CN115058523B - 一种基于微卫星位点鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物及检测方法 - Google Patents

一种基于微卫星位点鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于微卫星位点鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物及检测方法。所述的用于鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物，包括SEQ ID NO：1所示的正向引物和SEQ ID NO：2所示的反向引物。本发明基于转录组数据的微卫星位点开发荔枝尖细蛾的特异性分子标记，标记具备易于开发，特异性强等优点，且实验操作仅需要PCR扩增和电泳两个步骤，检测全过程仅需要3小时左右，大大提高了鉴定的准确率和效率。可为荔枝、龙眼病虫害的精准防治提供技术支撑。

Description

一种基于微卫星位点鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物及检测 方法
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种基于微卫星位点鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物及检测方法。
背景技术
荔枝尖细蛾（Conopomorpha litchielle）隶属鳞翅目（Lepidoptera）细蛾科（Gracilariidae）爻纹细蛾属（Conopomorpha），是荔枝、龙眼上一类重要的害虫。主要危害荔枝、龙眼的嫩叶、嫩梢，尤其是在荔枝秋梢期，荔枝尖细蛾大面积蛀食寄主秋梢中脉，造成嫩梢死亡，对来年荔枝、龙眼的产量造成巨大影响。目前，我国的荔枝园生存着多种爻纹细蛾属的害虫危害荔枝，这些种类成虫、幼虫以及卵的形态特征十分相似，即使专业的分类学者进行鉴定也极易将其混淆，一般的种植技术人员对其进行区分更是面临极大地挑战。因此，开发荔枝尖细蛾的快速鉴定和准确识别方法对于防治方法的研究及实施均具有重要意义。
利用分子标记进行物种分类鉴定，已经广泛应用于生物物种的分类鉴定。尤其是线粒体基因以及核糖体基因能反映较短时期的进化时间，尤其是低级阶元的进化现象，因而被广泛应用在生物种及种下阶元的鉴定，并建立了基于线粒体COI分子片段的生物条形码数据库。目前，利用线粒体COI以及核糖体ITS1等基因的通用引物能够广泛扩增出鳞翅目的目的片段，但该技术需要对克隆序列进行电泳、测序分析、序列比对等步骤，成本较高，但效率较低，鉴定时间往往超过2天以上。且该种方法特异性差，并不能高效鉴定荔枝尖细蛾。
微卫星( microsatellite) DNA 又称简单重复序列 ( simple sequencerepeat，SSR) ，具有重复性高、多态性强、良好的基因组覆盖性等特点，已被广泛用于种群遗传学、遗传育种和近缘物种、品种鉴定等生物科学领域研究。尤其是在昆虫近源种区分鉴定过程中，微卫星位点具备特异性强、挖掘容易等优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种从荔枝尖细蛾微卫星位点中克隆得到其特异性分子片段的引物及检测方法，它可以快速、精准地鉴定荔枝尖细蛾。
本发明基于荔枝尖细蛾的转录组数据，开发一种荔枝尖细蛾微卫星位点的特异性分子标记，快速鉴定区分该类害虫及其近源种。
本发明提供一对用于鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物，其特征在于，包括SEQ IDNO：1（TTGATACAAC CACTGGCGTT TT）所示的正向引物和SEQ ID NO：2（GAAAATCCACCCTGAGAGC）所示的反向引物，扩增的核苷酸序列如SEQ ID NO：3（ttgatacaac cactggcgtttttaataccttgaatattttgttttggtgtatctttgctaTgttagtttacttgaaacaaaagtttactttaaaacattaataccaatgttcgacactagAatttatttacgttaatgttatattttattgctaagtgtctttatattgttgataagccaGtataaataaataaataaataataataataatgctctcagggtggattttc）所示。
本发明提供了一种荔枝尖细蛾的检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待测物种的基因组DNA；
（2）以基因组DNA为模板，利用上述特异性引物行PCR扩增；
（3）分析扩增引物，如果能扩增出特异性产物则为荔枝尖细蛾。
优选，步骤（2）中，PCR扩增的程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，50~55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。
优选，步骤（3）中，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现一条231bp的条带，则判定为所测昆虫为荔枝尖细蛾。
本发明还提供了一种检测荔枝尖细蛾的试剂盒，其含有上述特异性引物。还包括PCR反应试剂。
本发明有益的技术效果如下：
本发明基于荔枝昆虫微卫星位点的快速鉴定技术，在荔枝尖细蛾转录组数据中的筛选出微卫星位点设计了该物种区分爻纹细蛾属其他种类的特异性引物，相比传统利用COI和核糖体ITS1等基因序列进行比对区分近缘种时，需要PCR扩增、电泳、测序分析、序列比对等步骤，鉴定时间往往超过2天以上。而本发明基于转录组数据的微卫星位点开发荔枝尖细蛾的特异性分子标记，标记具备易于开发，特异性强等优点，且实验操作仅需要PCR扩增和电泳两个步骤，检测全过程仅需要3小时左右，大大提高了鉴定的准确率和效率。可为荔枝、龙眼病虫害的精准防治提供技术支撑。
附图说明
图1 为基于10个微卫星位点对应设计的10对引物对荔枝尖细蛾DNA样本的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M：DNA Marker；1：正向引物CLSSR1(F)，反向引物CLSSR1(R)；2：正向引物CLSSR2(F)，反向引物CLSSR2(R)；3：正向引物CLSSR3(F)，反向引物CLSSR3(R)；4：正向引物CLSSR4(F)，反向引物CLSSR4(R)；5：正向引物CLSSR5(F)，反向引物CLSSR5(R)；6：正向引物CLSSR6(F)，反向引物CLSSR6(R)；7:正向引物CLSSR7(F)，反向引物CLSSR7(R)；8：正向引物CLSSR8(F)，反向引物CLSSR8(R)；9：正向引物CLSSR9(F)，反向引物CLSSR9(R)；10：正向引物CLSSR10(F)，反向引物CLSSR10(R)。
图2为微卫星位点特异性引物CLSSR3(F)，CLSSR3(R）对荔枝尖细蛾及近源种DNA样本PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：DNA Marker；1：荔枝尖细蛾；2：荔枝蒂蛀虫；3：可可细蛾；4：荔枝梢细蛾。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明，而并非对本发明的限制。
实施例1：
1.荔枝尖细蛾基因组提取
利用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(天根生化科技（北京）有限公司)用于荔枝尖细蛾总DNA 的提取。
（1）将荔枝尖细蛾单虫用双蒸水清洗、吸干放入1.5mL离心管，放入20μLProteinase K，利用移液枪枪头将虫体捣碎混匀后，在56℃的金属浴中放置，直至组织溶解。
（2）加入200μL缓冲液GB，充分混匀，在70℃的金属浴中放置10分钟，短暂离心去除管盖内水珠。
（3）加入200μL无水乙醇，充分震荡15秒后，短暂离心去除管盖内水珠。
（4）将上一步所得的溶液混合物倒入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30秒，倒掉废弃液。
（5）向吸附柱加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废弃液。
（6）向吸附柱加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废弃液。该步骤重复2次。
（7）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废弃液，将吸附柱置于温室放置数分钟，晾干吸附材料中的漂洗液。
（8）将吸附柱转入一个干净的离心管，向吸附膜的中间滴加100μL洗脱缓冲液TE，温室放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中，该部分溶液即荔枝尖细蛾的DNA。DNA产物应该保存在-20℃。
2.引物设计
利用Trinity软件在荔枝尖细蛾的转录组数据寻找具有SSR位点的基因序列，挑选其中10条具备SSR位点的基因序列，利用Primer 5.0进行引物设计，共获得10对荔枝尖细蛾的SSR位点引物，包括：正向引物CLSSR1(F)，反向引物CLSSR1(R)；正向引物CLSSR2(F)，反向引物CLSSR2(R)；正向引物CLSSR3(F)，反向引物CLSSR3(R)；正向引物CLSSR4(F)，反向引物CLSSR4(R)；正向引物CLSSR5(F)，反向引物CLSSR5(R)；正向引物CLSSR6(F)，反向引物CLSSR6(R)；正向引物CLSSR7(F)，反向引物CLSSR7(R)；正向引物CLSSR8(F)，反向引物CLSSR8(R)；正向引物CLSSR9(F)，反向引物CLSSR9(R)；正向引物CLSSR10(F)，反向引物CLSSR10(R)（表1）。
表1 荔枝尖细蛾10个微卫星SSR位点设计的10对特异性引物
Figure 204571DEST_PATH_IMAGE001
3.荔枝尖细微卫星位点引物验证
以荔枝尖细蛾的DNA作为模板，对上一步骤获得的10对SSR引物能否有效扩增荔枝尖细蛾的SSR位点进行验证。PCR反应体系为25μL，包括：12μL的TaqPCR mix，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 10μL。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶分离，电泳缓冲液为1XTBE，取5μL PCR产物，标准分子量为1200 bpDNA Ladder，120V恒压电流25分钟，利用凝胶系统观察拍照，检测10对不同引物扩增的PCR产物样品是否出现条带。
引物的验证结果如图1所示，最终仅有1对引物可有效扩增荔枝尖细蛾对应的微卫星位点，该引物为正向引物CLSSR3(F)，反向引物CLSSR3(R)。
引物序列如下（SEQ ID：1-2）：
正向引物CLSSR3(F)：5’ -TTGATACAACCACTGGCGTTTT-3’；
反向引物CLSSR3(R)：5’-GAAAATCCACCCTGAGAGC-3’。
4.荔枝尖细蛾特异性引物检验
以荔枝尖细蛾的近源种荔枝蒂蛀虫，可可细蛾，荔枝梢细蛾为对照，对正向引物CLSSR3(F)和反向引物CLSSR3(R)的特异性进行检验。PCR反应体系为25μL，包括：12μL的TaqPCR mix，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 10μL。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶分离，电泳缓冲液为1XTBE，取5μLPCR产物，标准分子量为1200 bp DNA Ladder，120V恒压电流25分钟，利用凝胶系统观察拍照，检测各个样品是否出现条带。
电泳结果如图2所示，仅有荔枝尖细蛾能够检测到231bp特异性条带。因此，本发明基于微卫星位点的特异性引物的特异性强，荔枝尖细蛾的DNA能检测出单一条带，不能够检测出其近源种荔枝蒂蛀虫、荔枝梢细蛾以及可可细蛾。这充分表明本发明的特异性引物能够快速、专一检测出荔枝尖细蛾。

Claims (5)

1.一对用于鉴定荔枝尖细蛾的特异性引物，其特征在于，包括SEQ ID NO：1所示的正向引物和SEQ ID NO：2所示的反向引物。
2.一种荔枝尖细蛾的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待测物种的基因组DNA；
（2）以基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物行PCR扩增；
（3）对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现一条231bp的条带，则判定待测物种为荔枝尖细蛾。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，50~55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。
4.一种检测荔枝尖细蛾的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异性引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应试剂。
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