CN111549107A

CN111549107A - 一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN111549107A
Application number: CN202010523088.0A
Authority: CN
Inventors: 李林; 李娟�; 李明珠; 王席
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN111549107B

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用。本发明构建了一套类似试剂盒的通用barcode片段，使得以更低的成本，更快的速度进行基因型鉴定。本发明将barocde与二代测序相结合开发的新型鉴定基因型技术对于SNP和InDel的鉴定是十分高效且简单的，同时所需成本远远低于市面价格，尤其是对大批量样品的鉴定此优点更加突出。另外这种技术也可以应用于基因定位以及绘制遗传图谱等，因此它的应用范围也十分广泛。

Description

一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用。

背景技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术一般由样品准备、文库构建、测序反应和数据分析四部分组成，这就使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。利用高通量测序技术进行SNP分型的方法有：GBS(Genotyping-by-sequencing,通过简化基因组基于二代测序进行基因分型技术)(Elshire et al.2011)、AmpSeq(amplicon sequencing，通过扩增子测序的低成本基因分型技术)(Yang et al.2016)、HD-Marker(基于高通量测序的GoldenGate方法)(Lv etal.2018)等。传统的利用测序技术进行基因分型的方法通常会遭受数据丢失率高和错误率高的困扰，特别是在低读取深度下来自杂合基因座和稀有等位基因的检测会产生较高的错误率，且成本高昂。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本发明的直接目的是非诊断目的地进行基因分型，且仅依据本发明中的检测方法的检测结果无法得出疾病的诊断结果。

本发明是这样实现的，一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建通用Barcode片段，包括前引物和后引物，所述前引物中包括bridge片段及Barcode1片段，所述后引物中包括Barcode2片段及reverse primer片段；以黄色荧光蛋白YFP片段DNA为模板，利用所述前引物和后引物进行PCR扩增YFP DNA，得到Barcode片段；

针对待测SNP位点设计一对普通引物，其中前引物距离SNP位点在150bp内或者后引物距离SNP位点在36bp内，且后引物需要在其5’端加上bridge片段；以样品DNA为模板，利用设计的引物进行SNP片段扩增；

将各样品对应的上述扩增的Barcode片段和SNP片段做混合模板，进行overlapping PCR扩增，获得用于测序的完整片段；所用正向引物为SNP位点的前引物，所用反向引物为reverse片段的反向互补序列；

将获得的待测序片段混合后进行纯化；

纯化后的产品建库并进行二代测序；

数据分析，得出基因分型结果。

针对384个待测样本设计24种包含不同Barcode1序列的前引物以及16种包含不同Barcode2序列的后引物；涉及的前引物序列见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示；涉及的16种后引物序列见SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对。

进一步地，进行SNP片段扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点的基因型，则引物F和R分别加入0.8ul；检测2个SNP位点的基因型，则引物F和R分别混合后各加入1ul；检测5个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入2ul；检测20个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入3ul。

进一步地，进行overlapping PCR扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点，则引物F加入0.8μl；2个SNP位点则引物F_mix加入1.2μl；5个SNP位点则引物F_mix加入1.5μl；20个SNP位点则引物F_mix加入2μl；反向引物EndR所加量均为0.8μl。

进一步地，所述纯化包括磁珠纯化。

如上述的一种利用高通量测序进行基因分型的方法在基因分型、基因定位或绘制遗传图谱中的应用。

一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，包括通用Barcode片段，具体包括前引物和后引物，所述前引物中包括bridge片段及Barcode1片段，所述后引物中包括Barcode2片段及reverse片段；2X Phanta Master Mix，2X Taq Plus Master Mix。

进一步地，所述前引物见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示，所述后引物序列见SEQID NO.25-SEQ ID NO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对，所述试剂盒可组成384个不同的引物对。

进一步地，所述试剂盒的检测方法如权利要求1-5任一所述。

如上述的一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒在基因分型、基因定位或绘制遗传图谱中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用分子条码(Barcode)以及二代测序开发了一种新的高通量标记技术，可以快速高效低成本地对SNP基因型进行鉴定。

本技术构建的一套类似试剂盒的通用barcode片段，使得以更低的成本，更快的速度进行基因型鉴定。本发明将barocde与二代测序相结合开发的新型鉴定基因型技术对于SNP和InDel的鉴定是十分高效且简单的，同时所需成本远远低于市面价格，尤其是对大批量样品的鉴定此优点更加突出。另外这种技术也可以应用于基因定位以及绘制遗传图谱等，因此它的应用范围也十分广泛。

附图说明

图1是本发明的方法原理图；

图2是20个位点扩增的PCR检测；

图3是不同测序深度下位点密度图；

图4是不同测序深度下SNP位点准确率箱线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用，具体过程如下实施例所示。

实施例

1、构建试剂盒通用Barcode片段、扩增YFP DNA

(1)Barcode片段在进行数据分析时用来识别不同样品，即相当于样品的识别标签。具体是由18bp的bridge片段，8bp的Barcode1片段，60bp的YFP上的一段序列，8bp的Barcode2片段，20bp的reverse片段组成。

以384个待测样品DNA为例，只需要24种不同的Barcode1序列以及16种不同的Barcode2序列就可以组成384种通用Barcode片段用于384个样品基因型的鉴定。

本实施例中设计的扩增通用Barcode片段序列如下表所示，其中，前引物从5’端开始的前18bp为bridge片段，中间8bp为Barcode1片段，后20bp为YFP上的一段序列；后引物5’端开始前20bp为reverse片段，中间8bp为Barcode2片段，后20bp为YFP上的一段序列。

表1所用前引物

表2所用后引物

(2)24种前引物和16种后引物共可组成384种不同的引物组合，以黄色荧光蛋白的DNA片段为模板，用这些不同的引物组合对YFP DNA进行扩增，就可得到384种不同的Barcode片段。

PCR反应体系如下：

PCR反应体系参数如下：

本实施例中选用黄早四和1462构建的BC₁F₂群体来检测20个SNP位点基因型(所用引物对从上表中随机选择前、后引物，组成不同的引物对)鉴定的准确率。利用CTAB法进行植物叶片DNA的提取，具体方法如下：

1)取适量叶片装入写好编号的离心管中，液氮冷冻条件下利用磨样机进行研磨。

2)迅速加入750ul的β-巯基乙醇：CTAB(1:10000)提取液，快速震荡混匀。

3)65℃水浴40min，水浴过程中每隔10min轻轻摇晃几次。

4)取出离心管，加入750ul氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻摇匀片刻。

5)室温下8000r/min离心10min，取出约300ul上清液转移至新的1.5ml离心管。

6)加500ul预冷的无水乙醇(-20℃)，轻摇混匀后静置片刻。

7)室温下12000r/min离心2min，弃上清。

8)加75％酒精500ul浸泡10min，室温下12000r/min离心1min，弃上清。

9)风干后加入100ul ddH₂O充分溶解DNA。

2、样品SNP片段的扩增

在SNP位点前后设计一对普通引物，前引物距离SNP位点要在150bp内或者后引物距离SNP位点要在36bp内，其中后引物需要在其5’端加上18bp的bridge片段，这才是完整的后引物序列。用设计好的引物对每个样品进行扩增，得到SNP片段。

本实施例中针对待检测的20个SNP位点设计的引物序列及20个SNP位点的信息如下表所示：

表3 20个位点信息表

表4 20个位点所用引物

把表3中左列10个SNP位点的前引物和后引物分开混合，右列10个SNP位点的前引物和后引物分开混合，分别对384个样品中的20个SNP位点进行SNP片段扩增，PCR条件如下：

PCR反应体系如下：

如果检测1个SNP位点的基因型，引物F和R分别加入0.8ul；检测2个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入1ul；检测5个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入2ul；检测20个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入3ul。引物使用量无固定计算方式，不同体系中，具体使用量可根据体系进行调整。

PCR反应程序如下：

3、第2步与第1步扩增出的产物一一对应，即每个样品SNP片段对应一种Barcode片段，384个样品对应384个Barcode片段。

将第1步与第2步扩增出来的PCR产物对应，分别取少量产物作为模板，以SNP位点的前引物作为正向引物，reverse片段的反向互补序列(EndR引物序列：5’-3’AAACGCCAGCAATAATTACG)作为后引物，通过overlapping PCR形成完整的用于测序的片段。

PCR反应体系如下：

如果是1个SNP位点，引物F加入0.8ul；2个SNP位点则引物F_mix加入1.2ul；5个SNP位点则引物F_mix加入1.5ul；20个SNP位点则引物F_mix加入2ul。

PCR反应体系参数如下：

PCR产物用4％的琼脂糖凝胶检测。结果如图2所示，其中A:左列10个位点SNP片段扩增；B:右列10个位点SNP片段扩增；C:左列10个位点overlap；D:右列10个位点overlap。

4、磁珠纯化。

把上一步扩增后的产物混匀后用磁珠进行纯化，具体步骤如下：

(1)提取半个小时把磁珠(KAPA Pure Beads)拿出来放在常温下备用。

(2)取100ul的PCR产物混合液放入PCR管中，向其中加入90ul的磁珠(加入前磁珠要震荡混匀)，震荡混匀，室温下放在PCR板上静止10min。

(3)把PCR管放在磁珠磁力架上，静置大约5min致溶液澄清，保持PCR管静置在磁力架上用移液器把溶液吸出丢弃。

(4)向PCR管加入80％的酒精200ul，静置5min，保持PCR管静置在磁力架上用移液器把溶液吸出丢弃。

(5)重复一次。

(6)保持PCR管静置在磁力架上，管盖打开，吹开，不得超过5min。

(7)把PCR管从磁力架上取出，放在PCR板上，向其中加入21ulddH₂O，吹打混匀，静置10min。

(8)把PCR管放在磁力架上静置5min致溶液澄清，用移液器把液体吸入到新的1.5ml离心管中，丢弃PCR管。离心管中的液体即为纯化产物。

(9)测浓度。

5、送到送到安诺建库和二代测序(Illumina Novaseq 6000测序仪)，测序深度30G。

6、数据分析。

(1)运行Python脚本把每种Barcode组合区分开，即把每一种DNA样品区分，一种Barcode组合汇集成一对fq文件(比如第一种Barcode组合输出结果为1_1.fq和1_2.fq)。

(2)利用bwa软件把生成的fq文件与参考基因组进行比对，最后一种Barcode组合生成一种sam文件(比如第一种Barcode组合1_1.fq和1_2.fq文件会产生1.sam)。

(3)利用samtools软件把sam文件转成bam文件。

(4)同样利用samtools软件把bam文件进行排序。

(5)对sorted.bam文件建索引。

(6)利用Java与IGVTools统计不同单株在SNP位点处四种碱基的比例，输出为结果文件为total_result.txt。

(7)利用grep命令，把每个SNP位点不同单株的碱基结果从total_result.txt文件中分别输出，再利用awk以及sed命令对其进行处理，最后一个SNP位点产生一个csv文件，里面包含不同单株的四种碱基结果。

(8)利用R，对上面产生的csv文件进行绘图，结果生成每个SNP位点的单独密度图；

(9)根据每个密度图确定基因型区分条件(峰的最低处为区分标准)。

(10)根据上面确定的区分值，运行Python脚本得到每个位点不同单株的基因型信息。

本发明中也可以采用本领域其他常规数据分析方法对数据进行分析，或直接送至第三方生物公司对数据处理，只要能够得到每个位点不同单株的基因型信息即可。

对返回的数据随机抽取，进行了5种不同的测序深度分析，分别为0.5G、1.25G、2.5G、3.75G、7.5G。分析得到每种数据量下各个SNP位点的碱基百分比，并根据野生型碱基百分比结果绘制密度图，见图3所示(其中，A:0.5G数据量；B:1.25G数据量；C:2.5G数据量；D:3.75G数据量；E:7.5G数据量)，对基因型进行判断。把基因型鉴定结果与已知结果作比较，发现在随机抽取的这五种数据量下：0.5G、1.25G、2.5G、3.75G、7.5G，20个位点里都有7个位点(从上到下位点分别是P14，P25，P72，SNP18，SNP24，SNP4，SNP9)存在3个明显的主峰并且准确率远超90％，如下表所示：

表5不同测序深度下SNP位点准确率表

根据上表数据绘制不同数据量下SNP位点准确率箱线图，见图4。由图可知在测序深度为3.75G时，准确率已经达到饱和状态，有7个SNP基因型鉴定准确率95％以上(分别是P14，P25，P72，SNP18，SNP24，SNP4，SNP9)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F1)

<400> 1

gttgaaacgc gtcgctatat cacgttcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F2)

<400> 2

gttgaaacgc gtcgctatcg atgtttcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F3)

<400> 3

gttgaaacgc gtcgctattt aggcatcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F4)

<400> 4

gttgaaacgc gtcgctattg accactcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F5)

<400> 5

gttgaaacgc gtcgctatac agtggtcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F6)

<400> 6

gttgaaacgc gtcgctatgc caatgtcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F7)

<400> 7

gttgaaacgc gtcgctatca gatctgcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F8)

<400> 8

gttgaaacgc gtcgctatac ttgatgcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F9)

<400> 9

gttgaaacgc gtcgctatga tcagcgcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F10)

<400> 10

gttgaaacgc gtcgctatta gcttgtcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F11)

<400> 11

gttgaaacgc gtcgctatgg ctacagcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F12)

<400> 12

gttgaaacgc gtcgctatct tgtactcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F13)

<400> 13

gttgaaacgc gtcgctattg gttgttcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F14)

<400> 14

gttgaaacgc gtcgctattc tcggttcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F15)

<400> 15

gttgaaacgc gtcgctatta agcgttcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F16)

<400> 16

gttgaaacgc gtcgctattc cgtcttcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F17)

<400> 17

gttgaaacgc gtcgctattt ggaggtcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F18)

<400> 18

gttgaaacgc gtcgctattc gagcgtcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F19)

<400> 19

gttgaaacgc gtcgctattg atacgtcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F20)

<400> 20

gttgaaacgc gtcgctattg catagtcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F21)

<400> 21

gttgaaacgc gtcgctattt gactctcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F22)

<400> 22

gttgaaacgc gtcgctattg cgatctcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F23)

<400> 23

gttgaaacgc gtcgctattt cctgctcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(F24)

<400> 24

gttgaaacgc gtcgctatta gtgactcaag cagaagaacg gcatca 46

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R1)

<400> 25

aaacgccagc aataattacg taagttcgct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R2)

<400> 26

aaacgccagc aataattacg tccagtcgct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R3)

<400> 27

aaacgccagc aataattacg tgtatgcgct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 28

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R4)

<400> 28

aaacgccagc aataattacg tcattgagct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 29

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R5)

<400> 29

aaacgccagc aataattacg tggctcagct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R6)

<400> 30

aaacgccagc aataattacg tatgccagct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R7)

<400> 31

aaacgccagc aataattacg tcagattcct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 32

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R8)

<400> 32

aaacgccagc aataattacg tagtcttgct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 33

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R9)

<400> 33

aaacgccagc aataattacg ttcagctcct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 34

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R10)

<400> 34

aaacgccagc aataattacg tgtctatcct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 35

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R11)

<400> 35

aaacgccagc aataattacg tatgtggcct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 36

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R12)

<400> 36

aaacgccagc aataattacg ttactcgcct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 37

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R13)

<400> 37

aaacgccagc aataattacg tcgttagcct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 38

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R14)

<400> 38

aaacgccagc aataattacg ttgcgtacct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R15)

<400> 39

aaacgccagc aataattacg tctacgacct gccgtcctcg atgttgtg 48

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(R16)

<400> 40

aaacgccagc aataattacg tgacagacct gccgtcctcg atgttgtg 48

Claims

1.一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将各样品对应的上述扩增的Barcode片段和SNP片段做混合模板，进行overlappingPCR扩增，获得用于测序的完整片段；所用正向引物为SNP位点的前引物，所用反向引物为reverse片段的反向互补序列；

将获得的待测序片段混合后进行纯化；

纯化后的产品建库并进行二代测序；

数据分析，得出基因分型结果。

2.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：针对384个待测样本设计24种包含不同Barcode1序列的前引物以及16种包含不同Barcode2序列的后引物；涉及的前引物序列见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示；涉及的16种后引物序列见SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对。

3.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：进行SNP片段扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点的基因型，则引物F和R分别加入0.8ul；检测2个SNP位点的基因型，则引物F和R分别混合后各加入1ul；检测5个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入2ul；检测20个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入3ul。

4.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：进行overlapping PCR扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点，则引物F加入0.8μl；2个SNP位点则引物F_mix加入1.2μl；5个SNP位点则引物F_mix加入1.5μl；20个SNP位点则引物F_mix加入2μl；反向引物EndR所加量均为0.8μl。

5.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：所述纯化包括磁珠纯化。

6.一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，其特征在于：包括通用Barcode片段，具体包括前引物和后引物，所述前引物中包括bridge片段及Barcode1片段，所述后引物中包括Barcode2片段及reverse片段；2X Phanta Master Mix，2X Taq Plus Master Mix。

7.根据权利要求6所述的一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，其特征在于：所述前引物见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示，所述后引物序列见SEQ ID NO.25-SEQ IDNO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对，所述试剂盒可组成384个不同的引物对。

8.根据权利要求7所述的一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测方法如权利要求1-5任一所述。

9.如权利要求1-5任一所述的一种利用高通量测序进行基因分型的方法在基因分型、基因定位或绘制遗传图谱中的应用。

10.如权利要求6或7所述的一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒在基因分型、基因定位或绘制遗传图谱中的应用。