CN102703468B - 用于调控作物株高的基因、多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因技术和植物学领域，旨在提供一种用于调控作物株高的基因、多肽及其应用。该基因的序列是SEQ ID NO: 1－6中的任意一种。本发明所提供的基因能够明显调节作物株高，从而可以更好地控制水稻等作物株高，保障产量，达到稳产高产的目的。本发明的基因是对作物改良和育种工作中有重要应用价值的基因。

Description

用于调控作物株高的基因、多肽及其应用

技术领域

本发明属于基因技术和植物学领域；本发明涉及到调控作物株高的基因及其应用。

背景技术

当前，对于农作物高产育种的选育主要集中在株型和穗部性状的改良。由于品种的改良，目前已经培育出多种高产农作物品种。然而，当前的许多高产作物如水稻高产栽培品种尤其超级杂交稻存在一定的株高过高问题，导致容易倒伏、产量潜力受到限制的问题。这在很大程度上影响了作物产量的进一步提高和高产品种的推广。因此，本领域有必要研究可调节农作物株高的方法，从而进一步改良农作物的性状，矮化作物更适合于抵抗对外部环境的不利影响，提高农作物的产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，通过研究调控农作物株高的和机制方法，提供一种控制植物株高基因Ta1，为改良农作物株高和生育期性状，提高农作物的产量建立了基础。

为解决技术问题，本发明解决方案的具体内容如下：

一种用于调控作物株高的基因，该基因的序列是SEQ ID NO: 1－6中的任意一种。

一种分离的作物株高调节多肽，该多肽选自下组：

(a) 具有SEQ ID NO: 7－9 所示氨基酸序列的多肽；或

(b) 将SEQ ID NO: 7－9 所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节作物株高功能的由(a)衍生的多肽。

一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：编码如上所述多肽的多核苷酸(a)；或与多核苷酸 (a) 互补的多核苷酸。

一种载体，它含有上面所述的多核苷酸。

一种遗传工程化的宿主细胞，它含有以上所述的载体。

一种多肽的制备方法，该方法包含：

(a) 在适合表达的条件下，培养以上所述的宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出作物株高调节多肽。

包含所述多肽或其编码基因的激动剂或拮抗剂，可用于调节作物的株高、生育期或产量；或制备调节作物的株高、生育期或产量的物质，或通过调节作物中基因的表达或活性，以实现对作物株高的调节。

本发明的有益效果在于：

本发明分离的6个基因包含若干个碱基的差别，基于这些序列，我们构建了6个过表达转基因载体并转入到水稻植株里。通过定量PCR方法，我们检测到了这些基因在所有转基因植株里的表达，表达的结果证实了这些基因在转基因植物的表达水平是明显增加（相对于非转基因对照水稻）。我们的发明中，Ta1基因在水稻内的过表达很可能改变了一些发育代谢关键代谢途径酶的复杂催化反应，形成了在我们的转基因水稻植株中出现的各种不同的植株表型变化。本发明取得的Ta1基因将为水稻、小麦等作物生长发育过程中该基因所扮演的角色提供一个更加深入的理解，以便可以更好的在农业生产方面提供指导，改良农作物性状，提高农作物的产量。

附图说明

图1为Ta1-1基因在3个月大野生型水稻（日本晴）和转基因水稻植株中过表达引起的表型改变对比图；

图2为Ta1-2基因在3个月大野生型水稻（日本晴）和转基因水稻植株中过表达引起的表型改变对比图；

图3为Ta1-3基因在3个月大野生型水稻（日本晴）和转基因水稻植株中过表达引起的表型改变对比图；

图4为Ta1-4基因在3个月大野生型水稻（日本晴）和转基因水稻植株中过表达引起的表型改变对比图；

图5为Ta1-5基因在3个月大野生型水稻（日本晴）和转基因水稻植株中过表达引起的表型改变对比图；

图6为Ta1-6基因在3个月大野生型水稻（日本晴）和转基因水稻植株中过表达引起的表型改变对比图；

图7为Ta1-1基因在转基因和野生型水稻中表达水平差别的定量PCR分析结果；

图8为Ta1-2基因在转基因和野生型水稻中表达水平差别的定量PCR分析结果；

图9为Ta1-3基因在转基因和野生型水稻中表达水平差别的定量PCR分析结果；

图10为Ta1-4基因在转基因和野生型水稻中表达水平差别的定量PCR分析结果；

图11为Ta1-5基因在转基因和野生型水稻中表达水平差别的定量PCR分析结果；

图12为Ta1-6基因在转基因和野生型水稻中表达水平差别的定量PCR分析结果；

图13为 转Ta1基因水稻株高统计结果。

具体实施方式

本发明包含了从小麦中克隆Ta1基因，并在水稻表达并表现出具有的生物学功能，为进一步的研究该基因在禾本科植物生长发育过程中所扮演的角色提供了一个很好的基础。本发明所进行的研究能够帮助我们更好的理解该基因并进一步的应用于控制作物高度及控制产量等农业生产中。

材料和方法

１.植物材料

本发明选取小麦品种中国春对Ta1基因片段进行分离，采用水稻品种日本晴作为转基因模型。所有水稻植株的种植和生长阶段都在实验大田中完成，用于进行基因表达分析的田间植株样品都在液氮中直接收集和冻干以便进行下阶段的分子生物学验证。

２.Ta1编码基因的鉴定和分离

我们采用Trizol试剂(Invitrogen, http://www.invitrogen.com/)对小麦植株的总RNA进行了提取，之后利用反转录酶(SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, , Invitrogen)构建了我们所需要的cDNA文库。通过数据库资源等，找到和鉴定了一个可能具有编码Ta1基因的全长cDNA序列。根据该序列设计引物（Ta1 sense primer 5’- GAGAGCATCTCCCCTGTTCC-3’; Ta1 anti-sense primer 5’- TGGTTCACACTAACTAACTATTCATCA-3’）并在小麦当中扩增出了实验所需的基因片段。针对该基因片段，我们通过克隆和测序进一步验证了基因序列的可靠性。

PCR程序：初始变性（1个周期，94℃，3分钟），变性（35个循环，94℃，1分钟），引物退火（35个循环，58^oC，30秒），引物延伸（35个循环，72℃，90秒），最后延伸（1个周期，72℃，10分钟），4 ^oC保存。

３.Ta1过表达载体的构造

根据扩增基因片段的测序结果以及在此基础上对序列进行的联配分析，我们利用包含有酶切位点(KpnI和SacI)的特异引物(sense 5’-GGTACCCTCTGCTTCTTTAG-3’; anti-sense 5’- GAGCTCACACGCACACGCAC-3’ )对选取的6个Ta1同源基因进行了PCR扩增。PCR产物经纯化后被连接到pGEM®-T Easy载体（Promega公司，http://www.promega.com/）进行进一步的测序验证。由于特异引物当中所包含的酶切位点，使得PCR扩增出的产物可以被KpnI和SacI酶切。酶切后PCR产物即被用来装载到拥有玉米ubiquitin启动子的过表达载体pUN1301，并连同该载体转入到农杆菌EHA105中，之后通过农杆菌介导转入水稻日本晴植株当中。

４.定量 PCR分析检测

6个转基因系列的水稻总RNA经Trizol提取和RNase-freeDNA酶I（Promega公司）纯化后，分别构建了各自的cDNA文库。构建好的cDNA文库作为模板，进过下一步的PCR扩增。通过Taq聚合酶（Takara公司），我们对转基因和野生对照水稻植株的分别进行了PCR扩增反应。为了检测编码基因在转基因水稻和野生对照植株中的表达水平的差异，我们选取了ubiquitin (Ubi-1)作为对照引物(5′-TAAGCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3′) 和 Ubi anti-sense (5′-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3′)，来扩增和标定编码基因的表达，之后再通过基于编码基因的特异引物进行扩增，分别检测和分析6个Ta1基因在转基因水稻与对照间的表达水平上的差异。

PCR程序：初始变性（1个周期，94℃，3分钟），变性（35个循环，94℃，30秒），引物退火（35个循环，58^oC，30秒），引物延伸（28个循环，72℃，90秒），最后延伸（1个周期，72℃，10分钟），4 ^oC保存。对于特殊引物，PCR循环数增加到35个。

５.序列信息分析

通过对6个编码基因的DNA测序结果（命名为Ta1-1~6，序列信息见SEQID NO.1-6），我们分析了6个Ta1基因编码的蛋白序列。序列分析结果表明，这6个Ta1基因共编码了4种蛋白（序列信息见SEQ ID NO.7-10；Ta1-1, Ta1-2 和Ta1-6编码同一种蛋白序列SEQ ID NO.7，Ta1-4编码一种蛋白序列SEQ ID NO.8，Ta1-5编码一种蛋白序列SEQ ID NO.9，Ta1-3编码一种蛋白序列SEQ ID NO.10）。

实施例1

Ta1在小麦中的鉴定和分离

基于一个候选基因序列，通过PCR扩增技术在中国春小麦品种中随机选择了8个克隆并进行了测序。6个克隆中的每一个克隆序列的长度都至少有1530bp，并且它们之间都至少包含一个碱基的差别和一个完整的ORF（见序列信息SEQ ID NO.1-6）。这6个基因被进一步的转入到日本晴水稻品种中来验证其具体的功能。

实施例2

Ta1在转基因水稻中的过量表达

为了验证Ta1基因对植株生长的影响，我们构建了一个包含玉米ubiquitin启动子过表达载体pUN1301并且将这6个编码基因转入到水稻中。基于不同的Ta1基因编码序列，总共构建了6个过表达载体并标记为Ta1-1~6。在载体成功转入的转基因水稻植株中，我们可以发现，Ta1-1, Ta1-2, Ta1-4，Ta1-5和 Ta1-6基因过量表达植株系列都表现出了显著地矮化表型，但Ta1-3过表达系则未表现出与野生型相比明显的表型改变。 (见图1-6)。

在这些表现出非正常表型的转基因水稻中，Ta1-2系列转基因水稻的矮小化表型与其它植株相比表现的更加明显，这一系列的植株基本上都很难达到抽穗期。而在其它的转基因水稻植株当中不同阶段的表型，从与野生型只有略微差别到严重矮化且没有明显的节间都能在同一转基因系列中观察到(见图1-6)。这一结果从我们对这些植株的高度统计数据中也能反应出来(见图13)。例如，在Ta1-2系列植株中，高度最高的植株也只有约20厘米而该系列的平均高度仅为12厘米。这一系列与同时期非转基因水稻（高度约为80厘米）相比，具有非常显著的矮小化的表现。除了Ta1-3系列，其它系列的转基因水稻的表型都发生了明显的矮小变化，并且平均高度都在30厘米以下。在Ta1-3转基因株中，我们观察不到与正常非转基因水稻明显的表型差别，对高度进行的测量和分析结果也看不出明显的区别。就我们得到的这些小麦中Ta1酶在水稻中产生了一些明显表型变化的实验结果，我们认为我们发现的这些基因在小麦和水稻等作物生理代谢途径当中是发挥重要功能的。对这些基因功能的深入研究将使帮助我们更好的认识小麦等作物相关代谢途径并进一步在生产当中对小麦等的植株性状加以控制以获得更高的单位产量。

实施例3

Ta1基因转录分析

我们对Ta11-1～6系列基因在转基因水稻中的表达进行了全面的鉴定，当中包含了表现出明显矮小化表型的植株和这些与野生型无明显差别的转基因植株。我们采用定量 PCR技术对这些植株进行了鉴定，结果表明这些编码基因在转基因水稻植株中与我们的野生型对照相比获得了明显的表达上调，当中包括了Ta1-3系列和为了确保Ta1基因检测的准确性而设置的重复转录组（见图1-12）。在几个转基因水稻系列的表型比较结果当中，Ta1-3系列并没有获得明显的矮小化趋势，但定量PCR鉴定的结果表明，Ta1基因在我们设置的三个Ta1-3植株重复对照中的表达都是上调的，得到这一结果的原因可能是由于Ta1-3基因在转基因水稻当中处于非活跃状态（见图1-12）。在其它转基因水稻系列的定量 PCR检测结果中，所有检测样本的Ta1编码基因都是极大上调的，这一基因表达上调的结果证明了小麦Ta1编码基因导致了株高表型的出现并进一步验证了这一基因的表达可以改变水稻的生理过程以及植物生长发育。

Claims (8)

1.一种用于调控水稻株高的基因，其特征在于，该基因的序列是SEQ ID NO: 4－5中的任意一种。

2.一种用于调控水稻株高的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 8－9 中的任意一种。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该核苷酸序列是：

(a) 编码权利要求2所述多肽的多核苷酸；或

(b) 与编码权利要求2 所述多肽的多核苷酸互补的多核苷酸。

4.一种载体，其特征在于，该载体包含权利要求3 所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求4 所述的载体。

6.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(a) 在适合表达的条件下，培养权利要求5 所述的宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出如权利要求2所述的用于调控水稻株高的多肽。

7.权利要求2所述的多肽的用途，其特征在于，是用于调节水稻的株高，或制备调节水稻株高的物质。

8.一种调节水稻株高的方法，其特征在于，所述方法包括：通过调节权利要求1所述用于调控水稻株高的基因的表达或活性，以实现对水稻株高的调节。

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