温诱导蝴蝶兰花芽分化与发育的分子机制，还可为基因工程改良植物的生命进程，尤其是植物的花期进行调控提供了一定的依据。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1 RNA电泳检测。 图1 泳道1，Tester的总RNA ；泳道2，Driver的总RNA。

图2 ds cDNA的合成和柱纯化。M，1kb的DNA Marker；图2A 泳道1，Tester ds cDNA，泳道2， Driver ds cDNA；图2B，泳道1，2，3为Tester的dscDNA柱纯化，泳道4，5，6为Driver ds cDNA柱纯化。

图3 RsaⅠ酶解和纯化。泳道M，1kb的DNA Marker；图3A，泳道1和2 分别为Tester ds cDNA RsaⅠ酶解前和酶解后，泳道3和4 分别为Driver的ds cDNA RsaⅠ酶解前和酶解后；图3B，泳道1和2 分别为Tester ds cDNA RsaⅠ酶解纯化前和纯化后，泳道3和4 分别为Driver的ds cDNA RsaⅠ酶解纯化前和纯化后。

图4 正向抑制消减产物两次PCR结果。图4A泳道M，1kb的DNA Marker；泳道1，正向抑制消减文库的第一次PCR产物；图4B泳道M，DL2000的DNA Marker；泳道1，正向抑制消减文库的第二次PCR产物。

图5 向抑制消减文库的PCR鉴定。图5泳道M，DL2000的DNA Marker；泳道1-17，为随机挑取的17个阳性克隆的PCR电泳结果，插入片段长度在300-1100 bp左右。

图6 蝴蝶兰FT基因编码的蛋白通过NCBI保守结构域数据库注释结果。其中，PEBP_euk是Phosphatidyl Ethanolamine-Binding Protein (PEBP) domain present in eukaryotes的简写。

图7 Real-time PCR分析蝴蝶兰FT基因在不同组织的表达量。图中横坐标STM代表常温条件下蝴蝶兰的顶端生长组织，0-3 mm、3-5 mm、5-10 mm、10-15 mm、15-20 mm和20-35 mm分别代表低温条件下诱导的不同大小的花芽。图中纵坐标表示蝴蝶兰FT与actin的相对表达量。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1  蝴蝶兰FT基因的获得及其生物信息学分析

（1）以蝴蝶兰杂交种Phalaenopsis hybrida cv. Fortune saltman的成熟植株为试验材料，分别进行常温温棚（白天28±3 ℃，湿度70-95%；夜晚25±1.5 ℃，湿度100%）和低温温棚（白天28±3 ℃，湿度70-95%；夜晚21±1.5 ℃，湿度100%）中种植。两棚中的光照强度150～300 μmol·m^-2·s^-1（光照时间8:00～18:00），其栽培和施肥管理都一样。低温温棚中的植株在40-60天内，分化出0-40 mm大小不等的花芽，而常温温棚中的植株仍然处于营养生长阶段。

（2）以低温温棚中分化出的40 mm大小的蝴蝶兰花芽为检测方（tester），以常温温棚中生长的蝴蝶兰顶端生长组织为驱动方（driver），分别提取其总RNA。RNA的提取步骤具体如下：

将样品于液氮中研成粉末，按适当样品的量迅速加入Solution D 500 μl，水饱和酚500 μl，3 M醋酸钠（pH 5.2）200 μl，4 M β-巯基乙醇50 μl，充分振荡混匀，室温放置1 min；加入200 μl氯仿，剧烈振荡1 min；4 ℃，12 000 g离心10 min，小心吸取上清液至另一无RNase的离心管中；加入二氧化硅悬浮液100 μl，无水乙醇200 μl，3 M醋酸钠（pH 5.2）200 μl，用微量移液器缓慢混匀，室温，12 000 g离心1 min，弃上清；加入70％乙醇1 ml，用移液器吸打混匀，室温，12 000 g离心1 min，弃上清，重复2次；室温干燥8-10 min，加入20-50 μl灭菌双蒸水，室温孵育5-10 min，室温，12 000 g离心5-10 min；将RNA上清液吸取至另一无RNase的离心管中。测定RNA的浓度和电泳检测RNA的质量。

最后将RNA置于－80 ℃冰箱保存备用。

（3）构建低温诱导的花芽的正向抑制削减文库：根据SMART^TMPCR cDNASynthesis Kit和PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit（Clontech，USA）的操作步骤构建低温诱导的花芽的正向抑制削减文库，实验结果如图1-图5所示。然后随机挑取阳性克隆进行测序，这些表达序列标签（EST）编码各种不同功能的蛋白，其中一个EST在NCBI数据库中匹配到Flowering locus T（FT）基因。该FT基因与文心兰（Oncidium Gower Ramsey）的FT基因同源性高达89%，以及与春兰（Cymbidium goeringii）的FT基因同源性高达87%。

（4）蝴蝶兰FT基因的生物信息学分析：该cDNA序列全长为809bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框为从5’端第59位至第589位碱基，共531bp，其编码的蛋白的氨基酸序列具有176个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示。将蝴蝶兰FT基因编码的蛋白在NCBI数据库进行搜索，如图6所示，结果表明具有FT类蛋白的PEBP_euk保守结构域；同时，该蝴蝶兰的FT蛋白与春兰（C. goeringii）的FT蛋白有93%的同源性、与文心兰（O. Gower Ramsey）的FT蛋白有90%的同源性和水稻（Oryza rufipogon） 的Hd3a（FT蛋白）有80%的同源性。比对结果如表1所示：

表1不同植物来源FT蛋白的氨基酸序列比对结果

 

其中，来源于Cymbidium goeringii，Oncidium Gower Ramsey，Gossypium hirsutum，Pyrus pyrifolia，Oryza rufipogon，Prunus mume和Hordeum vulgare subsp. vulgare 的FT蛋白的氨基酸序列的GenBank登录号分别是：ADI58462，ACC59806，ADK95113，BAJ11577，BAG72301，BAH82787和AAZ38709。‘-’，‘*’，‘:’和‘.’分别表示缺口，一致性，相似性和半相似性的氨基酸残基。 

实施例2  蝴蝶兰FT基因的表达模式分析

在低温温棚中，分别取蝴蝶兰分化的0-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-35 mm的花芽；在常温温棚中，取蝴蝶兰的顶端生长组织。分别提取各样品的总RNA，方法如前述。分别取各样品的RNA 1μg，然后分别反转录为cDNA第一链（PrimeScript^TM Reverse Transcriptase kit, Takara）。根据前述的核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计Real-time PCR引物来扩增其特异区段FT-F：5’- ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG-3’和FT-R：

5’- CGACTGGCGAACCGAGATTA-3’，目的片段长为120bp。以GenBank登录的蝴蝶兰的actin(AY134752.1)作为内参基因，设计特异引物actin-F：5’- CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’和actin-R：

5’- TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’，目的片段长为139 bp。将前述的第一链cDNA稀释10倍作为Real-time PCR反应的模板；Real-time PCR的反应体系为：SYBR premix Ex taq^TM (2×) 10.0 μl，正反向引物（10 μM）各0.5 μl，灭菌ddH₂O 7.0 μl，稀释的第一链cDNA 2.0 μl。利用Light Cycler 480荧光定量PCR仪（Roche）进行PCR扩增，反应程序为95 ℃30 s; 95 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，45 个循环，72 ℃读取荧光值；循环结束后65 ℃ 60 s，进行熔解曲线分析；最后40 ℃冷却10 s。分别使用FT和actin基因的5个浓度梯度稀释的标准品，制作标准曲线，待测样品和标准品同时进行PCR反应，可得到待测样品的FT和actin基因的浓度，然后用待测样品的FT基因浓度值去除actin基因的浓度值，得到一个相对值。每份样品3次PCR重复。用Excel 2003录入计算相对值数据和绘图。根据Real-time PCR试验结果，如图7所示，判断FT基因在低温诱导出的蝴蝶兰花芽的不同发育阶段的表达量。从图7可以看出，与在常温的顶端生长组织（STM）的表达量相比，蝴蝶兰FT基因在0-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-35 mm花芽中的表达量都升高，其中在0-3、3-5、5-10、10-15和15-20 mm的花芽中表达量都极显著上升，在20-35 mm的花芽中表达量显著上升；在0-3 mm的花芽中表达量最高，为在常温STM表达量的33.92倍。这些结果表明，蝴蝶兰FT基因与低温诱导蝴蝶兰花芽分化与发育的过程有着密切的关系。

从上述结果分析表明，本发明的蝴蝶兰FT基因是一个新的与低温诱导花芽分化与发育的相关基因，该基因既参与植物的营养生长，又参与低温诱导的生殖生长，可使植物提前开花。因此，本发明提供的蝴蝶兰FT基因，不仅有利于揭示低温诱导蝴蝶兰花芽分化与发育的分子机制，还可为基因工程改良植物的生命进程，尤其是植物的花期进行调控提供了一定的依据。

<110> 广东省农业科学院花卉研究所

<120>蝴蝶兰FT基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列

<160> 6

<210> 1

<211> 809

<212> DNA

<213> 蝴蝶兰杂交种Phalaenopsis hybridacv. Fortune saltman

<400> 1

1      gacacacact  tctctcactt  caagcccagg  acttcaacat  tatctaaaga  acatggatat

61     gaatagagag  acggacgcat  taattgttgg  aagagtgata  ggagatatac  ttgatccctt

121    cacaagaagg  gtttctctca  gagttagtta  cggttcaaga  gttgtcagta  atggcataga

181    atttaagccc  tcggcagtag  tggagcagcc  gagagttaaa  gttggtggga  atgatctcag

241    gactttctac  actcttgtca  tggtagatcc  agatgctcca  agtccaagtg  atcctcaact

301    tagagaatac  ttacactggt  tagtcacgga  tatccctgca  acaacaacag  caacattcgg

361    cagagaaata  gtgtgctatg  agagcccacg  cccaagtcta  ggcatacacc  gctttgtctt

421    cgtgctgttt  catcaactag  gccgacagac  agtttacgcc  cctggctggc  gtcaaaattt

481    caacacccgt  gattttgccg  agctcaataa  tctcggttcg  ccagtcgcag  ccgtctactt

541    taactgccaa  agagaggccg  gctccggtgg  aagaaggatg  caagattgat  gaatttccat

601    gtgtttgtgc  ttctaccatt  agttattctc  tcacaaccgc  ttatctgttc  aagtattttg

661    ctataatgtc  ttctatgtcg  gatgataata  agctaatagt  ataggtcata  tcaatgattt

721    atgcatgatg  ttttgatttc  caaggttgct  ttcagtaact  tatttataat  atcttagttc

781    tagccaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaa 

 

<210> 2

<211> 176

<212> PRT

<213>蝴蝶兰杂交种Phalaenopsis hybridacv. Fortune saltman

<400> 2

MNRETDALIVGRVIGDILDPFTRRVSLRVSYGSRVVSNGIEFKPSAVVEQPRVKVGGNDLRTFYTLVMVDPDAPSPSDPQLREYLHWLVTDIPATTTATFGREIVCYESPRPSLGIHRFVFVLFHQLGRQTVYAPGWRQNFNTRDFAELNNLGSPVAAVYFNCQREAGSGGRRMQD

 

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG 20

 

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

CGACTGGCGAACCGAGATTA 20

 

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CAGTGTTTGGATTGGAGGTT 20

 

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

TCTCGGGTTCCATTTCCATC 20

Claims (4)

1.一种分离出的蝴蝶兰FT基因的cDNA序列，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的蝴蝶兰FT基因的cDNA序列，其特征在于，该cDNA序列包含5’端非编码区1bp-58bp、蛋白编码区59bp-589bp和3’端非编码区590bp-809bp，编码包含176个氨基酸的多肽。

3.一种如权利要求1或2所述蝴蝶兰FT基因的cDNA序列编码的多肽，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

4.一种用于检测蝴蝶兰FT基因在低温诱导出的蝴蝶兰花芽的不同发育阶段的表达量的方法，其特征在于包括如下步骤：

分别提取了不同发育阶段的蝴蝶兰花芽的总RNA，再将不同花芽的RNA分别反转录为cDNA第一链；

根据核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为120bp的特异区段：

FT-F：5’- ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG-3’ <SEQ ID NO.3>，

FT-R：5’- CGACTGGCGAACCGAGATTA-3’<SEQ ID NO.4>，

以蝴蝶兰的actin(AY134752.1)作为内参基因，设计特异引物：

actin-F：5’- CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ <SEQ ID NO.5>，

actin-R：5’- TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ <SEQ ID NO.6>，

扩增长为139 bp目的片段；

根据Real-time PCR试验结果，获得FT基因在低温诱导出的蝴蝶兰花芽的不同发育阶段的表达量。

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