CN105734140B - 茄子高温胁迫内参基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茄子高温胁迫内参基因及其应用。本发明基于正常生长条件和高温胁迫6h条件下的热敏和耐热茄子幼苗叶片转录组RNA‑Seq数据，从中找到8个候选内参基因。以SmActin为对照，对8个候选内参基因在热敏和耐热茄子品系高温胁迫不同时间、不用组织的实验材料中进行实时荧光定量PCR（qPCR）分析，采用GeNorm、NormFinder、Bestkeeper和ReFinder软件对qPCR结果进行分析，最终得到了在茄子正常生长温度和高温胁迫下不同时间和不同组织中最稳定表达的3个内参基因—Sm EF 1A、Sm TRX、Sm UCP。本发明首次针对茄子耐热性研究借助RNA‑Seq数据对内参基因进行筛选，有利于提高茄子高温胁迫条件下基因表达分析研究的稳定性和可靠性。

Description

茄子高温胁迫内参基因及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及茄子高温胁迫内参基因的筛选及其应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)属于茄科茄属蔬菜作物，在世界各地广泛栽培。茄子生产容易受到高温胁迫影响(李植良等，2009)。因此，耐热性资源和基因挖掘是茄子育种的重要目标之一。基于转录组测序比较耐热品种和热敏品种基因表达差异的研究过程中，较多的涉及到应用q-PCR验证和分析基因表达模式和水平，因此筛选高温胁迫条件下稳定表达的内参基因对q-PCR结果起着关键作用。目前，在茄科作物上常用的内参基因有3–磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18S核糖体RNA(18sRNA)、肌动蛋白基因(ACTIN)、多聚泛素酶基因(UBQ)、转录延伸因子基因(EF1)、亲环蛋白基因(CYP)和α微管蛋白基因(TUA)等。

我们采用RNA-Seq技术研究了热敏茄子自交系05-1和耐热茄子自交系05-4高温胁迫处理前后的基因表达谱，采用q-PCR验证基因表达水平，以Sm Actin作为内参基因，发现Sm Actin表达会受到高温胁迫影响较大。因此，目前进行茄子耐热性相关基因的表达研究工作中最亟待解决的难题是：筛选稳定性好的内参基因。

发明内容

本发明的一个目的在于提供几个茄子高温胁迫条件下基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为茄子高温胁迫内参基因。

本发明所采取的技术方案是：

茄子高温胁迫内参基因，其为茄子转录延伸因子EF 1A基因、转录延伸因子EF2基因、核糖体蛋白RPL24基因、核糖体蛋白RPS29基因、硫氧还蛋白TRX基因、酪蛋白激酶基因、DAHP合酶基因或Unigene0048390基因。

所述转录延伸因子EF 1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述转录延伸因子EF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，核糖体蛋白RPL24基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，核糖体蛋白RPS29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，硫氧还蛋白TRX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，酪蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，DAHP合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，Unigene0048390基因的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

以上所述的茄子高温胁迫内参基因在茄子耐热性基因筛选或研究中的应用。

用于扩增茄子高温胁迫内参基因的PCR引物。所述的PCR引物在茄子耐热性基因筛选或研究中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明筛选了8个高温胁迫条件下在茄子基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为茄子高温胁迫内参基因，有利于提高茄子高温胁迫条件下基因表达分析研究的稳定性和可靠性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1高温胁迫下茄子内参基因的筛选

通过基于RNA-Seq筛选得到热敏(05-1)和耐热(05-4)茄子品系自交系幼苗在正常生长温度和6h高温胁迫后共4个样本(05-1CK、05-1 6h、05-4CK、05-46h、)的22215个Unigene的RPKM值，得到了8个表达稳定的Unigene作为候选内参基因(见表1)。

表1RNA-Seq中代表各Unigene表达水平的RPKM值

针对以上筛选得到的8个候选内参基因，分别设计qPCR引物，其序列如表2所示：

表2 9个茄子内参基因的引物序列

实施例2候选内参基因的表达稳定性分析

1、不同高温胁迫时间下，候选内参基因在热敏和耐热茄子叶片中的表达稳定性分析

(1)以苗期高温胁迫鉴定及田间均表现为耐热的亲本自交系05-4和热敏感的亲本自交系05-1为植物材料(孙保娟等，2007；孙保娟等，李植良等，2009)。

(2)27℃培养30d左右，当幼苗具有4片真叶时进行42℃高温高温胁迫处理不同时间(0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，12h，24h)。每个处理10株，设3次生物学重复。以未进行任何高温处理的材料作为对照。

(3)采用Trizol试剂(Invitrogen)进行RNA提取，反转录使用M-MML逆转录酶(Invitrogen)，利用Oligo T15引物进行cDNA的合成，操作步骤均参照公司提供的实验手册。将产物稀释5倍后作为PCR扩增的模板。表达分析采用表2的引物组合，进行实时定量PCR反应，试剂为Premix Ex TaqTM试剂盒(Bio-RAD)。

反应程序：94℃，3min，[94℃20s；56℃，20s，72℃，20s]×40个循环；溶解曲线程序：65℃加热至90℃，5s。每次反应要重复三次。PCR完成后，经自动分析，查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数(cycle at threshold)，即Ct值，详见表3。

表3高温胁迫不同时间候选内参基因在热敏和耐热茄子叶片中平均Ct值

(4)对荧光定量PCR反应后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件进行各候选内参基因稳定性进行分析。GeNorm软件计算每个候选基因表达稳定度M值，M值越高，表达越不稳定。NormFinder软件结合组内方差与组间方差计算出各候选内参基因稳定值，该值越小，表明内参基因越稳定。Bestkeeper可以直接输入Ct值，通过计算标准偏差和变异系数值的大小比较各内参基因的稳定性，标准差和变异系数越小，稳定性越好。从表4可见，基于RNA-Seq得到的8个候选内参基因在茄子高温胁迫不同时间、不同品种中的表达稳定性均优于对照Sm Actin。

表4高温胁迫不同时间候选内参基因在茄子不同品种中的表达稳定性(M值)的分析结果

2、高温胁迫下，候选内参基因在茄子不同组织中表达稳定性分析

(1)分别以茄子耐热自交系05-4和热敏感自交系05-1高温胁迫处理6h及对照的根、茎和叶作为实验材料。

(2)提取RNA、反转录，采用表2的引物组进行qPCR分析。得到的Ct值如表5：

表5高温胁迫下候选内参基因热敏和耐热茄子不同组织中的平均Ct值

(3)对荧光定量PCR反应后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件进行各候选内参基因稳定性进行分析，结果如表6。从表6可见，8个候选内参基因在高温胁迫不同组织中表达稳定性均比对照内参基因Sm Actin好，但从GeNorm分析得到的M值来看，Sm RP L24、Sm RP S29基因的M值大于1.5，因此，同Sm Actin一样，不适宜作为高温胁迫下茄子不同组织基因表达水平分析的内参基因。

表6候选内参基因在茄子不同组织中(M值)表达稳定性分析

3、候选内参基因表达稳定性的综合分析

对GeNorm、NormFinder、Bestkeeper法分析得到的稳定性排名采用ReFinder软件求几何平均值，得到综合指数排名，该指数越小，说明内参基因表达越稳定。8个候选内参基因在热敏和耐热茄子自交系高温胁迫不同时间、不同组织表达稳定性综合排名如表7。从表7可见，基于RNA-Seq数据开发得到的8个候选内参基因，不同高温胁迫时间、不同组织及总体表现均优于对照内参基因Sm Actin；就不同高温胁迫时间而言，排名前3的内参基因为SmEF 1A、Sm UCP和Sm RP L24，对高温胁迫下不同组织而言，排名前3的内参基因是Sm EF 1A、Sm TRX和Sm DAHP；适用于高温胁迫下不同时间处理、不同组织样品基因表达分析最佳的内参基因是Sm EF 1A，其次是Sm TRX和Sm UCP。

表7内参基因综合排名表现

由此，我们得到了在茄子正常生长温度和高温胁迫下不同时间和不同组织中最稳定表达的3个内参基因：Sm EF 1A、Sm TRX、Sm UCP。它们可以应用于茄子耐热性基因的筛选或研究中。

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 茄子高温胁迫内参基因及其应用

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tggaggttat gctgcaatgc agagggtcac tgaatggaat cttgattttg tggagaacag 840

cgagcaggga gataggtatc aagaactagc tcacagggtt gatgaagcct taggattcat 900

ggctgctgct ggactcaccg ttgaccaccc tatcatgtca acaactgatt tctggacatc 960

ccatgagtgc ttgcttcttc cttatgaaca agcacttaca agggaggatt caacttctgg1020

tcttttctat gattgttcag ctcacatgat ttgggttggt gaacgaacca ggcaactaga1080

cggtgctcat gtcgagtttt tgagaggagt tgcaaacccg cttggcataa aggtgagtca1140

aaaaatggat ccaaatgagc taattaagct tattgacatc ctgaacccta ccaataagcc1200

tggaagaata accgtaattg ttagaatggg tgctgagaac atgagagtga aacttcccca1260

cttggtcagg gcagtacgcg gagctggtca gattgtgaca tgggtttgtg atccaatgca1320

cgggaatacc atcaaggcac catgtggact caaaacccgt gcttttgatt caatcctggc1380

tgaggtccga gctttctttg atgtgcatga gcaagaaggg agccaccctg gtggtattca1440

tctagaaatg acagggcaaa atgtaactga atgcattggt ggatcacgaa cagtaaccta1500

tgacgatttg ggctctcgct accacactca ttgtgatcca agattgaatg cttctcagtc1560

tcttgaactt tccttcattg tagccgagcg actaagaaga cgaagaatga ccactcaact1620

tctgtaggct tgtctaattt acctgtactt tacatgttaa taaacatggc aaagcaactt1680

gccagatgag gtaaataggt ttcctacaga gatccaaggg gaaatgaaca tccaatcaaa1740

attagtcgat ttatccagca tcccttctat ttgttttagt ttggactctt aagtttagga1800

ttaagggtgt tcaatcttct tttcttgatg tatgaatgtt attttgagat actggttttg1860

ctgttttagt caaatgtgtt cgtctgccta gcttatgggg tttgattttt gagatgagaa1920

tttttcggaa acaacctctc tgtctctctg aggtagtcgt aaggtccgca tacattttgc1980

ctttcttaga ccttgtggaa tttccaatgt tattgtgatg tttgtctgcc t 2031

<210> 8

<211> 748

<212> DNA

<213> Solanum melongena L.

<400> 8

aaagtttcga tctccaattc caaatccaaa gttcacacat agaaaacgtc tttttcgttt 60

ttcttctgca atacaattga agaagaaagc aagagcagat gggtggagct caggcaatga 120

agagaatccc acgcatcaag tttccacaga ggcatccaaa gccttcaggt tccacatccc 180

agaattccca acatcagaaa attccagcag ctgaagaagt tcctcgaaca tttttctcaa 240

ggtccccatc tagcacgtcc gttgcaggga aggcttctga ccaacccaaa agaacaccag 300

tgactcaaga ggaaattgat tccattatgt tgggtggctg cctctgactt taatcaggcg 360

aattatcttc agagagaaga cacagctcac gacttcacgc ttatgtttat tgattgggtg 420

aactatcttt tcgtgtttat gtttttaact gttgtactaa accaataatc cttttcagta 480

accaatgttt ctgatgaatg attgttaata attcgttatg cacggtatgg tgatcaatat 540

ctggattgga actacctcaa acaattgata ggcttttttc tttggtataa aatgtaacca 600

tctcacccct tggggtgcag ccatttcccg tacctgctaa tgcgtgatgc tttgtgcacg 660

ttcttgtcta aatatagaga acttattact gttgacactg cctttgctgg gattgaagca 720

tagtagtagt tgttattatg acttcatt 748

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccacacttct catattgctg tca 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

accagcatca ccattcttca aaa 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcatgggtgg tgctgagatt ata 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctagcttcca tgtacaaacg gtt 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaactttgtc gttttagtgg tgc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgttgtggaa gtagtgtttg cat 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctcttctgcc ttgtgaaaga tgg 23

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctgcagcaca tgagtccata c 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tatctttcaa gttttctcgg cgg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcttggagga gttgaaatga agt 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

caggaagtag atgggcaatt gtt 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cctcctatgg atcccttcac tag 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cagggcaaaa tgtaactgaa tgc 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcggctacaa tgaaggaaag ttc 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

caacatcaga aaattccagc agc 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgttcttttg ggttggtcag aag 23

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ttactcattc accaccacag c 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

accatcggga agctcatagc 20

Claims (4)

1.茄子高温胁迫内参基因，其为茄子转录延伸因子EF 1A基因、转录延伸因子EF2基因、核糖体蛋白RPL24基因、核糖体蛋白RPS29基因、硫氧还蛋白TRX基因、酪蛋白激酶基因、DAHP合酶基因或Unigene0048390基因；所述转录延伸因子EF 1A基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述转录延伸因子EF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，核糖体蛋白RPL24基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，核糖体蛋白RPS29基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，硫氧还蛋白TRX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，酪蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，DAHP合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，Unigene0048390基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.权利要求1所述的茄子高温胁迫内参基因在茄子耐热性基因筛选或研究中的应用。

3.用于扩增权利要求1所述茄子高温胁迫内参基因的PCR引物。

4.权利要求 3所述的PCR引物在茄子耐热性基因筛选或研究中的应用。