CN109022559A

CN109022559A - 一种基于二代测序技术的分子标记检测方法

Info

Publication number: CN109022559A
Application number: CN201810954551.XA
Authority: CN
Inventors: 叶志彪; 任志勇; 张俊红; 张余洋; 欧阳波; 王涛涛; 李汉霞
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，公开了一种基于二代测序技术的分子标记检测方法,通过扩增子测序的原理，利用设计的多个位点的特异引物及PCR反应体系、分析流程，通过一轮多重PCR一次获取所有单株在多个重要农艺性状相关位点的扩增子，再使用含有不同标签序列的引物，对扩增子再进行一次扩增，将所有单株的扩增子加上互不相同的标签序列，对扩增子进行二代测序，通过对测序结果分析，即可一次获得所有单株的基因型。使用本发明构建的高通量检测体系，可快速、精准的检测目前在育种实践中广泛应用的抗病、品质相关基因。

Description

一种基于二代测序技术的分子标记检测方法

技术领域

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及一种基于二代测序技术的分子标记检测方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

当前应用于育种工作中的分子标记是通过将控制农艺性状相关的基因内的功能性位点或者与其紧密连锁的变异位点转化为AFLP，CAPS，SSR，indel，SCAR等标记产生的。如用于检测Ty-1的双重SNP标记NL2-3(葛乃蓬et al.2014)，用于检测Tm-2a的SCAR标记ToMV(Foolad et al.2012)等。该类技术主要依赖于PCR扩增的特异性、限制性内切酶的特异性，最终通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标条带的有无、大小来区分基因型。以SNP类型的标记为例，若SNP位于限制性内切酶酶切位点内，则可将其转化为CAPS标记，设计一对通用引物，将SNP所在的目标区段扩增出来，使用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，不同基因型的材料因在SNP位点的突变与否，会产生不同的酶切带型，通过琼脂糖凝胶电泳的方式，即可区分出不同的基因型。若该SNP位点不位于酶切位点内，则可通过ASC-PCR的方式转化为分子标记(孙亚林2008)，将PCR引物的3’端末位碱基设计在snp上，结合该引物的扩增特异性，在3’端适当引入1-3个错配碱基，最终使得具有该SNP变异的材料可以扩增出特异带型，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的有无，来判断基因型。

随着功能基因组学的快速发展，以及挖掘基因的手段如QTL-seq，GWAS(林涛2016)的不断丰富，多个控制番茄农艺性状的基因被定位和克隆(Consortium 2012)，如控制水稻谷粒大小的OsPL13(Si et al.2016)，与黄瓜苦味有关的Bi(Shang et al.2014)，与番茄果皮颜色相关的y(Ballester et al.2010)，与果实重量相关的fw3.2(Chakrabarti etal.2013)等，这便为多位点的鉴定提供了可能，然而当前育种领域广泛使用的分子标记技术，难以做到这一点。同时随着当前育种规模的扩大，传统的分子标记技术也难以满足高通量、多位点的基因分型需求。

二代测序技术，主要基于桥式扩增产生cluster，荧光标记四种不同的dNTP，通过边合成边测序的策略产生不同荧光信号，通过对荧光信号的识别，来获取DNA片段的序列信息(Metzker 2010)。经过近十年的发展，其价格逐渐降低，已经成为了一种高通量基因分型的重要工具之一。在基因定位领域，利用resequencing得到的基因型开展GWAS已被广泛的应用于包括医学，农业在内的多个领域的研究(Visscher et al.2012)。

然而，尚未有基于二代测序策略、能够服务于MAS(分子标记辅助选择)的分子标记检测技术出现，主要困难在于未有成熟的可将二代测序与分子标记检测结合的反应体系被建立起来。

综上所述，现有技术存在的问题是：

当前应用于育种实践中的分子标记依赖于变异位点是否是酶切位点(CAPS标记)、是否是插入缺失(indel标记)，是否具有序列特异性(SCAR标记)，微卫星变异(SSR标记)，在变异位点的选择上受限制。

通过琼脂糖或者聚丙烯酰胺凝胶电泳展示条带差异来判断基因型，人工成本高。

通量较低，通常每次PCR只能检测1到10个标记位点。

解决上述技术问题的难度和意义：

解决现有技术的难点在将二代测序与分子标记结合，充分利用二代测序的高通量优势低成本的优势解决上述问题。分子标记检测是分子育种的必备工具，这种高通量的分子标记检测手段，可以解决我国当前分子育种规模不断扩大，人工成本不断上升的问题，为育种家提供更为高效的检测工具。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于二代测序技术的分子标记检测方法。本发明提供了基于二代测序技术，将传统的分子标记涉及的位点，以及近年来新鉴定到的基因和位点进行整合，开发一种利用多重PCR方式获取多位点扩增子、再经一次PCR进行扩增子编码的高通量分子标记检测技术。本发明通过一次二代测序，即可获得所有单株的基因型，具有速度快，通量高，成本低的优势。

本发明是这样实现的，一种基于二代测序技术的分子标记检测方法，包括：

通过扩增子测序的原理，利用多个位点的特异引物及PCR反应体系、分析流程，通过一轮多重PCR一次获取所有单株在多个重要农艺性状相关位点的扩增子，再使用含有不同标签序列的引物，对扩增子再进行一次扩增；

将所有单株的扩增子加上互不相同的标签序列，对扩增子进行二代测序；

通过对测序结果分析，一次获得所有单株的基因型。

进一步，所述基于二代测序技术的分子标记检测方法具体包括：

(1)农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集；

(2)设计多重靶位点特异引物及标签引物，获取及编码多靶位点扩增子；

(3)两轮PCR反应获取扩增子；

(4)上机测序及数据分析。

进一步，步骤(1)农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集，包括:：

1)对于已克隆到的基因，只选取已证实控制所述基因功能的关键性变异位点作为靶位点；

2)对于已克隆但未证实功能性的相关位点的基因及只进行定位而未克隆的基因，仅选取与所述基因功能存在高度连锁关系的位点作为靶位点；

3)对于没有证实的功能性的变异位点的已克隆的基因，同时收集多种已知基因型材料的基因序列。

进一步，所述步骤(2)设计多重靶位点特异引物及标签引物，获取及编码多靶位点扩增子，包括：

根据步骤(1)选取的靶位点和基因序列设计多重PCR引物，将扩增的目的片段长度控制在70-110bp，进行双端二代测序时，每个单向测序反应同时获取片段序列及位于片段末端的标签序列。

进一步，所述标签引物的设计方法包括：

通过随机生成两组六位长度的碱基序列形成标签；

分别在两组标签的3’端加上二代测序使用的测序引物序列read1,read2，在两组标签的5’端加上二代测序使用的锚定引物序列P5,P7。

进一步，步骤(3)两轮PCR反应获取扩增子包括：将所有靶位点引物混合，利用多重PCR试剂对待测样品的DNA进行第一轮的多重PCR，将得到的多重PCR产物进行稀释作为第二轮PCR的模板，用标签引物进行第二轮PCR扩增并记录每个样品的第一轮PCR产物对应的标签，两轮PCR反应后将所有PCR产物混合并纯化，获取所有样品在全部靶位点的、且被加上标签序列的扩增子。

进一步，步骤(4)上机测序及数据分析，包括：

按照标签序列对数据进行分离，即可获取每个样品对应的靶位点序列；

根据每个靶位点两种等位基因型对应的序列的比例高低，判断每个样品在每个位点对应的基因型。

本发明另一目的在于提供的一种利用所述基于二代测序技术的分子标记检测方法的分子标记辅助育种系统。

本发明另一目的在于提供的一种对番茄进行分子标记检测的方法，包括：

(1)对应用于育种的分子标记、克隆到的与重要农艺性状相关的基因，选择其中的31个位点，获取基因全长和具体变异位点前后各100bp的序列；

针对这些变异位点上下游设计特异引物，使扩增的目的片段长度介于70-110bp之间；

将每个位点的引物加上一对二代测序使用的接头序列read1、read2；使用编码引物系统进行扩增后，从测序引物起始位置到标签之间的总长度不超过150bp，再利用Hiseq2500测序仪，PE150试剂盒进行测序时，获取到位于片段末端的标签序列，该套特异引物用于获得这31个位点的扩增子；

随机生成两组由6个碱基随机组成的标签序列，每组内的标签序列互不相同，将测序接头read1和read2序列分别加在两组标签序列的3’端，将二代测序使用的锚定引物序列分别加在标签序列的5’端，最终形成可用于编码不同样品的标签引物；

(3)利用31个位点的特异引物以及多重PCR试剂对待测样品的DNA进行31重PCR，建立稳定的多重PCR反应体系；

将PCR产物稀释100倍，再利用编码引物，以形成的31位点扩增子为模板，再进行一次PCR；

最终得到每个样品都具有31位点的、具有唯一编码的扩增子；将所有样品的扩增子混合，经过纯化，进行二代测序；

(4)对测序结果分析，使用标签序列将每个样品对应的序列分开，再对每个靶位点的两种等位基因对应的序列比例进行分析，得到每个样品对应所有位点的基因型，并对整体分型结果进行分析。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过扩增子测序的原理，利用本发明设计的多个位点的特异引物及PCR反应体系、分析流程，通过一轮多重PCR一次获取所有单株在多个重要农艺性状相关位点的扩增子，再使用含有不同标签序列的引物，对扩增子再进行一次扩增，将所有单株的扩增子加上互不相同的标签序列，对扩增子进行二代测序，通过对测序结果分析，即可一次获得所有单株的基因型。使用本发明构建的高通量检测体系，可快速、精准的检测目前在育种实践中广泛应用的抗病、品质相关基因。

本发明在2565个样本中同时检测了到了31个标记位点的基因型，同时准确率可达到98％以上，这些位点覆盖了当前育种工作中利用的主要抗病和品质基因，并且所有样本的基因型是通过两步PCR反应加上一次二代测序的上机反应、再通过生物信息学分析获取的，文库准备只需一天即可完成，上机测序的时间为三天，基因型分析通过计算机程序完成，耗时一个小时，整个过程相比传统的分子标记每次只能获取单一或者少数几个位点基因型，并且通过电泳、人工读取PCR产物带型的方式，要节约大量的人力和时间，以传统的每次获取一个位点的基因型的分子标记为例，2565个样本、31个位点的基因型需要79515个PCR反应和泳道进行电泳获取，而通过本发明的技术，只需要两轮共计5130个PCR体系，一次二代测序上机反应，同时基因型的获取通过计算机程序自动完成。使用的PCR试剂盒等同于普通高保真酶的价格，获取的扩增子文库仅需要1G的数据量即可满足分析需求，与现有标记检测手段相比，通量更高、成本更低，具体对比见下表。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于二代测序技术的分子标记检测方法流程图。

图2是本发明实施例提供的通过两轮PCR的方式构建扩增子的过程图。

图中：read1，read2为Illumina公司测序引物，P5，P7为Illumina公司的锚定引物，标签为用于编码不同单株的序列。

图3是本发明实施例提供的fw3.2特异引物扩增产物一代测序结果图。

图中：a图为未引入错配时，扩增产物的一代测序结果，b图为引入错配后扩增产物的一代测序结果。

图4是本发明实施例提供的ASC-PCR引物特异性验证的结果，

图中：a图为Cf-4的ASC引物的验证结果，b图为Cf-9的ASC引物的验证结果，c图为I-2的ASC引物的验证结果，d图为Cf-5的ASC引物的验证结果，e图为Mi-1的ASC引物的验证结果。

图5是本发明实施例提供的PCR1反应后抽样检测的结果图。

图6是本发明实施例提供的PCR2反应后抽样检测的结果图。

图7是本发明实施例提供的A、B两个测序文库所有扩增子混合后的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的利用二代测序技术进行分子标记检测的方法

1)农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集

对已克隆的农艺性状相关基因的变异位点和连锁位点信息的提取基于以下三点原则进行：1，对于已克隆到的基因，只选取已证实了控制该基因功能的关键性变异位点作为靶位点。2，对于已克隆但未证实功能性的相关位点的基因及只进行定位而未克隆的基因，仅选取与该基因功能存在高度连锁关系的位点作为靶位点。3，对于没有证实的功能性的变异位点的已克隆的基因，则同时收集多种已知基因型材料的基因序列。

2)设计多重靶位点特异引物及标签引物，获取及编码多靶位点扩增子

根据步骤1选取的靶位点和基因序列设计多重PCR引物，将扩增的目的片段长度控制在70-110bp，可保进行双端二代测序时，每个单向测序反应可同时获取片段序列及位于片段末端的标签序列，并按照如下三个原则设计引物：1，对于已证实的功能性变异位点及连锁位点，同时番茄基因组内其它位置没有高度同源序列的位点，直接设计引物。2，对于已证实的功能性变异位点及连锁位点但在番茄基因组内其它位置存在高度同源序列的位点，设计引物时要考虑位点特异性，以避免使用该引物构建扩增子时获取大量非靶位点的序列，干扰扩增效率及后续基因型的分析。3，对于未证实的功能性变异位点及连锁位点，通过比较不同基因型的基因序列，对变异位点进行候选并设计引物，在多份已知基因型的材料里进行引物特异性的验证，最终确定特异性引物。所有靶位点的正反向引物的5’端分别加上一对测序接头。

标签引物的设计按照如下方法进行：1，通过随机生成两组六位长度的碱基序列形成标签。2，分别在两组标签的5’端加上测序锚定引物序列，在两组标签的5’端加上测序锚定测序接头序列。

3)两轮PCR反应获取扩增子

将所有靶位点引物混合，利用多重PCR试剂对待测样品的DNA进行第一轮的多重PCR，将得到的多重PCR产物进行稀释作为第二轮PCR的模板，用标签引物进行第二轮PCR扩增并记录每个样品的第一轮PCR产物对应的标签，两轮PCR反应后将所有PCR产物混合并纯化，即获取了所有样品在在所有靶位点的扩增子。

4)上机测序及数据分析

将扩增子使用二代测序仪进行双端测序，获取扩增子上的变异位点序列及末端的标签序列，通过以下两步分析获取所有样品的靶位点基因型：1，按照标签序列对数据进行分离，即可获取每个样品对应的靶位点序列，2，根据每个靶位点两种等位基因型对应的序列的比例高低，判断每个样品在每个位点对应的基因型。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的利用二代测序技术进行分子标记检测的方法，具体包括如下步骤：

1.农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集：

收集番茄31个基因的变异位点或连锁位点序列信息，具体如下：

(1)抗病基因：

抗黄化曲叶病毒：Ty-1，Ty-2，ty-5，抗烟草花叶病毒：Tm-1，Tm-2，抗线虫：Mi-1，抗叶霉病：Cf-4，Cf-5，Cf-9，抗枯萎病：I-2抗细菌性斑点病：Pto，抗根腐颈腐病：Frl，抗疮痂病：Rx4。

(2)果色相关基因

果皮颜色：y，绿果肩：u，紫果：gf，高茄红素：hp-1，hp-2，ogc，黄果：r，橙果：tangerine3183。

(3)果重，心室，果形相关基因；

果实大小：fw3.2，fw11.3，心室数：lc，fas，瘦长果：sun梨形果：ovate。

(4)果实糖含量相关基因

糖含量：LIN5，Agpl。

(5)其他

自封顶：sp迟熟：rin。

以上位点的序列来源如下：

(1)已公布的NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或EMBL(http://www.ebi.ac.uk/)序列登录号，如ty-5:GenBankKC447285，Tm-1:GenBankAB287296，Tm-2a:GenBank AF536201，Tm-2:GenBank AF536200，Mi-1:GenBank U81378，Cf-4:GenBankAJ002235，Cf-5:GenBankAF053993，Cf-9:EMBL AJ002236，I-2:GenBankAF118127，Pto:GenBankDQ019170，gf1-5:GenBank FJ647188，Tangerine3183:GenBank AF416727，sun:GenBank EF094940，AgplH：GenBank AF18434。

(2)SGN网站的基因编号(括号内)，如Ty-1(Solyc06g051190)，y(Solyc01g079620)，u(Solyc01g100510)，hp-1(Solyc02g021650)，hp-2(Solyc01g056340)，ogc(Solyc06g074240)，r(Solyc03g031860)，fw3.2(Solyc03g114940)，lc(Solyc02g083950)，fas(Solyc11g071380)，ovate(Solyc02g085500)，LIN5(Solyc09g010080)，sp(Solyc06g074350)，通过现有技术参考文献中的提供的图表及附表展示的变异信息，同时结合SGN网站提供的参考序列获得。

(3)现有的基于PCR分子标记，

如Frl(正向引物:SEQ ID NO：1：CACATTCATCATCTGTTTT标签TCTATTC，反向引物：SEQ ID NO：2：CACAATCGTTGGCCATTGAATGAAGAAC)，

Rx4(正向引物：SEQ ID NO：3：TCCACATCAAATGCGTTTCT，反向引物：SEQ ID NO：4：TTCCAATCCTTTCCATTTCG)，

fw11.3(通用引物：SEQ ID NO：5：GTCACCTTCTTCTCACCGTC，特异引物1：SEQ ID NO：6：CCAGATGTCGTGTTGAAACTG，特异引物2：SEQ ID NO：7：GCGTATCTAAGATTACCTGTC)，

rin(正向引物：SEQ ID NO：8：TTAAGTTGCGAAGAACTTGGTGTTACCTT，反向引物：SEQID NO：9：GCCAAAACACTTCAATTTCCTTTAAAAGTT)，

Ty-2(通用引物：SEQ ID NO：10：AACTCACACCGCTCCGTTGTCA，特异引物1：SEQ IDNO：11：CCTCTTCCGATCTTTGGGTACA，特异引物2：SEQ ID NO：12：TATGTTGGCATGTGACTTA标签G)在对应的突变体材料中扩增，PCR产物送测序的方式获得序列。

通过以上途径，本发明仅选取功能性的变异位点及连锁位点前后各100bp的序列，用于设计靶位点特异引物。

2.设计多重靶位点特异引物及标签引物，获取及编码多靶位点扩增子：

本发明在变异位点上下游各设计一条引物，使扩增长度介于70-110bp之间。

部分变异位点的序列在基因组内有多个同源性较高的拷贝，在设计引物时，选择同源性较低的区域设计，同时在引物末端引入错配，增加引物的特异性。如fw3.2，通过在基因组范围内blast，发现有多个同源性较高的序列，选择特异性较高的位置设计引物，采用CTAB法提取番茄幼叶的DNA，用上述引物进行扩增，PCR反应体系：总体积20μL。10×PCRBuffer 2.0μL，dNTP(10mmol/μL)0.4μL，正反引物各0.4μL，DNA模板(100-200ng/μL)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，用ddH2O补足20μL(引物由上海生工合成，Buffer，dNTP和Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司)；

PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s，进行35个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min；扩增的产物经过一代测序(武汉天一辉远)发现连续的双峰，见图4a。扩增产物里有多个DNA片段，说明引物的特异性较差。

在引物3’端引入错配，按照上述条件扩增，对PCR产物进行一代测序，结果显示只有一个DNA片段，见图4b。

说明该引物具有良好的特异性。运用同样的方法和原则，本发明针对Cf-4，Cf-5，Cf-9，Mi-1，I-2，设计了特异性引物。

采用抗性材料ont7516(Cf-4/Cf-4)，ont7717(Cf-5/Cf-5)，ont7719(Cf-9/Cf-9)，LA2819(Mi-1/Mi-1)，LA3847(I-2/I-2)LA4026(I-2/I-2)，感病材料A53，A57，A101，A112，A114对上述引物进行特异性验证，见图5。

将上述设计的31个位点的特异引物序列(见附表1)与Illumina公司的测序引物read1(SEQ ID NO：13：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)、

read2(SEQ ID NO：14：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)按照图2中的方式融合，形成靶位点特异引物。

附表1

本发明用ATCG四种碱基随机生成了两组由六个碱基构成的标签，每组内的标签碱基序列互不相同，分别为stag1-stag24和ftag1-ftag48见下表(附表2)。

标签引物对应序列表(附表2)

名称

stag1

stag2

stag3

stag4

stag5

stag6

stag7

stag8

stag9

stag10

stag11

stag12

序列

TGCATA

AACACT

AAGCGC

ACAAGG

ACCGAA

ACGTCT

AGACTC

AGGAAC

AGTGGA

ATCTGG

ATTCCC

CAATCT

名称

stag13

stag14

stag15

stag16

stag17

stag18

stag19

stag20

stag21

stag22

stag23

stag24

序列

CACCTT

CATGAG

CCACAC

CCTATA

CGGTTG

CTAGGC

GAAGTA

GCTTAT

GGATGC

GGTACG

GTCAAT

TCAGCA

名称

ftag1

ftag2

ftag3

ftag4

ftag5

ftag6

ftag7

ftag8

ftag9

ftag10

ftag11

ftag12

序列

TATGCG

AACACC

AACCAG

AACGGA

AAGAGG

AAGCCT

AAGGTC

AATCGC

ACAACG

ACCGAT

ACCTCA

ACGCAA

名称

ftag13

ftag14

ftag15

ftag16

ftag17

ftag18

ftag19

ftag20

ftag21

ftag22

ftag23

ftag24

序列

ACGTGT

ACTCTG

AGAAGC

AGCATG

AGCTAC

AGGACA

AGTGAG

ATGTCC

CAACTC

CAAGCA

CAATGG

CACAGT

名称

ftag25

ftag26

ftag27

ftag28

ftag29

ftag30

ftag31

ftag32

ftag33

ftag34

ftag35

ftag36

序列

CAGGAT

CCATAC

CCGTTA

CCTAAG

CCTTCT

CGAGTT

CGTAGA

CGTCAT

CTACCT

CTCACA

CTGAAC

CTTGGT

名称

ftag37

ftag38

ftag39

ftag40

ftag41

ftag42

ftag43

ftag44

ftag45

ftag46

ftag47

ftag48

序列

GAACGT

GACTTC

GAGTCA

GATGAC

GCACTA

GCCATT

GCTTGA

GGAGAA

GGATCT

GTAACC

GTACAG

GTCGTA

将这些标签与Illumina公司的测序引物read1，read2、锚定引物P5(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC)，P7(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT)按图2中的方式融合，分别形成ftag标签、stag标签引物。

3.两轮PCR反应获取扩增子：

第一轮PCR(PCR1)目的在于得到31个位点的扩增子，通过多重PCR的方式进行，具体如下：

将上述设计的31个位点的靶位点特异引物(引物由上海生工合成)制成每条引物浓度为1uM的混合引物工作液。使用CTAB法提取2565份材料的DNA，其中13份为对照材料，DNA浓度稀释至50-70ng/ul。

PCR反应体系：DNA(50-70ng/ul)1.5ul，多重引物1ul，多重反应试剂KAPA2G2.5ul，95℃预变性3min，95℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min。

随机选取两个PCR1产物，凝胶电泳检测：PCR1产物用加有EB(溴化乙锭)的3％琼脂糖在100-120V电压条件下电泳1h，使用20bpDNAladder(TaKaRa)作为标尺最终结果在凝胶成像系统上显示。结果显示有PCR1产物，大小介于120-200bp之间，片段大小符合预期，见图6。

第二轮PCR(PCR2)目的在于将每个样品对应的扩增子加上不同的标签，通过使用上述标签引物进行，具体如下：

用96孔PCR板按照表1所示方式配制12板标签引物(由上海生工合成)，即每48个ftag标签引物搭配一种不同的stag标签引物，将24个stag，48个ftag均稀释成100uM，将半板PCR板的孔从1编到48，向半板PCR板中依次加入ddH2O 58ul，stag标签1ul，ftag标签1ul(依次加入对应编号的孔中)，得到每个孔含有1.66uM两种唯一组合标签的混合标签引物。

表1 Barcode引物配制方式

将PCR1产物稀释100倍，将2565份材料的PCR1产物平均分成两组，分别用于构建A、B两个测序文库，每组中包含13份对照材料，基因型见图7(表1)，用于评估准确率。

PCR反应体系：PCR1产物100倍稀释液1ul，KAPA2G 2.5ul，混合标签引物1.5ul(使用上步中配制的plate1-10的混合标签引物，记录每个样品使用的标签组合。)，95℃预变性3min，95℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行15个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min。

每组随机选取一个PCR2产物，凝胶电泳检测：PCR1产物用加有EB(溴化乙锭)的3％琼脂糖在100-120V电压条件下电泳1h，使用20bpDNAladder(TaKaRa)作为标尺最终结果在凝胶成像系统上显示，结果显示有PCR2产物，且片段大小介于200-300bp之间，符合预期，见图7。

4.上机测序及数据分析：

将上述PCR产物按组混在一起，3％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)回收大小为200-300bp间的目的片段，即获得A、B两个测序文库，见图7。

使用Illumina公司的IlluminaHiseq2500测序仪，PE150试剂盒，对上述构建的两个文库直接上机进行测序(通过本方法构建的文库中所有PCR产物末端均含有测序接头和锚定序列，可直接进行使用PE150试剂盒进行上机测序)，各产生1Gb的原始数据。数据下机后，对每个样品进行基因分型，具体如下：

(1)测序的原始数据分为正向和反向数据集，测序公司没有本发明所使用的标签，因此这两个数据集中包括了同批上机的其他客户未分离的原始数据，本发明根据使用的标签即stag1-stag24与ftag1-ftag48序列从上述两个数据集中分离数据。

(2)对分离数据进行基因分型，本发明按照如下规则判定基因型：当位点的总reads数小于10时，基因型为NA，

A:a>＝10时，基因型为AA，

5<A:a<10时，基因型为NA(未知)，

0.2＝<A:a＝<5时，基因型为Aa，

0.1<A:a<0.2时，基因型为NA，

A:a＝<0.1时，基因型为aa。

对于设计ASC引物的位点，突变型等位基因reads数超过10是视为A，介于10与0之间时视为NA，为0时视为aa，对于多等位基因的位点，如Ty-1，Tm-2a，gf，hp-1，hp-2，将reads数最多的两种等位基因作为A，a，参照上述标准，来判断基因型。

根据以上原则，本发明从各位点的突变序列及参考序列截取突变位点上下游各30bp的序列对(1)中分离的数据集进行比对，进一步对多等位基因的位点及显性位点参照上述标准进行人工校正，最终获取所有单株的基因型，表2展示了部分材料的基因分型结果。

表2部分材料基因分型结果

注：+表示含有含该变异，为显性标记的分型结果，++，+/-，--为共显性标记的结果。

(3)交叉验证评估分型的准确率，如表3，本发明比较对照的基因型与A、B两个库产生的基因型如表4所示，对分型结果的错误率和重复性进行评估，对照在两个库中的分型结果重复性为94.08％，其中，8个分型位点为至少有一次重复为NA，2个位点两次结果矛盾。比较表3与表4的结果，分型的错误率为1.18％，其中，HG2166在Cf-9位点上的两次分型结果矛盾，HG2166A与已知基因型不符，Heinz1706在I-2位点上的两次分型结果矛盾。表3所示的如下13份对照材料:Heinz1706，TS-40，TS-151，HG216，HG2166，TY-2，keepsakeF7，LA0146，LA1740，ont7516，ont7717，ont7719，Grande-PtoR，表中仅列出上述材料已知的基因型，其他位点为未知，用*表示。

(4)测试样品的分型结果统计，见表5，90％的样品检出了27个位点以上的基因型。26个位点在93.78％以上的样品中检出了基因型。

表3 对照材料的基因型

表4 A、B库中13份对照材料的分型结果

表5基因型检出率评估结果

。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的对番茄进行分子标记检测的方法，包括：

(1)对应用于育种的分子标记、克隆到的与重要农艺性状相关的基因，选择其中的31个位点，获取基因全长和具体变异位点上下游的序列；

随机生成两组由6个碱基随机组成的标签序列，每组内的标签序列互不相同，将测序接头read1和read2序列分别加在两组标签序列的3’端，将二代测序使用的锚定引物序列分别加在标签序列的5’端，最终形成一条标签引物系统；

将PCR产物稀释100倍，再利用编码引物系统，以形成的31位点扩增子为模板，再进行一次PCR；

下面结合具体效果对本发明作进一步描述。

本发明在2565个样本中检测了31个标记位点的基因型，同时准确率可达到98％以上，这些位点覆盖了当前育种工作中利用的主要抗病和品质基因，并且所有样本的基因型是通过两步PCR反应加上一次二代测序的上机反应、再通过生物信息学分析获取的，文库准备只需一天即可完成，上机测序的时间为三天，基因型分析通过计算机程序完成，耗时一个小时，整个过程相比传统的分子标记每次只能获取单一或者少数几个位点基因型，并且通过电泳、人工读取PCR产物带型的方式，要节约大量的人力和时间，以传统的每次获取一个位点的基因型的分子标记为例，2565个样本、31个位点的基因型需要79515个PCR反应和79515泳道进行电泳获取，而通过本发明的技术，只需要两轮共计5130个PCR体系，一次二代测序上机反应，同时基因型的获取通过计算机程序自主完成，无需电泳。使用的PCR试剂盒等同于普通高保真酶的价格，获取的扩增子文库仅需要1G的数据量即可满足分析需求，与现有标记检测手段相比，时间更短、成本更低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 本发明的姓名或名称华中农业大学

<120> 发明名称基于二代测序技术的分子标记检测方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacattcatc atctgttttt agtctattc 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacaatcgtt ggccattgaa tgaagaac 28

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccacatcaa atgcgtttct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccaatcct ttccatttcg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcaccttct tctcaccgtc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagatgtcg tgttgaaact g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgtatctaa gattacctgt c 21

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttaagttgcg aagaacttgg tgttacctt 29

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccaaaacac ttcaatttcc tttaaaagtt 30

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aactcacacc gctccgttgt ca 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctcttccga tctttgggta ca 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tatgttggca tgtgacttat agg 23

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

Claims

1.一种基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述基于二代测序技术的分子标记检测方法包括：

基于扩增子测序的原理，利用多个位点的特异引物及PCR反应体系、分析流程，通过一轮多重PCR一次获取所有单株在多个重要农艺性状相关位点的扩增子；

使用含有不同标签序列的引物，对扩增子再进行一次扩增将所有单株的扩增子加上互不相同的标签序列，对扩增子进行二代测序；

通过测序结果，一次获得所有单株的基因型。

2.如权利要求1所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述基于二代测序技术的分子标记检测方法具体包括：

(1)农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集；

(3)两轮PCR反应获取扩增子；

(4)上机测序及数据分析。

3.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，步骤(1)农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集，包括：

4.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述步骤(2)设计多重靶位点特异引物及标签引物，获取及编码多靶位点扩增子，包括：

5.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述标签引物的设计方法包括：

通过随机生成两组六位长度的碱基序列形成标签；

分别在两组标签的3’端加上二代测序使用的测序引物序列，在两组标签的5’端加上二代测序使用的锚定引物序列。

6.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，步骤(3)两轮PCR反应获取扩增子包括：将所有靶位点引物混合，利用多重PCR试剂对待测样品的DNA进行第一轮的多重PCR，将得到的多重PCR产物进行稀释作为第二轮PCR的模板，用标签引物进行第二轮PCR扩增并记录每个样品的第一轮PCR产物对应的标签，两轮PCR反应后将所有PCR产物混合并纯化，获取所有样品在在所有靶位点的扩增子。

7.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，步骤(4)上机测序及数据分析，包括：

8.一种利用权利要求1所述基于二代测序技术的分子标记检测方法的分子标记辅助育种系统。

9.一种利用权利要求1所述基于二代测序技术的分子标记检测方法的对番茄进行分子标记检测的方法，其特征在于，所述对番茄进行分子标记检测的方法包括：

将PCR产物稀释100倍，再利用标签引物，以形成的31位点扩增子为模板，再进行一次PCR；

最终得到每个样品都具有31位点的、具有唯一标签的扩增子；将所有样品的扩增子混合，经过纯化，进行二代测序；