CN115820907B

CN115820907B - 一种引物对在鉴定甜瓜叶形中的应用

Info

Publication number: CN115820907B
Application number: CN202211307560.2A
Authority: CN
Inventors: 栾非时; 刘识; 方旭峰; 王学征; 高鹏; 刘宏宇; 朱子成; 马鸿艳; 杜黎黎; 戴祖云; 赵景超; 董春英; 刘利锋; 肖长文
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2042-10-25
Also published as: CN115820907A

Abstract

本发明公开一种引物对在鉴定甜瓜叶形中的应用，属于鉴定甜瓜叶形技术领域。为了更快捷和准确地在甜瓜苗期鉴定叶形。一种引物对在鉴定甜瓜叶形中的应用，所述引物对为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，通过分子标记辅助选择的方法，在甜瓜苗期即可对叶形进行分子标记辅助选择，提高了筛选的准确性和效率，具有重要的理论和实践意义。

Description

一种引物对在鉴定甜瓜叶形中的应用

技术领域

本发明属于鉴定甜瓜的叶形的表型的技术领域，具体涉及一种引物对在鉴定甜瓜的叶形的表型中的应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是重要的葫芦科经济作物，在我国及世界范围内广泛栽培。甜瓜叶形具有十分丰富的变异，主要包括：圆叶、裂叶、掌状叶等，叶片形态建成直接影响植株的光合作用，是甜瓜栽培生产过程中的重要性状。申请人前期研究发现，在圆叶和裂叶遗传背景下，甜瓜圆叶性状为单隐性遗传，在此基础之上，利用基因组重测序、BSA-seq技术获得与甜瓜圆叶性状紧密连锁的染色体区段，在区段内开发分子标记，在自然群体中进行验证，开发与甜瓜圆叶性状紧密连锁的分子标记，应用圆叶甜瓜材料苗期筛选。

目前筛选圆叶甜瓜的方式主要是待植株定植并生长一段时间后，采用肉眼观测的方式进行鉴定，耗时费力，且不同人员的鉴定标准存在明显差异，严重影响了叶形鉴定的准确性。甜瓜的苗期指的是子叶期或者长出叶子的早期，还看不出来叶片形状的时候，所以在苗期的甜瓜是通过肉眼看不出来叶片的性状。亟需一种科学的在甜瓜苗期鉴定叶片性状的方法。

发明内容

本发明的目的是为了更快捷和准确地在甜瓜苗期对其叶片形状进行鉴定。

本发明提供一种引物对在鉴定甜瓜叶形鉴定中的应用，所述引物对为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

进一步地限定，所述叶形为圆叶或裂叶性状。

本发明提供一种鉴定甜瓜叶形的方法，所述方法如下：

步骤1：提取待测甜瓜叶片的基因组DNA；

步骤2：以步骤1获得的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；

步骤3：用限制性内切酶对步骤2获得的PCR产物进行酶切，获得酶切产物；

步骤4：通过检测酶切产物，判断甜瓜叶形。

进一步地限定，步骤3中所述的内切酶为MspI。

进一步地限定，步骤4中检测的酶切产物不具有608bp片段则表现为裂叶性状，具有 608bp片段则表现为圆叶性状。

本发明提供一种鉴定甜瓜叶形的试剂盒，所述试剂盒含有SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

进一步地限定，所述试剂盒还包括限制性内切酶MspI。

本发明提供一种与甜瓜圆叶性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记为SEQ IDNO.1 所示，第422位的碱基为A或G。

本发明提供上述的试剂盒、上述的分子标记或SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对或在鉴定甜瓜的叶形的表型中的应用。

本发明提供上述的试剂盒、上述的分子标记或SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对在甜瓜叶形辅助鉴定、辅助育种及甜瓜叶形筛选中的应用。

有益效果：CAPS分子标记是由于酶切位点处发生单碱基突变，致使酶切后产生片段长度多态性的一种分子标记，该类标记在基因组中分布广泛，操作简便，结果易于观察，在相同物种不同材料中具有普遍适用性。

本发明在前期通过高通量测序、BSA-seq分析开展甜瓜圆叶关键基因定位研究，在获得定位结果基础之上，开发与其紧密连锁的CAPS分子标记，通过分子标记辅助选择的方法，在甜瓜苗期即可对叶形进行分子标记辅助选择，提高了筛选的准确性和效率，具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为实施例1中甜瓜圆叶关键基因初步定位结果图。

图2为实施例1中母本(裂叶)和父本(圆叶)、F₁代和自然群体的酶切电泳结果图。

具体实施方式

实施例1：获得鉴定甜瓜叶片表型的引物对的方法

本实施例为甜瓜圆叶性状关键基因连锁位点与CAPS标记，以及该标记的获取方法。

A.供试材料的选取：所述的供试材料包括母本(裂叶)、父本(圆叶)、F1代和自然群体；

所述的母本材料为：1190wd，裂叶；所述的母本材料为：MR-1，圆叶；(两个亲本文献来源：Liu Shi,Gao Peng,Zhu Qianglong,Zhu Zicheng,Liu Hongyu,Wang Xuezheng,WengYiqun,Gao Meiling and Luan Feishi*.Resequencing of 297melon accessionsreveals the genomic history of improvement and loci related to fruit traitsin melon.2020,18,2545-2558,Plant Biotechnology Journal.附表中记载)

所述的F₁代为：以上述两材料为亲本进行杂交获得的F₁代；

所述的F₂代群体为：上述F₁代自交获得的F₂代群体。

B.供试材料叶形确定：于定植后开花期调查各个单株的叶片性状；

根据步骤B中的调查结果表明：F₁代表现为裂叶，F₂代单株中，具有圆叶和裂叶单株数符合3:1的分离比例，说明甜瓜圆叶性状由单隐性基因调控。

C.利用BSA-seq及遗传连锁分析方法，获得与甜瓜圆叶性状紧密连锁的染色体区段。在F2世代中选择具有圆叶和裂叶性状单株各20株，分别提取各单株DNA，调节DNA浓度一致后等量混合，构建圆叶和裂叶基因池，进行BSA-seq分析；根据BSA-seq分析结果结合两亲本基因组重测序数据，在BSA-seq分析结果的染色体区段内开发CAPS分子标记，在 F₂代进行遗传连锁分析，缩短定位区间，将甜瓜圆叶性状定位于甜瓜8号染色体上，图1为初步定位结果，获得Chr08_11019720和Chr08_14674941之间的序列设计引物。

D.候选CAPS标记开发。根据两亲本重测序数据，开发CAPS分子标记，在F₂代分离群体中对各单株进行基因分型，结合表型数据，判断基因型与表型的符合度。结果表明，该区段内存在一处SNP位点的变化(G→A)与甜瓜圆叶性状紧密连锁。

根据Chr08_11019720和Chr08_14674941之间的序列设计引物对：round leaf-F(上游引物序列)：round leaf-F：GTGAGGATTGGAGTCAGACATTG(SEQ ID NO.3)；round leaf-R： TTGGAGTGATAGTAGGCGAGAAT(SEQ ID NO.4)。

实施例2：检测甜瓜叶片表型的方法

基因组DNA的提取：

分别提取所述的父本、母本、F₁代、F₂代和自然群体内各单株基因组DNA；所述的DNA提取方法参照Murray等(1980)的方法(Murray M.,Thompson W.F.,Rapid isolation ofhigh molecular weight plant DNA[J].Nucl.Acid.Res.,1980,8:668-673.)，并在此基础上进行改良。

具体步骤如下：

i.将采集的幼嫩真叶用无菌水洗净擦干后，取0.2g放入1.5mL离心管中，加入液氮充分研磨至白色粉末，加入800μL 65℃预热的2％的CTAB溶液(2％ CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH＝8.0)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA pH＝8.0，2％β-巯基乙醇)充分混匀， 65℃水浴1h，每隔10分钟轻摇一次。

ii.取出离心管，待冷却至室温，13,000rpm离心10分钟。贴壁吸出上清液置于新离心管中，为防止机械剪切力损坏DNA，转移所用的枪头需提前用剪刀减去尖端部分，扩大吸液口。

iii.贴壁加入750μL氯仿：异戊醇(24：1，V/V)溶液，充分混匀，静止10分钟后， 13,000rpm离心10分钟。

iv.取出离心管，采用上述相同的处理方法用枪头贴壁吸出700μL上清液置于新离心管中。

v.贴壁加入700μL氯仿：异戊醇(24：1，V/V)溶液，轻轻摇动离心管使溶液充分和混合，静止10分钟后13,000rpm离心10分钟。

vi.贴壁吸出650μL上清液置新管中，加入2μL RNase(10mg/mL)混匀，放置37℃水浴2小时。

vii.贴壁加入650μL氯仿：异戊醇(24：1，V/V)溶液，充分混合，静止10分钟后13,000 rpm离心10分钟。

viii.贴壁吸出550μL上清液置新管中加入-20℃预冷的550μL异丙醇(贴壁加入)，盖紧离心管盖，上下颠倒数次后置于-20℃冰箱静止60分钟。

ix.取出离心管，于离心机中13,000rpm离心10分钟，小心弃去上清液，保留离心管底部沉淀物。

x.用预冷的70％乙醇清洗沉淀三次，并将离心管置于超净工作台中，无菌风吹干后加入200μL ddH2O溶解，于-20℃中保存备用。

F.利用亲本重测序数据开发与甜瓜圆叶性状紧密连锁的CAPS分子标记。

具体操作为：在初步定位区间内，依据两亲本测序数据存在的SNP差异，利用SNP2CAPS 软件查找存在酶切位点的差异序列，进行引物设计。利用CAPS引物对所述的父本、母本、 F1代和F2代群体内各单株基因组DNA进行PCR扩增，再对上述各自的PCR扩增产物进行酶切反应，得到各自的酶切产物；

上述PCR反应中所述引物序列如下：

round leaf-F：GTGAGGATTGGAGTCAGACATTG(SEQ ID NO.3)；

round leaf-R：TTGGAGTGATAGTAGGCGAGAAT(SEQ ID NO.4)；

上述PCR反应体系为：上下游引物各1μL(引物浓度为2pM)，DNA模板2μL(浓度为30ng/μL)10×PCR Buffer 1μL(含Mg2+15mM)，dNTP 0.15μL(浓度为10mM)，Taq 酶0.1μL(5U/μL)，无菌去离子水6.75μL；

上述PCR反应程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

上述酶切反应体系及程序为：PCR产物5μL(浓度为0.1～0.5μg)，限制性内切酶MspI (5'C↓CGG3’)0.3μL，Buffer 1μL，去离子水9μL，将上述混合产物于37℃水浴酶切2h后，4℃保存

PCR扩增产物和酶切产物检测：分别取3μL PCR产物或酶切产物，加入1μL LoadingBuffer，混匀后点入1％琼脂糖凝胶中，110V/500mA电泳，电泳时间为25-30min；

依据电泳结果判断甜瓜是否具有圆叶性状，可以被切开(或不具有608bp片段)则表现为裂叶性状，不能切开(或者具有608bp片段)则表现为圆叶性状，结果如图2所示。

图2为实施例1中母本(裂叶)和父本(圆叶)、F₁代和自然群体限制性内切酶酶切后的电泳结果(泳道1为分子量Marker，自上而下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道2、3和4依次为父本、母本、F₁代的酶切结果)，泳道5-10 为自然群体中具有裂叶性状的甜瓜品系，泳道11-30为自然群体中具有圆叶性状的甜瓜品系，试验结果显示圆叶性状数鉴定结果与标记基因分型结果呈现较高的相关性，说明该标记可以应用于甜瓜叶形的苗期分子标记鉴定，基因型和表型是完全一致的，符合度100％。

如果待检测的样本中含有SEQ ID NO.1的序列，422位的碱基为A，那么甜瓜的叶片为圆叶性状的甜瓜品系；

如果待检测的样本中含有SEQ ID NO.2的序列，在SEQ ID NO.1的序列的基础上422 位的碱基为G，那么甜瓜的叶片为裂叶性状的甜瓜品系。

实施例3：检测甜瓜的叶片的表型的试剂盒

round leaf-F：GTGAGGATTGGAGTCAGACATTG(SEQ ID NO.3)；round leaf-R：TTGGAGTGATAGTAGGCGAGAAT(SEQ ID NO.4)；引物浓度为2pM、10×PCR Buffer(含 Mg2+15mM)，dNTP(浓度为10mM)，Taq酶(5U/μL)，无菌去离子水。

本实施例中所用到的仪器和试剂均为市场常规产品。

虽然本发明已经以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

SEQ ID NO.1：

GTGAGGATTGGAGTCAGACATTGTATTAAGAGTAAGTTTGACAAATTCTAAGGGGCA GTTAGACTCTTCACTCATGCCCTGCCCCTAAATATGGCTAATTGAAAGAAAGGTCGCTAATCACAAAAGATAACATCCATAATAATAAAGTATTTTCTATAATGCGGATGAAAACATTTA TAACCATGTTGATGGAAGGGATGCCCAACAAACACACATGCCAGAGCCCTAAAGGTATACTTGGTCTAATTAGAGCTGAAATTGTGGACATACGTGGTACATCCAAACACATTAAGAGAAACCTATAAAAATAAACAGGTAGAAGGATAGGACTCCTTAAGACAATCTAAAGGAGTTTGAAGGTGGAGTTCATGGGAAGAAATTCTACTGATTAAATAAGTTGTTGTAAGAATG ACATTTCCCCGGAGGTATGAAGGAAGGAAAGTAGATAGCATAAGAGAACGAGATACTT CCATAAGGTGATAGTCTTTTTGCTCAGCCACCCCATTCTGTTCTGTTGTATAGGCATATGGGCATTGGTGAACAATCCCATTGGAGGTTAGGAACTCACTATGATTATGGTTTTGAATTCTCGCCTAC TATCACTCCAA

SEQ ID NO.2：

GTGAGGATTGGAGTCAGACATTGTATTAAGAGTAAGTTTGACAAATTCTAAGGGGCA GTTAGACTCTTCACTCATGCCCTGCCCCTAAATATGGCTAATTGAAAGAAAGGTCGCTAATCACAAAAGATAACATCCATAATAATAAAGTATTTTCTATAATGCGGATGAAAACATTTA TAACCATGTTGATGGAAGGGATGCCCAACAAACACACATGCCAGAGCCCTAAAGGTATACTTGGTCTAATTAGAGCTGAAATTGTGGACATACGTGGTACATCCAAACACATTAAGAGAAACCTATAAAAATAAACAGGTAGAAGGATAGGACTCCTTAAGACAATCTAAAGGAGTTTGAAGGTGGAGTTCATGGGAAGAAATTCTACTGATTAAATAAGTTGTTGTAAGAATG ACATTTCCCCAGAGGTATGAAGGAAGGAAAGTAGATAGCATAAGAGAACGAGATACTT CCATAAGGTGATAGTCTTTTTGCTCAGCCACCCCATTCTGTTCTGTTGTATAGGCATATGGGCATTGGTGAACAATCCCATTGGAGGTTAGGAACTCACTATGATTATGGTTTTGAATTCTCGCCTA CTATCACTCCAA。

Claims

1.一种引物对和内切酶MspI的组合在鉴定甜瓜的叶形的表型中的应用，其特征在于，所述引物对为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；所述叶形的表型为圆叶或裂叶性状。

2.一种鉴定甜瓜叶形的方法，其特征在于，所述方法如下：

步骤1：提取待测甜瓜叶片基因组DNA；

步骤2：以步骤1获得的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；所述引物对为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；

步骤3：用限制性内切酶对步骤2获得的PCR产物进行酶切，获得酶切产物；所述的内切酶为MspI；

步骤4：通过检测酶切产物，判断甜瓜的叶形的表型；检测的酶切产物不具有608 bp片段则表现为裂叶性状，具有608 bp片段则表现为圆叶性状。

3.一种鉴定甜瓜的叶形的表型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；所述试剂盒还包括限制性内切酶MspI。

4.一种与甜瓜圆叶性状紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SEQ IDNO.1 所示，第422位的碱基为A或G。

5.权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的分子标记在鉴定甜瓜叶形中的应用，其特征在于，所述叶形的表型为圆叶或裂叶性状。

6.权利要求3所述的试剂盒、权利要求4所述的分子标记或SEQ ID NO.3 和SEQ IDNO.4所示的引物对和内切酶MspI的组合在甜瓜的叶形的表型辅助鉴定、辅助育种及甜瓜叶形筛选中的应用，其特征在于，所述叶形的表型为圆叶或裂叶性状；所述辅助育种为鉴定圆叶或裂叶性状的辅助育种。