CN109022445B

CN109022445B - 荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN109022445B
Application number: CN201810835287.8A
Authority: CN
Inventors: 姚琼; 董易之; 阙引利; 徐淑; 陈炳旭
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: CN109022445A

Abstract

本发明公开了荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg及其编码蛋白与应用。所述的CsVg基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种药物对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的检测方法，通过检测施用药物和未施用药物的荔枝蒂蛀虫的卵黄原蛋白基因CsVg的表达量来判断该药物施用后荔枝蒂蛀虫繁殖力是否受到影响，具有检测灵敏度和准确度高，检测周期短，稳定性好的优点，可用于高通量检测药物对荔枝蒂蛀虫繁殖力的影响，对荔枝龙眼实际生产中该药剂的合理使用提供分子参考依据。

Description

荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及荔枝蒂蛀虫繁殖力关键因子卵黄原蛋白基因CsVg及其编码蛋白与应用。

背景技术

卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)基因是特异性存在于非哺乳类雌性动物体内的一种蛋白，该蛋白对于昆虫受精卵的成熟发育有决定性作用。至今，已经有多种昆虫的Vg基因被成功克隆和鉴定，但未见有关细蛾科昆虫Vg的任何报道。本发明首次在荔枝龙眼产业重大细蛾科害虫-荔枝蒂蛀虫中发现了卵黄原蛋白基因CsVg，并对其编码的氨基酸序列进行了分析，补充了细蛾科昆虫卵黄原蛋白基因分子特征的信息。

荔枝和龙眼是我国的优势名贵水果，二者的栽培面积及果实产量均居世界第一位。荔枝蒂蛀虫(Conopomorpha sinensis Bradley)是荔枝龙眼栽培中频发、暴发性蛀虫，该虫以幼虫为害，其蛀果率严重时可高达到60％以上，是荔枝龙眼产业“零容忍”的害虫防控对象。但是，在该虫幼虫期和蛹期无法进行防控，在其成虫期唯有反复大量施药才能保证防控效果。高效氯氰菊酯是目前应用于荔枝蒂蛀虫成虫防控最为常见的化学药剂。但是，在实际生产中未见可用于该药剂对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的检测方法，亟待解决该问题。

发明内容

本发明的目的是提供荔枝龙眼产业重大害虫-荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg及其编码蛋白与该基因在评价药物对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响中的应用。

本发明采取的技术方案为如下：

一种荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因的开放阅读框长度为5391bp；由CsVg基因编码的卵黄原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该编码蛋白质长度为1796AAs，估算等电点为7.99，分子大小为205.8kDa，被预测为非稳定蛋白。

本发明还提供了一种药物对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的检测方法，其特征在于，通过检测施用药物和未施用药物的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg的表达量来判断该药物施用后荔枝蒂蛀虫繁殖力是否受到影响。

优选，具体步骤是分别提取施用药物和未施用药物的荔枝蒂蛀虫的RNA，再反转录为cDNA，再以Real-CsVg-F:5’-ATGCAACCATAGAGTCGC-3’和Real-CsVg-R:5’-ATCATCTTCCGTAGATACCAG-3’作为检测引物检测卵黄原蛋白基因CsVg的表达量，如果施用药物的荔枝蒂蛀虫的卵黄原蛋白基因CsVg的表达量小于未施用药物的荔枝蒂蛀虫的卵黄原蛋白基因CsVg的表达量，则该药物处理后的荔枝蒂蛀虫繁殖力下降；反之则药物处理后的荔枝蒂蛀虫繁殖力上升；如果两者表达量相当，则药物不影响荔枝蒂蛀虫繁殖力。

优选，所述的检测卵黄原蛋白基因CsVg的表达量是通过荧光定量PCR的方法来检测，所述的荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s。

本发明还提供了一种检测药物对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的试剂盒，包括PCR反应试剂和PCR反应引物，其特征在于，所述的PCR反应引物为：Real-CsVg-F:5’-ATGCAACCATAGAGTCGC-3’和Real-CsVg-R:5’-ATCATCTTCCGTAGATACCAG-3’。

优选，还包括Real-actin-F:5’-AGATCTGGCACCACACCT-3’和Real-actin-R:5’-CGATACCGGTGGTACGAC-3’。

本发明还提供了一种上述的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取荔枝蒂蛀虫总RNA，反转录合成荔枝蒂蛀虫cDNA模板；

(2)以CsVg-F：5’-CMYMTGADGTNMGRGTKGCNGC-3’，CsVg-R：5’-GCASWRTANGGCCANACRC-3’作为引物，以荔枝蒂蛀虫cDNA模板作为模板进行PCR扩增，得到目的片段；

(3)根据SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)操作指南合成RACE所需cDNA模板，以此cDNA模板为模板，以5-CsVg-R：5’-ATCGAATGCATCATAGCTG-3’，3-CsVg-F：5’-AGCATGAAACTGGTATCTACGG-3’作为引物进行PCR扩增，获得目的片段；

(4)将步骤(2)和(3)的目的片段进行拼接，得到权利要求1所述的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg基因。

与现有的技术相比，本发明的具有以下优点：

(1)针对未见细蛾科昆虫Vg的任何报道这一问题，本发明提出的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因(Vitellogenin,Vg)DNA序列及其编码的蛋白质序列，补充细蛾科昆虫卵黄原蛋白基因分子特征的信息。

(2)针对现有化学农药对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响检测技术的局限，提供了一种基于CsVg基因研发的高效氯氰菊酯对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的分子检测方法，利用该分子检测方法，可用于高通量检测高效氯氰菊酯对荔枝蒂蛀虫繁殖力的影响，检测的灵敏度和准确度大大提高，检测周期短，稳定性好，对荔枝龙眼实际生产中该药剂的合理使用提供分子参考依据。

(3)利用本发明为荔枝蒂蛀虫对高效氯氰菊酯的应答机制研究提供新基因，为实际生产中利用Vg检测高效氯氰菊酯对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响提供基础。

附图说明

图1是本发明实施例2实时荧光定量PCR标准曲线结果图。

图2是本发明实施例2基于CsVg基因研发的高效氯氰菊酯对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的分子检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1

荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg的cDNA克隆方法，包括以下步骤：

(1)以荔枝蒂蛀虫雌性成虫为材料提取总RNA，并以所提取的总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成荔枝蒂蛀虫cDNA模板。

(2)根据现有鳞翅目昆虫Vg保守区域设计简并引物CsVg-F：5’-CMYMTGADGTNMGRGTKGCNGC-3’和CsVg-R：5’-GCASWRTANGGCCANACRC-3’，见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，(其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T)。

(3)以步骤(1)所述cDNA模板与步骤(2)所述简并引物进行PCR扩增，并纯化所得PCR产物。

(4)将步骤(3)纯化后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段后取纯化产物克隆到pMD18-T载体上，然后转化入感受态细胞DH5α，37℃平板培养过夜，以M13通用引物进行阳性克隆子鉴定。

(5)分析阳性克隆子测序结果，针对正确碱基序列，结合SMART^TMRACE cDNAAmplification Kit(Clontech)操作指南设计特异性引物3-CsVg-F：5’-AGCATGAAACTGGTATCTACGG-3’和5-CsVg-R：5’-ATCGAATGCATCATAGCTG-3’，见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

(6)根据SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)操作指南，合成RACE所需cDNA模板，结合步骤(5)的特异性引物3-CsVg-F和5-CsVg-R进行5’-末端和3’-末端序列扩增，纯化此步骤所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化后目的片段克隆到pMD18-T载体上，然后转化入感受态细胞DH5α，37℃平板培养过夜，以M13通用引物进行阳性克隆子鉴定。

(7)根据步骤(4)和步骤(6)所得的阳性克隆子测序结果，将所测得基因序列拼接后得到荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg的全长序列，所述CsVg基因的碱基序列如SEQ IDNO.1所示，所述CsVg基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg的序列完整，该基因的开放阅读框长度为5391bp，由该基因编码的蛋白质长度为1796AAs，估算等电点为7.99，分子大小为205.8kDa，被预测为非稳定蛋白，经BLAST分析，结果表明，与其最接近的蛋白同源性只有47％。

本发明提供的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg经BLAST分析，结果表明：所得基因是新的Vg基因，而且是目前仅有细蛾科昆虫Vg基因，补充了昆虫卵黄原蛋白基因分子特征的信息，可应用于昆虫繁殖力相关研究。

实施例2

利用本发明提供的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg全长，借助实时荧光定量PCR技术建立了一种高效氯氰菊酯对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的分子检测方法，该分子检测方法包括以下步骤：

(1)以荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg为靶标序列，根据实时荧光定量PCR引物设计原则，设计Real-CsVg-F:5’-ATGCAACCATAGAGTCGC-3’和Real-CsVg-R:5’-ATCATCTTCCGTAGATACCAG-3’两对特异性检测引物，见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

(2)对处理组(30ppm浓度高效氯氰菊酯喷洒处理)中幸存的荔枝蒂蛀虫雌性成虫和对照组(正常饲养)的荔枝蒂蛀虫雌性成虫分别提取总RNA样品，并将两组总RNA反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成对照组和处理组的荔枝蒂蛀虫cDNA模板。

(3)以步骤(1)所述检测引物Real-CsVg-F:5’-ATGCAACCATAGAGTCGC-3’和Real-CsVg-R:5’-ATCATCTTCCGTAGATACCAG-3’与步骤(2)所述cDNA模板进行实时荧光定量PCR反应，具体为：

首先，分别对内参基因actin(检测引物对为Real-actin-F:5’-AGATCTGGCACCACACCT-3’和Real-actin-R:5’-ACGATACCGGTGGTACGAC-3’(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)及CsVg进行荧光定量PCR标准曲线的制作：

①以对照组cDNA模板样品，分别作cDNA样品原液的10倍、1倍、1/10、1/100、1/1000和1/10000稀释；

②在10μL反应体系之中，加入1μL倍比稀释浓度的cDNA样品，加入5μL SYBRPremix ExTaq，分别加入待测基因上、下游引物各0.2μL，最后加入dd H₂O补足至10μL；

③荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s的条件下40个循环，收集结果用以制作熔点曲线，以确定扩增产物的特异性，确定引物是否可用于下一步待测样品的检测，所述标准曲线结果如图1所示。

接着，实时荧光定量PCR检测对照组与处理组中靶标基因(荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg)表达量。

①实时荧光定量PCR 10μL反应体系：

SYBR Premix ExTaq	5μL
		Real-CsVg-F	0.2μL
Real-CsVg-R	0.2μL
		cDNA模板	1μL
dd H<sub>2</sub>O	补足10μL

②实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s，实验仪器为伯乐CFX96实时荧光定量PCR仪；

③结果分析：采用2^-△△Ct方法比较CsVg基因在对照组及高效氯氰菊酯处理组中的表达量差异。

结果如表1和图2所示，2^-△△Ct(正常饲养对照组)/2^-△△Ct(高效氯氰菊酯处理组)＝0.98/0.04＝24.5>1，表明高效氯氰菊酯处理后的荔枝蒂蛀虫体CsVg基因表达量低于正常饲养组，这一结果与实际产卵量检测结果相符，该药剂处理后荔枝蒂蛀虫繁殖力下降。由此证明本发明的检测方法是可行的。

表1 CsVg基因在对照组及高效氯氰菊酯处理组中的实时荧光定量PCR数据

本发明提供的分子检测方法不同于成虫产卵量统计检测方法，不需人工饲养试虫，大大节省劳动力资源，可用于野外高通量检测高效氯氰菊酯对荔枝蒂蛀虫繁殖力的影响，检测的灵敏度和准确度大大提高，稳定性好，对荔枝龙眼实际生产中该药剂的合理使用提供分子参考依据。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院植物保护研究所

<120> 荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg及其编码蛋白与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5391

<212> DNA

<213> 荔枝蒂蛀虫(Conopomorpha sinensis Bradley)

<400> 1

atgaaggtcc tcgtgttagc ggcacttttg gctgccgctt cttgcgcgaa tcttaaaata 60

aagaaagaag ataaaaaaca ggggaaaaac tcggagacct atgtaaccca cagtttgtgg 120

caagatggca aagtctacac ctatgatgtg gagtcgttca acttggccag cctggaggag 180

gggagcagca gtggcgccaa cactaaggcc actctacagc tgcgagtaag atctcaaaaa 240

ctgcttcatg ccaaattggt ggatgtgaga cacgcggcga tgcaccagaa atttaatggt 300

gagcgccaag cgccagattc tctaaaatat gaacctatga aaagcatgga gcatccattt 360

gagatagtga tgaacatgaa tcgcatgtcc tctatgaatt tgccatcaag cctcaatttg 420

gaacatgaga attttctcaa aggtatccta agcactctcc aagttgatct cactccttat 480

cgtaaggctc ttgggtctca tgactattac gatcaagaac gcagccaagg acagttcaga 540

aagatggaga ccgacgtcac gggcgactgt gaaacgctgt acagcgtgtc gccgcttact 600

gggcataaca aaacacagta ttacaatgat caggaaccaa ttgaaatcac taaaatgaag 660

gactacggta aatgcaacca tagagtcgct tatcacttcg gtgtaccggc cggagccgaa 720

tggactggaa cagctcactc aaataaggaa aatcaattca tggaaagggc gacaaaaacc 780

cgaattgtca cagggcagca aggtccgatc tacgatgctg aaacaatctc aactgtttac 840

gtaaacccac taatgtacgg acggcagaaa gctgaaattt acagtcgagt aagcatgaaa 900

ctggtatcta cggaagatga ttctcaacca caatttgaaa tgcaacttaa tatgcgacaa 960

gtaaaaaatt tgctttactc attgggttct aagtccgcaa atatcgatta tacttcgacg 1020

tcagcatcgt cagagtctac tgaaatacca gaagagattg tactgaatga ggaactcgat 1080

gagcagccgg cgacccgagt ccgccgctca ccaaaacaaa gaggattccg ggctgtttca 1140

gtaaaaaaac ttgttataga ggaaggaaat cgtaaataca aggatgactc cgaatctgac 1200

agttctagtg actcctctac agcttaccag aacgacgaag ctcctaagca gaatgaaccc 1260

gcatatgctt ctatttacat ggttccccaa agccgaaccc caaacaaacg ttcgcctatg 1320

gttgtccaaa aactagttca ggagtttgcg caccaacttc aaaatcctaa tacaatggcc 1380

aaatcggata ccatttccaa attcaacgtc attgttcatc taattgcaac tatgaacagc 1440

gaagagctta ctcaaacaac ccgaaatatc gaatctgcaa aatcacctaa cgatgatatt 1500

aaatctgaca tggttatggc ataccgcgac gctatgacac aagcaggtac catgcctgca 1560

ttccaacaaa tcaagacttg gattaccact aaaaaaatac aaggtgaaga agcagcccaa 1620

atcatgggat ccctcgctca cacgttgcgt taccccacaa aagatctgat gagccagttc 1680

ttcaatttag cattcagtga tgaagtcaga gaacaaagat atttaaacac aaccgcctta 1740

attagcgctg tgaagttcat taacatggga tatgttaacc aaaaaatgtc tagagctcgt 1800

tacccgacac tgatgtacgg tcaactgact tcgaataagg ataaatttgt cgaaatagaa 1860

attttgcctc gtctggtaaa agagttggac gaagcaattg ctcgcgacga caaacacaag 1920

gcacaagtaa tgatcaaagc gatgggaact cttggtcata atgccattct tcgcgctttt 1980

gctccatact tggaaggaga aatagaaact tcaacttatc ttcgccgata catggttgag 2040

aacctggacg ttctggctta tcaaaaggat cacttcgccc gctcagtttt gtacaacatt 2100

atcagaaaca cggcagagac ccctgaggta agggtggccg caatctttaa catcttcgct 2160

ggaagaccca cctcagctat gatgcattcg atggcgtaca tgactaagga agaccctagc 2220

cagcaagtac gctccgctct cagatcagct attgaaactg ccgcggaatt gaagaatcct 2280

cgctattatg aactatctcg aactgcccaa gaagtcaaac cattgctgac caaagaaccc 2340

gtcaacgtcc tgtcttcaag actgcaatac ggcgactctt ataataaaga ttacgagttg 2400

ggggctttca atgtattaag ctacattgga agcgaaaata gtctcatgcc aaagtatctg 2460

aaatattcct ggaccaacca agcaaagggt tacaacaata aagacactat ggcggtatct 2520

ctctctgatg cctggtggtt cacggaatac ttaaaagatc ctttacaaat aagaagatcg 2580

tatgaaccga aaaaactaaa tcacaaatat accgcaaagg atgtggctga cctcttaaag 2640

atcagacacg accttactga ttctcaagaa gctgcattct actttagttg gatggaacaa 2700

gagagatatt ttgctttcag taaatacgac ttcgatattc ttagcagcga catgataaag 2760

gctttggata aattatcgaa gggcgtggac taccactatt ctaaaactat caataccaac 2820

caagtatcag tgatgttccc actagcctct ggtatgcctt tcatctacag atacaaagag 2880

cctacattga tgcatgtgaa aggaaaagca agtgctatga ttgctcataa agacaaagct 2940

acgcgttcta ccttcggaat ggaaatgcac atgacttacg cgaaaaactt agatggcagc 3000

gttggcttct tcgacatatt gacaaaccac tactccagcg ttggagttca gaacaaacta 3060

caattcaatg ttccaatcaa gattgaacta gaaagagaag acaacgaact gaagattgag 3120

gttgaacctc tgcatccgga acaggatata gcgctggcac attacagtgt gtggccctac 3180

agtgctaggc agaagaagga tgcccacgtc accgtcgctg tcgaccccac cacgaaagtc 3240

atagagagag taaataaagt acataatatc gatatgaggt tcggacaagc cgcgatagga 3300

tcgcaattcc agatgcaagg atattcatat tcaacagact accgcaacat tgctacactg 3360

ctgaaaaccg acgatctgct tgggaatatg gcttacatat tcaaccagaa agatatcgct 3420

ctgacacact acaacttgcg ttatctatca agacaatcgc ctaataaacg catgtctatc 3480

agtttagttt acgatgagag ggaaaagaag aacgacgcta agaaaccttt atatccagtg 3540

cacgagatgg ctgatgttaa gccgaatagc gaaactcgtc gtcaggaaat ggctgaccgt 3600

gtgacaactg aagtgaaagc ttccaaggct aaaatcatcg acatgagtgc tgtgttccat 3660

ggagcgcaga gttatgaata cgtactaact gctgcaataa gcagcagcga cattgaaact 3720

aaaacaaagt acgccatttt ctacgcaaga aaccacccca agcaaggaaa cgagcaaagc 3780

aactttgcag gaagtttcac aactcctgtg atcacatcga aaaacttcga agaagctctc 3840

aaacaggaat ccaaatctgt gttcgacggc gaactggtgt taggacagaa ggggaacatt 3900

agagtcaacg gatacatgga aagaaccagg caatacgctg agaagcttca aagatatcca 3960

aaggcgcctt tgtgcgctgc agataaagct cagttcaacc aacgcttatg ctatgcatct 4020

attctttatg ctctttctcc cgaccacatc aaggcaaaca ttgaatacaa ggatgtaagc 4080

ccgtggatca agaatctgag ccacaacatg tataacatgg tcagacatgc tttcttctgg 4140

tacgaggagg aaaatatact gaagactatg cccgacggac aagctgaaat tgatgtcacc 4200

atgtcctaca aagaccacat gttcaacatg agcatggcat cccgtgaggg ggatatgagg 4260

atttacaacg ccccgcttcc taaacagatg atggcagtgg ttggtgtatc gcctgttgat 4320

gcgaccgacg aaatggcaaa ctattttaca caacatcaat accttaaata ctgcagcgct 4380

gagcgtgaaa atatcaagac gttcagcgac aaggcttaca actatacgat gagtggatct 4440

tggcatgtgc tactgctgga cgaatggtgg gctgctggca agaggcccgc tgacgagctt 4500

gtgatccttg ctcgcaaacc aagcccggat gaacaggaga tttacatttc ataccaaaat 4560

tctgaaggag aagaaatgga aatcgaactg aaaccggaca atgttcctgg cacggttgca 4620

atcaatgtca aatcctccct aactaaatta tctcgcgatg gttccactca gtacaaacgg 4680

gatggaaacg ataaggtggc cctggagtac ttctacttgc cagacgacag actcatgctc 4740

aatattcgcg aaggtcgtct cagggcactt tacagcggaa ggaacattgt tatcttggca 4800

tacggcaacc agaaccatac tagaggactc tgcggccaca tgagcggcga gcctaacgac 4860

gacttcgtca ctcccgatgg caacctcgtt gacgaagctg atcagttcgc cgcttcctat 4920

gccctggaca gagaatacag tgacccgaaa accaaaacat tgcaagagct ggccagaaaa 4980

aacgcgtacc aaccccgtcg cgtatatcca tccgttctga ggtcggatga gtcttggacg 5040

aagtacaaca aagacaagat gcaaagcatg aagcaacaga aacagcagtc gcagtccatg 5100

tacagcgcca ggagctacgg gcagcaggac gtgccctgcc gtgtggagaa ccaagtgcag 5160

tactacgaga catatgacga aatatgtatc agcactcaga gactaccttc atgcagagct 5220

cagtgccgtg gggaaggtta cattaaaaaa tccgcccagg tagtatgcaa atcaaagatg 5280

gatgaagagt tcaaaatgta taaggaagaa atcaaacaag gccagaaccc tgaggtgtct 5340

gggcctccaa agaaacaaga gttcagagta cccagctcct gtatggagta a 5391

<210> 2

<211> 1796

<212> PRT

<213> 荔枝蒂蛀虫(Conopomorpha sinensis Bradley)

<400> 2

Met Lys Val Leu Val Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Ser Cys Ala

1 5 10 15

Asn Leu Lys Ile Lys Lys Glu Asp Lys Lys Gln Gly Lys Asn Ser Glu

20 25 30

Thr Tyr Val Thr His Ser Leu Trp Gln Asp Gly Lys Val Tyr Thr Tyr

35 40 45

Asp Val Glu Ser Phe Asn Leu Ala Ser Leu Glu Glu Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Ala Asn Thr Lys Ala Thr Leu Gln Leu Arg Val Arg Ser Gln Lys

65 70 75 80

Leu Leu His Ala Lys Leu Val Asp Val Arg His Ala Ala Met His Gln

85 90 95

Lys Phe Asn Gly Glu Arg Gln Ala Pro Asp Ser Leu Lys Tyr Glu Pro

100 105 110

Met Lys Ser Met Glu His Pro Phe Glu Ile Val Met Asn Met Asn Arg

115 120 125

Met Ser Ser Met Asn Leu Pro Ser Ser Leu Asn Leu Glu His Glu Asn

130 135 140

Phe Leu Lys Gly Ile Leu Ser Thr Leu Gln Val Asp Leu Thr Pro Tyr

145 150 155 160

Arg Lys Ala Leu Gly Ser His Asp Tyr Tyr Asp Gln Glu Arg Ser Gln

165 170 175

Gly Gln Phe Arg Lys Met Glu Thr Asp Val Thr Gly Asp Cys Glu Thr

180 185 190

Leu Tyr Ser Val Ser Pro Leu Thr Gly His Asn Lys Thr Gln Tyr Tyr

195 200 205

Asn Asp Gln Glu Pro Ile Glu Ile Thr Lys Met Lys Asp Tyr Gly Lys

210 215 220

Cys Asn His Arg Val Ala Tyr His Phe Gly Val Pro Ala Gly Ala Glu

225 230 235 240

Trp Thr Gly Thr Ala His Ser Asn Lys Glu Asn Gln Phe Met Glu Arg

245 250 255

Ala Thr Lys Thr Arg Ile Val Thr Gly Gln Gln Gly Pro Ile Tyr Asp

260 265 270

Ala Glu Thr Ile Ser Thr Val Tyr Val Asn Pro Leu Met Tyr Gly Arg

275 280 285

Gln Lys Ala Glu Ile Tyr Ser Arg Val Ser Met Lys Leu Val Ser Thr

290 295 300

Glu Asp Asp Ser Gln Pro Gln Phe Glu Met Gln Leu Asn Met Arg Gln

305 310 315 320

Val Lys Asn Leu Leu Tyr Ser Leu Gly Ser Lys Ser Ala Asn Ile Asp

325 330 335

Tyr Thr Ser Thr Ser Ala Ser Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Glu Glu

340 345 350

Ile Val Leu Asn Glu Glu Leu Asp Glu Gln Pro Ala Thr Arg Val Arg

355 360 365

Arg Ser Pro Lys Gln Arg Gly Phe Arg Ala Val Ser Val Lys Lys Leu

370 375 380

Val Ile Glu Glu Gly Asn Arg Lys Tyr Lys Asp Asp Ser Glu Ser Asp

385 390 395 400

Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Ala Tyr Gln Asn Asp Glu Ala Pro Lys

405 410 415

Gln Asn Glu Pro Ala Tyr Ala Ser Ile Tyr Met Val Pro Gln Ser Arg

420 425 430

Thr Pro Asn Lys Arg Ser Pro Met Val Val Gln Lys Leu Val Gln Glu

435 440 445

Phe Ala His Gln Leu Gln Asn Pro Asn Thr Met Ala Lys Ser Asp Thr

450 455 460

Ile Ser Lys Phe Asn Val Ile Val His Leu Ile Ala Thr Met Asn Ser

465 470 475 480

Glu Glu Leu Thr Gln Thr Thr Arg Asn Ile Glu Ser Ala Lys Ser Pro

485 490 495

Asn Asp Asp Ile Lys Ser Asp Met Val Met Ala Tyr Arg Asp Ala Met

500 505 510

Thr Gln Ala Gly Thr Met Pro Ala Phe Gln Gln Ile Lys Thr Trp Ile

515 520 525

Thr Thr Lys Lys Ile Gln Gly Glu Glu Ala Ala Gln Ile Met Gly Ser

530 535 540

Leu Ala His Thr Leu Arg Tyr Pro Thr Lys Asp Leu Met Ser Gln Phe

545 550 555 560

Phe Asn Leu Ala Phe Ser Asp Glu Val Arg Glu Gln Arg Tyr Leu Asn

565 570 575

Thr Thr Ala Leu Ile Ser Ala Val Lys Phe Ile Asn Met Gly Tyr Val

580 585 590

Asn Gln Lys Met Ser Arg Ala Arg Tyr Pro Thr Leu Met Tyr Gly Gln

595 600 605

Leu Thr Ser Asn Lys Asp Lys Phe Val Glu Ile Glu Ile Leu Pro Arg

610 615 620

Leu Val Lys Glu Leu Asp Glu Ala Ile Ala Arg Asp Asp Lys His Lys

625 630 635 640

Ala Gln Val Met Ile Lys Ala Met Gly Thr Leu Gly His Asn Ala Ile

645 650 655

Leu Arg Ala Phe Ala Pro Tyr Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Thr

660 665 670

Tyr Leu Arg Arg Tyr Met Val Glu Asn Leu Asp Val Leu Ala Tyr Gln

675 680 685

Lys Asp His Phe Ala Arg Ser Val Leu Tyr Asn Ile Ile Arg Asn Thr

690 695 700

Ala Glu Thr Pro Glu Val Arg Val Ala Ala Ile Phe Asn Ile Phe Ala

705 710 715 720

Gly Arg Pro Thr Ser Ala Met Met His Ser Met Ala Tyr Met Thr Lys

725 730 735

Glu Asp Pro Ser Gln Gln Val Arg Ser Ala Leu Arg Ser Ala Ile Glu

740 745 750

Thr Ala Ala Glu Leu Lys Asn Pro Arg Tyr Tyr Glu Leu Ser Arg Thr

755 760 765

Ala Gln Glu Val Lys Pro Leu Leu Thr Lys Glu Pro Val Asn Val Leu

770 775 780

Ser Ser Arg Leu Gln Tyr Gly Asp Ser Tyr Asn Lys Asp Tyr Glu Leu

785 790 795 800

Gly Ala Phe Asn Val Leu Ser Tyr Ile Gly Ser Glu Asn Ser Leu Met

805 810 815

Pro Lys Tyr Leu Lys Tyr Ser Trp Thr Asn Gln Ala Lys Gly Tyr Asn

820 825 830

Asn Lys Asp Thr Met Ala Val Ser Leu Ser Asp Ala Trp Trp Phe Thr

835 840 845

Glu Tyr Leu Lys Asp Pro Leu Gln Ile Arg Arg Ser Tyr Glu Pro Lys

850 855 860

Lys Leu Asn His Lys Tyr Thr Ala Lys Asp Val Ala Asp Leu Leu Lys

865 870 875 880

Ile Arg His Asp Leu Thr Asp Ser Gln Glu Ala Ala Phe Tyr Phe Ser

885 890 895

Trp Met Glu Gln Glu Arg Tyr Phe Ala Phe Ser Lys Tyr Asp Phe Asp

900 905 910

Ile Leu Ser Ser Asp Met Ile Lys Ala Leu Asp Lys Leu Ser Lys Gly

915 920 925

Val Asp Tyr His Tyr Ser Lys Thr Ile Asn Thr Asn Gln Val Ser Val

930 935 940

Met Phe Pro Leu Ala Ser Gly Met Pro Phe Ile Tyr Arg Tyr Lys Glu

945 950 955 960

Pro Thr Leu Met His Val Lys Gly Lys Ala Ser Ala Met Ile Ala His

965 970 975

Lys Asp Lys Ala Thr Arg Ser Thr Phe Gly Met Glu Met His Met Thr

980 985 990

Tyr Ala Lys Asn Leu Asp Gly Ser Val Gly Phe Phe Asp Ile Leu Thr

995 1000 1005

Asn His Tyr Ser Ser Val Gly Val Gln Asn Lys Leu Gln Phe Asn Val

1010 1015 1020

Pro Ile Lys Ile Glu Leu Glu Arg Glu Asp Asn Glu Leu Lys Ile Glu

1025 1030 1035 1040

Val Glu Pro Leu His Pro Glu Gln Asp Ile Ala Leu Ala His Tyr Ser

1045 1050 1055

Val Trp Pro Tyr Ser Ala Arg Gln Lys Lys Asp Ala His Val Thr Val

1060 1065 1070

Ala Val Asp Pro Thr Thr Lys Val Ile Glu Arg Val Asn Lys Val His

1075 1080 1085

Asn Ile Asp Met Arg Phe Gly Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Phe Gln

1090 1095 1100

Met Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Thr Asp Tyr Arg Asn Ile Ala Thr Leu

1105 1110 1115 1120

Leu Lys Thr Asp Asp Leu Leu Gly Asn Met Ala Tyr Ile Phe Asn Gln

1125 1130 1135

Lys Asp Ile Ala Leu Thr His Tyr Asn Leu Arg Tyr Leu Ser Arg Gln

1140 1145 1150

Ser Pro Asn Lys Arg Met Ser Ile Ser Leu Val Tyr Asp Glu Arg Glu

1155 1160 1165

Lys Lys Asn Asp Ala Lys Lys Pro Leu Tyr Pro Val His Glu Met Ala

1170 1175 1180

Asp Val Lys Pro Asn Ser Glu Thr Arg Arg Gln Glu Met Ala Asp Arg

1185 1190 1195 1200

Val Thr Thr Glu Val Lys Ala Ser Lys Ala Lys Ile Ile Asp Met Ser

1205 1210 1215

Ala Val Phe His Gly Ala Gln Ser Tyr Glu Tyr Val Leu Thr Ala Ala

1220 1225 1230

Ile Ser Ser Ser Asp Ile Glu Thr Lys Thr Lys Tyr Ala Ile Phe Tyr

1235 1240 1245

Ala Arg Asn His Pro Lys Gln Gly Asn Glu Gln Ser Asn Phe Ala Gly

1250 1255 1260

Ser Phe Thr Thr Pro Val Ile Thr Ser Lys Asn Phe Glu Glu Ala Leu

1265 1270 1275 1280

Lys Gln Glu Ser Lys Ser Val Phe Asp Gly Glu Leu Val Leu Gly Gln

1285 1290 1295

Lys Gly Asn Ile Arg Val Asn Gly Tyr Met Glu Arg Thr Arg Gln Tyr

1300 1305 1310

Ala Glu Lys Leu Gln Arg Tyr Pro Lys Ala Pro Leu Cys Ala Ala Asp

1315 1320 1325

Lys Ala Gln Phe Asn Gln Arg Leu Cys Tyr Ala Ser Ile Leu Tyr Ala

1330 1335 1340

Leu Ser Pro Asp His Ile Lys Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Asp Val Ser

1345 1350 1355 1360

Pro Trp Ile Lys Asn Leu Ser His Asn Met Tyr Asn Met Val Arg His

1365 1370 1375

Ala Phe Phe Trp Tyr Glu Glu Glu Asn Ile Leu Lys Thr Met Pro Asp

1380 1385 1390

Gly Gln Ala Glu Ile Asp Val Thr Met Ser Tyr Lys Asp His Met Phe

1395 1400 1405

Asn Met Ser Met Ala Ser Arg Glu Gly Asp Met Arg Ile Tyr Asn Ala

1410 1415 1420

Pro Leu Pro Lys Gln Met Met Ala Val Val Gly Val Ser Pro Val Asp

1425 1430 1435 1440

Ala Thr Asp Glu Met Ala Asn Tyr Phe Thr Gln His Gln Tyr Leu Lys

1445 1450 1455

Tyr Cys Ser Ala Glu Arg Glu Asn Ile Lys Thr Phe Ser Asp Lys Ala

1460 1465 1470

Tyr Asn Tyr Thr Met Ser Gly Ser Trp His Val Leu Leu Leu Asp Glu

1475 1480 1485

Trp Trp Ala Ala Gly Lys Arg Pro Ala Asp Glu Leu Val Ile Leu Ala

1490 1495 1500

Arg Lys Pro Ser Pro Asp Glu Gln Glu Ile Tyr Ile Ser Tyr Gln Asn

1505 1510 1515 1520

Ser Glu Gly Glu Glu Met Glu Ile Glu Leu Lys Pro Asp Asn Val Pro

1525 1530 1535

Gly Thr Val Ala Ile Asn Val Lys Ser Ser Leu Thr Lys Leu Ser Arg

1540 1545 1550

Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Lys Arg Asp Gly Asn Asp Lys Val Ala Leu

1555 1560 1565

Glu Tyr Phe Tyr Leu Pro Asp Asp Arg Leu Met Leu Asn Ile Arg Glu

1570 1575 1580

Gly Arg Leu Arg Ala Leu Tyr Ser Gly Arg Asn Ile Val Ile Leu Ala

1585 1590 1595 1600

Tyr Gly Asn Gln Asn His Thr Arg Gly Leu Cys Gly His Met Ser Gly

1605 1610 1615

Glu Pro Asn Asp Asp Phe Val Thr Pro Asp Gly Asn Leu Val Asp Glu

1620 1625 1630

Ala Asp Gln Phe Ala Ala Ser Tyr Ala Leu Asp Arg Glu Tyr Ser Asp

1635 1640 1645

Pro Lys Thr Lys Thr Leu Gln Glu Leu Ala Arg Lys Asn Ala Tyr Gln

1650 1655 1660

Pro Arg Arg Val Tyr Pro Ser Val Leu Arg Ser Asp Glu Ser Trp Thr

1665 1670 1675 1680

Lys Tyr Asn Lys Asp Lys Met Gln Ser Met Lys Gln Gln Lys Gln Gln

1685 1690 1695

Ser Gln Ser Met Tyr Ser Ala Arg Ser Tyr Gly Gln Gln Asp Val Pro

1700 1705 1710

Cys Arg Val Glu Asn Gln Val Gln Tyr Tyr Glu Thr Tyr Asp Glu Ile

1715 1720 1725

Cys Ile Ser Thr Gln Arg Leu Pro Ser Cys Arg Ala Gln Cys Arg Gly

1730 1735 1740

Glu Gly Tyr Ile Lys Lys Ser Ala Gln Val Val Cys Lys Ser Lys Met

1745 1750 1755 1760

Asp Glu Glu Phe Lys Met Tyr Lys Glu Glu Ile Lys Gln Gly Gln Asn

1765 1770 1775

Pro Glu Val Ser Gly Pro Pro Lys Lys Gln Glu Phe Arg Val Pro Ser

1780 1785 1790

Ser Cys Met Glu

1795

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列 CsVg-F(Artificial sequence CsVg-F)

<400> 3

cmymtgadgt nmgrgtkgcn gc 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列 CsVg-R(Artificial sequence CsVg-R)

<400> 4

gcaswrtang gccanacrc 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列 3-CsVg-F(Artificial sequence 3-CsVg-F)

<400> 5

agcatgaaac tggtatctac gg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列 5-CsVg-R(Artificial sequence 5-CsVg-R)

<400> 6

atcgaatgca tcatagctg 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 Real-CsVg-F(Artificial sequence Real-CsVg-F)

<400> 7

atgcaaccat agagtcgc 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列 Real-CsVg-R(Artificial sequence Real-CsVg-R)

<400> 8

atcatcttcc gtagatacca g 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 Real-actin-F(Artificial sequence Real-actin-F)

<400> 9

agatctggca ccacacct 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列 Real-actin-R(Artificial sequence Real-actin-R)

<400> 10

acgataccgg tggtacgac 19

Claims

1.一种荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白，其特征在于，所述的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白是由权利要求1所述的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg编码的。

4.一种药物对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的检测方法，其特征在于，通过检测施用药物和未施用药物的荔枝蒂蛀虫的权利要求1所述的卵黄原蛋白基因CsVg的表达量来判断该药物施用后荔枝蒂蛀虫繁殖力是否受到影响。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，是分别提取施用药物和未施用药物的荔枝蒂蛀虫的RNA，再反转录为cDNA，再以Real-CsVg-F:5’-ATGCAACCATAGAGTCGC-3’和Real-CsVg-R:5’-ATCATCTTCCGTAGATACCAG-3’作为检测引物检测卵黄原蛋白基因CsVg的表达量，如果施用药物的荔枝蒂蛀虫的卵黄原蛋白基因CsVg的表达量小于未施用药物的荔枝蒂蛀虫的卵黄原蛋白基因CsVg的表达量，则该药物处理后的荔枝蒂蛀虫繁殖力下降；反之则药物处理后的荔枝蒂蛀虫繁殖力上升；如果两者表达量相当，则药物不影响荔枝蒂蛀虫繁殖力。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的检测卵黄原蛋白基因CsVg的表达量是通过荧光定量PCR的方法来检测，所述的荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s。

7.一种检测药物对荔枝蒂蛀虫繁殖力影响的试剂盒，包括PCR反应试剂和PCR反应引物，其特征在于，所述的PCR反应引物为：Real-CsVg-F:5’-ATGCAACCATAGAGTCGC-3’和Real-CsVg-R:5’-ATCATCTTCCGTAGATACCAG-3’。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括Real-actin-F:5’-AGATCTGGCACCACACCT-3’和Real-actin-R:5’-ACGATACCGGTGGTACGAC-3’。

9.一种权利要求1所述的荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取荔枝蒂蛀虫总RNA，反转录合成荔枝蒂蛀虫cDNA模板；

(3)根据SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit Clontech操作指南合成RACE所需cDNA模板，以此cDNA模板为模板，以5-CsVg-R：5’-ATCGAATGCATCATAGCTG-3’，3-CsVg-F：5’-AGCATGAAACTGGTATCTACGG-3’作为引物进行PCR扩增，获得目的片段；