CN108728570A

CN108728570A - 用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物对及其应用

Info

Publication number: CN108728570A
Application number: CN201810523834.9A
Authority: CN
Inventors: 钟玉娟; 黄河勋; 李俊星; 吴廷全; 周洋洋
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2038-05-28
Also published as: CN108728570B

Abstract

本发明公开了一种与南瓜首雌节位和首雄节位QTL紧密连锁的SNP分子标记32622和分子标记63349及其应用，定位的QTL位点对该数量性状存在显著关联关系(p<0.05)，且贡献率较高，分子标记32622的解释概率为26.5％，分子标记63349的解释概率为21.9％，通过这两个分子标记可以分别预测南瓜首雌节位和首雄节位的高低。根据分子标记设计的dCAPS引物对可以简便、快速、高通量地应用于南瓜品种改良分子辅助育种，为实现南瓜首雌节位和首雄节位性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间，经验证对植株的首雌节位和首雄节位进行预测准确率分别为77％和83％。

Description

用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物对及其应用

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物对及其应用。

背景技术

在瓜类育种研究中，首雌节位和首雄节位与品种的早熟性有关，而早熟性是影响南瓜上市时间及价格的关键因素，因此找到控制第一朵雌花开花和第一朵雄花开花的关键基因，开发与之紧密连锁的分子标记对南瓜育种有着重要的意义。随着科学研究的深入，社会的需求，缩短种植时间，因此，选育低首雌、首雄节位南瓜是未来南瓜育种的重要目标之一。传统育种方式选育低首雌、首雄节位品种虽然可行，但耗时耗力，不利于我国的南瓜育种事业。提供一种新的判断南瓜首雌节位和首雄节位的方法，建立早期辅助选择技术体系，对南瓜重要农艺性状的遗传改良具有重要意义。

随着高通量测序技术的成熟，特别是大量的SNP(单碱基扩增多态性)标记的开发，应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。利用高通量测序技术开发大量的SNP标记，开发性状连锁的分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。

酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)标记是利用特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种检测SNP位点的DNA标记。其原理是SNP突变位点位于某种内切酶的识别序列上，经过特异引物PCR扩增后，用相应内切酶对PCR产物进行酶切，从而产生酶切片段的多态性，这样通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色即可显示。但是SNP恰好位于某种限制性酶切位点的这种情况还比较少，于是Michaels和Amasino及Neff在CAPS标记基础上，开发了人工引入错配碱基的衍生酶切扩增多态性标记(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS)，从而几乎能够将所有SNP位点转换成可以电泳检测的标记。无论是CAPS还是dCAPS，均具有共显性、位点特异性、操作简单、检测快速、成本低廉且不依赖于精密仪器设备等特点，可用于用于植物基因分型、定位、遗传多样性分析、品种鉴定等方面。目前暂未见用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物对及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的分子标记，由分子标记32622和分子标记63349组成；分子标记32622的核苷酸序列自5’端起第23位碱基是SNP位点，其碱基为T(SEQ ID NO.1)或C(SEQ ID NO.2)；分子标记63349的核苷酸序列自5’端起第207位碱基是SNP位点，其碱基为T(SEQ ID NO.3)或C(SEQ ID NO.4)如所示。

SEQ ID NO.1：

CTAATCCACAGCTCATTGTGAATGGTGAACTTCGAGCCCTCGAACCAGTTTTCCAGATATATGGTCGACGCCAAGTCTTTTCAGGACCAGTAGTCACACTGAAGGTATTTGAAGATAACGTCTTGATTCGTGAGTTCCTTGAGGAGAAGGGTAACGGCCGAGTTCTTGTCGTGGACGGGGGCGGTAGTAAGAGATGTGCAATATTGGGTGGCAATCCTGTTGTCCAAGCTCAAAACAATGGATGGGCTGGTATAGTTGTGAATGGATGTGTTAGAGATGTGGATGAAATTAACGGATGCGATATCGGGGTACGGGCTCTCGCTTCACATCCAATGAAAGCCTACAAAAAACGGGTCGGAGAAAAGCACGTCCCGATAACTATAGCTGGAA；

SEQ ID NO.2：

CTAATCCACAGCTCATTGTGAACGGTGAACTTCGAGCCCTCGAACCAGTTTTCCAGATATATGGTCGACGCCAAGTCTTTTCAGGACCAGTAGTCACACTGAAGGTATTTGAAGATAACGTCTTGATTCGTGAGTTCCTTGAGGAGAAGGGTAACGGCCGAGTTCTTGTCGTGGACGGGGGCGGTAGTAAGAGATGTGCAATATTGGGTGGCAATCCTGTTGTCCAAGCTCAAAACAATGGATGGGCTGGTATAGTTGTGAATGGATGTGTTAGAGATGTGGATGAAATTAACGGATGCGATATCGGGGTACGGGCTCTCGCTTCACATCCAATGAAAGCCTACAAAAAACGGGTCGGAGAAAAGCACGTCCCGATAACTATAGCTGGAA；

SEQ ID NO.3：

TGAACCGAGGACACCTAAGCTCACTGCTAATAGACATTGTCTGTTTTAGTCCGTTACGTATTACCATCAAAACAGAGAATCAAAGGCACCCAAGCCCACTGCTAGCCAATATTGTTCGTTTTAGCCTATTACGTATCACCGTTAACCTCACAGTTTTAAAACACGTCTGCTATTGAGAGGTTTCCACACACTTACAAAGAATACCTTGTTCCCTTCTCCAACCAACGTGG；

SEQ ID NO.4：

TGAACCGAGGACACCTAAGCTCACTGCTAATAGACATTGTCTGTTTTAGTCCGTTACGTATTACCATCAAAACAGAGAATCAAAGGCACCCAAGCCCACTGCTAGCCAATATTGTTCGTTTTAGCCTATTACGTATCACCGTTAACCTCACAGTTTTAAAACACGTCTGCTATTGAGAGGTTTCCACACACTTACAAAGAATACCTCGTTCCCTTCTCCAACCAACGTGG。

一种用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物对，包括用于检测分子标记32622的dCAPS引物对和用于检测分子标记63349的引物对。

进一步地，用于检测分子标记32622的dCAPS引物对1，其序列为：

F：5’-CTAATCCACAGCTCATTGTGCA-3’(SEQ ID NO.5)，

R：5’-ACGTCCCGATAACTATAGCTGGAA-3’(SEQ ID NO.6)。

进一步地，用于检测分子标记63349的dCAPS引物对2，其序列为：

F：5’-TGAACCGAGGACACCTAAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)，

R：5’-GTTCCCTTCTCCAACCAACGTGG-3’(SEQ ID NO.8)。

进一步地，dCAPS引物对1的扩增产物用内切酶NIaⅢ酶切，如果酶切产物中仅有368bp片段，判断为高首雌节位，如果仅有390bp片段，判断为低首雌节位，如果同时存在368bp和390bp的片段，判断为低首雌节位。

进一步地，dCAPS引物对2的扩增产物用内切酶MboⅡ酶切，如果酶切产物中仅有207bp片段，判断为高首雄节位，如果仅有230bp片段，判断为低首雄节位，如果同时存在207bp和230bp的片段，判断为首雄节位居中。

上述dCAPS引物对在辅助选择育种中的应用。

一种南瓜选择育种方法，使用上述的dCAPS引物对，以待测南瓜植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物用内切酶NIaⅢ和内切酶MboⅡ酶切，分析酶切结果，判断待测植株的首雌节位和首雄节位。

进一步地，内切酶NIaⅢ酶切产物中，如果仅有368bp片段，判断为高首雌节位，如果仅有390bp片段，判断为低首雌节位，如果同时存在368bp和390bp的片段，判断为低首雌节位。

进一步地，内切酶MboⅡ酶切产物中，如果仅有207bp片段，判断为高首雄节位，如果仅有230bp片段，判断为低首雄节位，如果同时存在207bp和230bp的片段，判断为首雄节位居中。

本发明的有益效果是：

本发明对南瓜首雌节位和首雄节位的数量性状位点进行了QTL定位，并分别筛选得到了与南瓜首雌节位和首雄节位QTL紧密连锁的分子标记，分别定位于中国南瓜9号和4号连锁群上，定位的QTL位点对该数量性状存在显著关联关系(p<0.05)，且贡献率较高，分子标记32622的解释概率为26.5％，分子标记63349的解释概率为21.9％。通过这两个分子标记可以预测南瓜首雌节位和首雄节位的高低，为实现南瓜首雌节位和首雄节位性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。

根据分子标记32622和63349设计的dCAPS引物对可以简便、快速、高通量地应用于南瓜品种改良分子辅助育种，实现南瓜首雌节位和首雄节位性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。经验证为对植株的首雌节位和首雄节位进行预测，准确率分别为77％和83％，准确率较高。

附图说明

图1为首雌节位和首雄节位性状在F2群体中的频率分布；

图2为南瓜首雌节位基因和首雄节位基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示LOD值；红线表示所有的LOD值拟合后的结果；虚线标记的阈值是代表p<0.05的关联阈值，表示关联性显著；

图3为低首雌节位和低首雄节位的母本(P1)及高首雌节位和高首雄节位的父本(P2)；

图4为分子标记32622的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为低首雌节位母本和高首雌节位父本的酶切带型，其中P1不能被酶切，仅有一条390bp片段，P2被酶切，片段长度为368bp；F1部分酶切，存在390bp和368bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型；

图5为分子标记63349的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为低首雄节位母本和高首雄节位父本的酶切带型，其中P1不能被酶切，仅有一条230bp片段，P2酶切完全，片段长度为207bp；F1部分酶切，存在230bp和207bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型。

具体实施方式

下面将结合具体实验进一步阐述本发明。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳、酶切、转化等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

一、遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料植物材料：低首雌、首雄节位材料是从泰国引进分离获得的高代自交系，命名为CMO-E(P1)，而高首雌、首雄节位材料是广东本地获得的高代自交系，命名为CMO-X(P2)。CMO-E和CMO-X杂交获得F1，F1自交得F2，用作遗传分析和定位群体。

2、供试材料雌雄花节位的确定和遗传规律分析

对200株F2群体单株进行首雌节位和首雄节位性状调查，除了中间死亡的少数单株，共有191个单株获得了首雌和首雄节位，其中首雌节位中具有母本表型的单株有139株，具有父本表型的单株有52株；首雄节位中具有母本表型的单株有150株，具有父本表型的单株有43株(见图1)。节位在群体中呈现连续变化，用Excel 2016处理数据，检测是否服从正态分布。

二、南瓜遗传图谱构建和首雌、首雄节位高低的初步定位

1、南瓜基因组DNA的提取

使用CTAB法提取南瓜亲本及200株F2群体基因组DNA，提取的单株DNA用于文库构建；

2、遗传图谱构建

本研究前期委托深圳恒创生物科技有限公司利用ddRAD技术进行高通量测序，一共202个样本，采用EcroI和AlnⅢ进行酶切，末端修复、添加测序接头、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，以保证文库质量。将合格的文库，根据数据量预算，进行IlluminaHiSeq测序。插入片段长度为500bp；测序类型为PE150；去掉用于区分样品的标签序列(4～8bp)，实际Read长度为142～146bp。通过聚类比较检测出RAD-tags上的SNPs集(采用软件为自主研发，聚类不受亲本限制)。

对初始SNP集进行过滤，可得到较为可靠的基因型数据。共开发18314个SNP标记，缺失率小于20％，选取3470个高质量SNP，利用Joinmap软件将LOD值设为6.0构建高密度分子标记遗传图谱，图谱共分为20个连锁群，总图距3087.03cM，平均标记间图距0.89cM，最短连锁群87.30cM，最长274.47cM。

3、首雌节位和首雄节位的初步定位

利用MapQTL5软件采用复合区间作图法(MQM)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算以获得性状相关的QTL，置换检验次数设为1000，QTL判断标准为：p值小于0.05时对应的LOD值作为筛选的阈值，图中以虚线表示。超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，首雌节位虚线的LOD值为4.7，首雄节位虚线的LOD值为4.5，一个group代表一个连锁群，将首雌节位初步定位在9号连锁群，首雄节位初步定位在4号连锁群(图2)，其中SNP标记32622发生T→C的变化，63349发生T→C的变化。

三、dCAPS分子标记开发、扩增、酶切验证

根据分子标记32622和63349的SNPs标记信息，分别设计衍生的酶切多态性扩增序列(dCAPS)引物的错配引物和另一侧的引物，完成从SNPs向dCAPS标记的转化。32622的错配碱基数为1个，63349的错配碱基数为2个。

用于扩增分子标记32622的引物序列如下所示：

F1：5’-CTAATCCACAGCTCATTGTGCA-3’(SEQ ID NO.5)，

R1：5’-ACGTCCCGATAACTATAGCTGGAA-3’(SEQ ID NO.6)，

当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为T时，PCR产物可被限制性核酸内切酶NIaⅢ识别并切割，产生368bp的片段，可以判断与分子标记32622紧密连锁的南瓜首雌节位在为高首雌节位；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为C时，PCR产物不能被限制性核酸内切酶NIaⅢ识别并切割，只有390bp的片段，可以判断南瓜植株为低首雌节位植株；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基一个为T一个为C时，则存在368bp和390bp的片段，南瓜植株为低首雌节位植株。

用于扩增分子标记63349的引物序列如下所示：

F1：5’-TGAACCGAGGACACCTAAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)，

R1：5’-GTTCCCTTCTCCAACCAACGTGG-3’(SEQ ID NO.8)，

当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为T时，PCR产物可被限制性核酸内切酶MboⅡ识别并切割，产生207bp的片段，可以判断与分子标记63349紧密连锁的南瓜首雄节位在果实中为高首雄节位植株；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基均为C时，PCR产物不能被限制性核酸内切酶MboⅡ识别并切割，只有230bp的片段，可以判断为低首雄节位植株；当该SNP位点在两个等位基因中的碱基一个为T一个为C时，则存在207bp和230bp的片段，则首雄节位居中。

实施例1cDAPS引物对可行性验证

以低首雌节位和低首雄节位的母本P1及高首雌节位和高首雄节位的父本P2(图3)，F1、随机选择的30个F2为待检测植株。P1、P2、F1及30个F2群体单株的首雌节位和首雄节位如下表所示：

表1 P1、P2、F1及30个F2群体单株的首雌节位和首雄节位

使用常规方法提取待测植株基因组DNA，使用引物对1和引物对2分别进行PCR扩增，

引物对1的序列为：

F1：5’-CTAATCCACAGCTCATTGTGCA-3’(SEQ ID NO.5)，

R1：5’-ACGTCCCGATAACTATAGCTGGAA-3’(SEQ ID NO.6)，

引物对2的序列为：

F1：5’-TGAACCGAGGACACCTAAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)，

R1：5’-GTTCCCTTCTCCAACCAACGTGG-3’(SEQ ID NO.8)。

PCR扩增体系使用20μL的扩增体系，包含1U Taq酶，1μL模板DNA，1μL的dNTP，1.5μL引物，2μL的10×PCR buffer，加ddH2O至20μL。

PCR扩增程序为：94℃3min，循环过程为94℃30s、退火30s、72℃1min、30个循环，最后72℃延伸10min。引物对1的退火温度为56℃，引物对2的退火温度为59℃。

分别使用内切酶NIaⅢ和内切酶MboⅡ进行酶切，电泳检测酶切结果。

图4为引物对1的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为低首雌节位母本和高首雌节位父本的酶切带型，其中P1不能被酶切，仅有一条390bp片段，P2被酶切，片段长度为368bp；F1部分酶切，存在390bp和368bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型。

图5为引物对2的PCR扩增后酶切结果：P1、P2分别为低首雄节位母本和高首雄节位父本的酶切带型，其中P1不能被酶切，仅有一条230bp片段，P2酶切完全，片段长度为207bp；F1部分酶切，存在230bp和207bp的片段，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型。

结合表1、图4、图5可知，使用本发明中的引物对对植株的首雌节位和首雄节位进行预测，准确率分别为77％和83％，证明本发明中的分子标记和dCAPS引物对用于判断南瓜首雌节位和首雄节位的可行性。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物对及其应用

<130> 2018.5.24

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> 南瓜

<400> 1

ctaatccaca gctcattgtg aatggtgaac ttcgagccct cgaaccagtt ttccagatat 60

atggtcgacg ccaagtcttt tcaggaccag tagtcacact gaaggtattt gaagataacg 120

tcttgattcg tgagttcctt gaggagaagg gtaacggccg agttcttgtc gtggacgggg 180

gcggtagtaa gagatgtgca atattgggtg gcaatcctgt tgtccaagct caaaacaatg 240

gatgggctgg tatagttgtg aatggatgtg ttagagatgt ggatgaaatt aacggatgcg 300

atatcggggt acgggctctc gcttcacatc caatgaaagc ctacaaaaaa cgggtcggag 360

aaaagcacgt cccgataact atagctggaa 390

<210> 2

<211> 390

<212> DNA

<213> 南瓜

<400> 2

ctaatccaca gctcattgtg aacggtgaac ttcgagccct cgaaccagtt ttccagatat 60

atggtcgacg ccaagtcttt tcaggaccag tagtcacact gaaggtattt gaagataacg 120

tcttgattcg tgagttcctt gaggagaagg gtaacggccg agttcttgtc gtggacgggg 180

gcggtagtaa gagatgtgca atattgggtg gcaatcctgt tgtccaagct caaaacaatg 240

gatgggctgg tatagttgtg aatggatgtg ttagagatgt ggatgaaatt aacggatgcg 300

atatcggggt acgggctctc gcttcacatc caatgaaagc ctacaaaaaa cgggtcggag 360

aaaagcacgt cccgataact atagctggaa 390

<210> 3

<211> 230

<212> DNA

<213> 南瓜

<400> 3

tgaaccgagg acacctaagc tcactgctaa tagacattgt ctgttttagt ccgttacgta 60

ttaccatcaa aacagagaat caaaggcacc caagcccact gctagccaat attgttcgtt 120

ttagcctatt acgtatcacc gttaacctca cagttttaaa acacgtctgc tattgagagg 180

tttccacaca cttacaaaga ataccttgtt cccttctcca accaacgtgg 230

<210> 4

<211> 230

<212> DNA

<213> 南瓜

<400> 4

tgaaccgagg acacctaagc tcactgctaa tagacattgt ctgttttagt ccgttacgta 60

ttaccatcaa aacagagaat caaaggcacc caagcccact gctagccaat attgttcgtt 120

ttagcctatt acgtatcacc gttaacctca cagttttaaa acacgtctgc tattgagagg 180

tttccacaca cttacaaaga atacctcgtt cccttctcca accaacgtgg 230

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctaatccaca gctcattgtg ca 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

acgtcccgat aactatagct ggaa 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tgaaccgagg acacctaagc tc 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gttcccttct ccaaccaacg tgg 23

Claims

1.一种用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的分子标记，由分子标记32622和分子标记63349组成；分子标记32622的核苷酸序列自5’端起第23位碱基是SNP位点，第23位碱基为T(SEQ ID NO.1)或C(SEQ ID NO.2)；分子标记63349的核苷酸序列自5’端起第207位碱基是SNP位点，第207位碱基为T(SEQ ID NO.3)或C(SEQ ID NO.4)。

2.一种用于辅助判断南瓜首雌节位和首雄节位的dCAPS引物对，包括用于检测分子标记32622的dCAPS引物对和用于检测分子标记63349的引物对。

3.根据权利要求2所述的dCAPS引物对，其特征在于：用于检测分子标记32622的dCAPS引物对1，其序列为：

F：5’-CTAATCCACAGCTCATTGTGCA-3’(SEQ ID NO.5)，

R：5’-ACGTCCCGATAACTATAGCTGGAA-3’(SEQ ID NO.6)。

4.根据权利要求2或3所述的dCAPS引物对，其特征在于：用于检测分子标记63349的dCAPS引物对2，其序列为：

F：5’-TGAACCGAGGACACCTAAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)，

R：5’-GTTCCCTTCTCCAACCAACGTGG-3’(SEQ ID NO.8)。

5.根据权利要求3所述的dCAPS引物对，其特征在于：dCAPS引物对1的扩增产物用内切酶NIaⅢ酶切，如果酶切产物中仅有368bp片段，判断为高首雌节位，如果仅有390bp片段，判断为低首雌节位，如果同时存在368bp和390bp的片段，判断为低首雌节位。

6.根据权利要求4所述的dCAPS引物对，其特征在于：dCAPS引物对2的扩增产物用内切酶MboⅡ酶切，如果酶切产物中仅有207bp片段，判断为高首雄节位，如果仅有230bp片段，判断为低首雄节位，如果同时存在207bp和230bp的片段，判断为首雄节位居中。

7.根据权利要求2～6任一项所述的dCAPS引物对在辅助选择育种中的应用。

8.一种南瓜选择育种方法，其特征在于：使用权利要求2～6任一项所述的dCAPS引物对，以待测南瓜植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物用内切酶NIaⅢ和内切酶MboⅡ酶切，分析酶切结果，判断待测植株的首雌节位和首雄节位。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：内切酶NIaⅢ酶切产物中，如果仅有368bp片段，判断为高首雌节位，如果仅有390bp片段，判断为低首雌节位，如果同时存在368bp和390bp的片段，判断为低首雌节位。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：内切酶MboⅡ酶切产物中，如果仅有207bp片段，判断为高首雄节位，如果仅有230bp片段，判断为低首雄节位，如果同时存在207bp和230bp的片段，判断为首雄节位居中。