CN110527740A - 一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用 - Google Patents

一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用 Download PDF

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Abstract

一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用，属于分子标记技术领域。为了高效、快速鉴定南瓜性状，加快南瓜育种进程，本发明公开了一种印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记，分子标记QC‑01由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成；分子标记QC‑02由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成。本发明还提供了用于扩增上述分子标记的引物，利用回交转育的方法简便、快速地培育印度南瓜雌花率高的改良品系。

Description

一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用。
背景技术
印度南瓜(Cucurbita maxima L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita)的主要栽培种之一，其果肉和籽粒均可食用，且具有栽培容易、产量高、营养价值丰富等优点；印度南瓜是典型的雌雄异花同株植物，杂种优势明显。关于南瓜性别分化的研究报道，最早可以追溯到1970年，Kubicki等发现了强雄西葫芦植株突变体，并对控制该性状的基因进行了遗传分析，强雄性型受隐性基因(a)控制，其等位基因基因型AA或Aa植株均表现为正常的雌雄同株类型。1981年Dossey等发现油瓜全雌性状受显性基因G所控制。2016年单文琪发现印度南瓜强雌性状被单个隐性基因所控制，开发了酶切扩增多态性序列CAPS(Cleavedamplified polymorphic sequence)分子标记CAPS12距强雌基因8.1cM。杨万芳也证实了印度南瓜强雌性状受隐性单基因控制，通过简单重复序列SSR(Simple Sequence Repeat)标记技术把强雌基因定位在第二染色体约35.2Kb区域。
在生产上南瓜雌花节位的多少和高低是影响产量的主要因素，强雌系通常指植株的雌花节率达到50％以上，南瓜的强雌系往往表现出丰产、早熟、采瓜期集中等特点；此外，目前我国生产上多数种植的南瓜品种为杂交一代，而利用强雌系制备杂交一代种子，可减轻人工去雄和授粉、节约劳动力、降低制种成本、杂种纯度高等特点。在生产实践中，南瓜的不同性别类型种子外形相像，肉眼难以分辨，通常需要到植株生长的后期---开花期，才能从花的形态鉴定其性别类型。因此定位出控制印度南瓜强雌性状的基因不仅对提高印度南瓜杂交种子纯度具有重要作用，而且对于节省人力、财力也有着重要的作用。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在南瓜遗传育种中是十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快了育种的进程。
发明内容
为了高效、快速鉴定南瓜性状，加快南瓜育种进程，本发明提供了一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为QC-01或QC-02；所述分子标记QC-01由SEQID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成；所述分子标记QC-02由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成。
进一步地限定，所述分子标记QC-01中，SEQ ID NO.1所示的271nt核苷酸序列与印度南瓜强雌基因sg连锁，SEQ ID NO.2所示的271nt核苷酸序列与非强雌基因SG连锁。
进一步地限定，所述分子标记QC-02中，SEQ ID NO.3所示的558nt核苷酸序列与印度南瓜强雌基因sg连锁，SEQ ID NO.4所示的558nt核苷酸序列与非强雌基因SG连锁。
本发明还提供了扩增上述分子标记的引物，扩增分子标记QC-01的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；扩增分子标记QC-02的引物核苷酸序列如SEQ IDNO.7-SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了上述分子标记在强雌性状印度南瓜育种中的应用。
本发明还提供了上述引物在强雌性状印度南瓜育种中的应用。
本发明还提供了一种强雌性状南瓜育种的方法，包括如下步骤：
1)以强雌品系2013-12为母本，以南瓜雄性品系为父本，将所述母本与父本进行杂交，所得F1代与所述父本进行回交，得到后代BC1F1，分别利用本发明所述的分子标记QC-01和分子标记QC-02扫描BC1F1群体，选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到后代BC2F1；
2)分别利用分子标记QC-01和分子标记QC-02扫描BC2F1群体，选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，再与所述父本进行回交得到回交三代BC3F1；
3)利用分子标记QC-01和分子标记QC-02扫描BC3F1群体，选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，进行自交，后代记为BC3F2；
4)利用分子标记QC-01和QC-02扫描BC3F2，选择经分子标记QC-01扫描后具有217nt核苷酸片段且在标记QC-02具有558nt核苷酸片段的植株，即为改良强雌自交系。
优选地，步骤1)所述南瓜雄性品系为强雄9-6。
进一步地限定，所述分子标记QC-01扫描，是指利用SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用EcoRI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
进一步地限定，所述分子标记QC-02扫描，是指利用NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用AseI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
本发明中具体使用的亲本印度南瓜强雌系“2013-12”和印度南瓜强雄系“9-6”记载在“Morphological,Transcriptomic and Hormonal Characterization ofTrimonoecious and Subandroecious Pumpkin(Cucurbita maxima)Suggests ImportantRoles of Ethylene in Sex Expression”(Wang et al.,2019)，公众可通过东北农业大学获得。
有益效果
本发明利用印度南瓜强雌系“2013-12”和印度南瓜强雄系“9-6”杂交的1768株F2分离群体，通过表型分析确定了印度南瓜强雌性状属于单基因控制的隐性性状。分别取F2分离群体每株嫩叶提取基因组DNA，结合BSA-seq法筛选与sg基因紧密连锁的分子标记。利用两亲本间SNP信息最终开发两个与强雌基因sg紧密连锁的CAPS分子标记，分别座落在sg基因两侧，两标记遗传距离仅55.88Kb。本发明的两个分子标记有利于强雌性状分子标记辅助育种体系建立。本发明的分子标记可简便、快捷、高通量的应用与育种实践中。
本发明还提供了利用上述分子标记快速培育强雌性状印度南瓜的应用。利用回交转育的方法，强雌“2013-12”作为非轮回亲本，强雄“9-6”为轮回亲本，利用本发明的两个分子标记QC-01和QC-02扫描回交群体，根据PCR扩增产物的酶切条带，快速准确的改良强雄“9-6”雌花率。
附图说明
图1CAPS标记QC-01和QC-02与控制印度南瓜强雌基因sg紧密连锁图谱示意图，每个叉号表示一个单交换事件；
图2CAPS标记QC-01部分F2群体PCR扩增结果；M代表Marker 1，条带大小由上到下依次为700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp。P1代表强雌系‘2013-12’，P2代表强雄系‘9-6’，F1代表杂交第一代，F2强雌群体和F2非强雌群体分别表示在F2群体中随机挑选的10株强雌和10株非强雌植株；
图3CAPS标记QC-02部分F2群体PCR扩增结果；M代表Marker 1，条带大小由上到下依次为700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp。P1代表强雌系‘2013-12’，P2代表强雄系‘9-6’，F1代表杂交第一代，F2强雌群体和F2非强雌群体分别表示在F2群体中随机挑选的10株强雌和10株非强雌植株。
具体实施方式
实施例1.与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记的筛选。
(1)F2分离群体的构建
构建F2群体所用到的强雌亲本为印度南瓜“2013-12”，强雄亲本为印度南瓜“9-6”。统计印度南瓜前20节位雌花率，强雌亲本“2013-12”的平均雌花率约为50％，强雄亲本“9-6”的平均雌花率约为5％。本实施利用两亲本配制F1代，F1代自交产生F2代群体。种植F2群体鉴定雌花率，得出印度南瓜强雌性状为单基因控制的隐性性状。通过构建六世代群体进行遗传分析，发现强雌性状为隐性，并将强雌基因命名为subgynoecious(sg)。
(2)印度南瓜基因组DNA提取
用CTAB法提取强雌亲本“2013-12”和强雄亲本“9-6”亲本，及F2分离群体叶片的基因组总DNA。具体方法为：
取刚刚展开的一片真叶研磨成粉末状，加入700μL CTAB裂解缓冲液，剧烈振荡30秒，65℃水浴60分钟，期间上下颠倒充分混匀。向上述匀浆裂解液中加入700μL氯仿：异戊醇(24:1，v/v)，上下颠倒充分混匀，13000r/min 4℃离心15分钟。吸取上清液400μL至新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于-20℃静置30分钟，12000r/min 4℃离心10分钟。弃上清，沿离心管壁加入200μL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，12000r/min4℃离心1分钟后弃去乙醇。室温干燥沉淀30分钟，加入100μL RNA酶TE缓冲液(7:993，v/v)溶解，37℃水浴30分钟，核酸仪测定DNA浓度后用TE缓冲液稀释终浓度为30ng/μL，于－20℃备用。
(3)分子标记的获得
利用群体分离分析法(BSA)随机选取步骤(2)中F2分离群体中雌花率大于50％的强雌个体和雌花率为5％的强雄个体各30株，DNA等量等体积混合建立强雌和强雄基因池，并与强雌强雄亲本送至百迈克有限公司进行南瓜全基因组重测序(BSA-seq)。将测序获得的SNP标记与雌花率表型性状进行关联分析，将控制印度南瓜强雌基因sg定位到第二染色体上。
分析印度南瓜基因组重测序得到的SNP结果并设计CAPS标记引物。以强雌、强雄亲本和F1 DNA为模板，分别以SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物(扩增分子标记QC-01)；SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物(扩增分子标记QC-02)进行PCR扩增，随后对PCR产物进行限制性酶酶切，上述引物由华大基因合成。PCR扩增和限制性内切酶体系和程序如下：
PCR体系：2.0μL模板DNA(100ng/μL)，2.0μL 10×Buffer，2.0μL dNTPs，引物各(10μM)0.5μL，1.0U ex-Taq酶0.2μL，ddH2O 12.8μL；反应条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共循环35次；最后72℃延伸5min。
将上述的PCR产物取5μL，3.8μL ddH2O，10×Buffer 1μL 0.2μL限制性内切酶，其中分子标记QC-1扩增获得的产物使用EcoRI限制性核酸内切酶进行酶切，分子标记QC-2扩增获得的产物使用AseI限制性核酸内切酶进行酶切。反应条件为：酶切温度37℃，酶切反应时间为3h。酶切产物通过2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。分子标记QC-01和QC-02在强雌、强雄亲本和F1之间有多态性且条带清晰的标记。
(4)CAPS标记扫描F2分离群体
利用本发明开发的两个分子标记QC-01和QC-02扫描上述F2分离群体，寻找标记型与性状表现型的差别单株，获得标记与SG基因的交换单株。所述扫描过程采用的PCR体系、PCR程序和限制性内切酶体系同本实施例步骤(3)所述。酶切产物通过2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶成像系统观察成像结果。分子标记QC-01部分扫描结果见图2，强雌植株均呈现出271nt的单一条带，非强雌植株呈现出100nt和171nt的条带，或100nt、171nt和217nt的多条条带。分子标记QC-02部分扫描结果见图3，强雌植株均呈现出558nt的单一条带，非强雌植株呈现出188nt和370nt的条带，或188nt、370nt和558nt的多条条带。
以上2个分子标记经过1768株F2分离群体验证，结果表明2个分子标记均与强雌基因sg紧密连锁，且分别坐落于sg基因两侧，两标记遗传距离为55.88Kb(图1)；其中，分子标记QC-01中SEQ ID NO.1所示的序列与印度南瓜强雌基因sg连锁，不能被限制性内切酶EcoRI酶切，SEQ ID NO.2所示的序列与非强雌基因SG连锁，可被限制性内切酶EcoRI酶切成100nt和171nt核苷酸片段；分子标记QC-02中SEQ ID NO.3所示序列与印度南瓜强雌基因sg连锁，不能被限制性内切酶AseI酶切，SEQ ID NO.4所示序列与非强雌基因SG连锁，可被限制性内切酶AseI酶切成188nt和370nt核苷酸片段。
(5)多态性片段测序
以强雌亲本“2013-12”和强雄亲本“9-6”的基因组DNA为模板，分别以SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物(扩增分子标记QC-01)；SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物(扩增分子标记QC-02)进行PCR扩增进行PCR扩增。PCR反应总体系为20μL：10×Buffer 2μL，dNTP 2μL，DNA模板1.2μL，上下引物各0.8μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 13μL。PCR反应条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共循环35次；最后72℃延伸5min。
20μL PCR扩增产物中加入BioTeke SYBR Green I核酸染料5μL，室温静置10分钟使染料与DNA结合，2％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目的片段，使用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit分别回收纯化DNA片段，具体步骤参照试剂盒说明书，产品编号9762。将纯化片段送由华大基因有限公司测序，测序结果通过DNAMAN软件分析。其中以强雌“2013-12”为模板利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩增的片段大小为271nt，扩增序列见SEQ ID NO.1，不包含限制性内切酶EcoRI酶切位点。以强雄亲本“9-6”为模板利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩增的片段大小为271nt，扩增序列见SEQ ID NO.2，包含限制性内切酶EcoRI酶切位点。以强雌“2013-12”为模板利用SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物，扩增的片段大小为558nt，扩增序列见SEQ ID NO.3，不包含限制性内切酶AseI酶切位点。以强雄亲本“9-6”为模板利用SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物，扩增的片段大小为558nt，扩增序列见SEQ ID NO.4，包含限制性内切酶AseI酶切位点。
实施例2.强雌印度南瓜的育种方法。
本实施例利用回交转育的方法，以强雌“2013-12”作为非轮回亲本，强雄“9-6”为轮回亲本，定向改良强雄优良品系“9-6”的雌花率性状，具体操作步骤如下：
(1)强雌“2013-12”和强雄“9-6”进行杂交，所得F1代与强雄“9-6”进行回交得到后代BC1F1，利用本发明的两个分子标记QC-01和QC-02扫描BC1F1群体，即以BC1F1群体中每个植株DNA为模板，分别利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；以及SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物进行PCR扩增，随后对扩增产物进行限制性内切酶酶切。PCR反应体系、PCR反应条件和酶切体系同实施例1中步骤(3)所述。选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，与强雄“9-6”进行回交得到后代BC2F1。
(2)利用本发明的分子标记QC-01和QC-02扫描BC2F1群体，继续选择经标记QC-01具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，再与强雄“9-6”进行回交得到回交三代BC3F1。
(3)利用本发明的分子标记QC-01和QC-02扫描BC3F1，继续选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株,自交得到后代BC3F2。
(4)利用本发明的分子标记QC-01和QC-02扫描BC3F2群体，选择经分子标记QC-01扫描后具有217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有558nt核苷酸片段的植株，即为改良强雌自交系。定植该自交系并统计前20节位雌花率，雌花率达到55％。表明改良后的自交系具有强雌性状，并且其他农艺性状与“9-6”相似。说明利用本发明的分子标记QC-01和QC-02可对印度南瓜雌花率进行快速准确的改良。
核苷酸序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 271
<212> DNA
<213> 分子标记QC-01
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<213> 分子标记-02
<400> 4
actgaaactc ccattttgac gaaaaatagt agaacgggtt aatttcatcc aaaaaaaatt 60
atatgaaaaa aaaaagtagt ggaaggtgga ccatttcgat agaagaaaag ttaacctaaa 120
aacataaaaa caaagctcat ccacagctac aaaacttaca ctatgctctg caacatcgct 180
gccccaatca atgacacaat tattgctttc tttaggggta tactcataaa tctcttcaac 240
actttcagaa ccccacttcc aattttccta aaaacccacc aaacccagat ggaaggagca 300
agaaaggcgc catttttccg accacaattg tgggctgcag cgttggggtg tggagtggtt 360
gcattttgtt tggtgcaatt ggggcattat tgcagtttgg ttgtggtggg tggcttgttg 420
gtttgcttgg ctatggcagc ggctgcggcg gtggtaacgt ggatcacggt ggtggttttg 480
ttggtgctga ttgggcggtc gaggcggagg gtggtggcgg aggggaggaa gattagtaaa 540
gagataatgg tggggctt 558
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 分子标记QC-01 上游引物
<400> 5
tccttctggt ctgtttgggc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 分子标记QC-01下游引物
<400> 6
aggaactatc tgaacatcac ccc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 分子标记QC-02上游引物
<400> 7
actgaaactc ccattttgac gaa 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 分子标记QC-02下游引物
<400> 8
aagccccacc attatctctt tacta 25

Claims (10)

1.一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为QC-01或QC-02；所述分子标记QC-01由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成；所述分子标记QC-02由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记QC-01中，SEQ ID NO.1所示的271nt核苷酸序列与印度南瓜强雌基因sg连锁，SEQ ID NO.2所示的271nt核苷酸序列与非强雌基因SG连锁。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记QC-02中，SEQ ID NO.3所示的558nt核苷酸序列与印度南瓜强雌基因sg连锁，SEQ ID NO.4所示的558nt核苷酸序列与非强雌基因SG连锁。
4.一种扩增权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，扩增分子标记QC-01的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；扩增分子标记QC-02的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示。
5.权利要求1-3任意一项所述的分子标记在强雌性状印度南瓜育种中的应用。
6.权利要求4所述的引物在强雌性状印度南瓜育种中的应用。
7.一种强雌性状南瓜育种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以强雌品种2013-12为母本，以南瓜雄性品系为父本，将所述母本与父本进行杂交，所得F1代与所述父本进行回交，得到后代BC1F1，分别利用权利要求1所述的分子标记QC-01和分子标记QC-02扫描BC1F1群体，选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到后代BC2F1；
2)分别利用分子标记QC-01和分子标记QC-02扫描BC2F1群体，选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，再与所述父本进行回交得到回交三代BC3F1；
3)利用分子标记QC-01和分子标记QC-02扫描BC3F1群体，选择经分子标记QC-01扫描后具有100nt、171nt和217nt核苷酸片段且经分子标记QC-02扫描后具有188nt、370nt和558nt核苷酸片段的植株，进行自交，后代记为BC3F2；
4)利用分子标记QC-01和QC-02扫描BC3F2，选择经分子标记QC-01扫描后具有217nt核苷酸片段且在标记QC-02具有558nt核苷酸片段的植株，即为改良强雌自交系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)所述南瓜雄性品系为强雄9-6。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分子标记QC-01扫描，是指利用SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.6所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用EcoRI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分子标记QC-02扫描，是指利用SEQID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物，以待检测植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用AseI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
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