CN108179174A - 一种高通量简化基因组测序文库的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括如下步骤：将基因组DNA样本用限制性内切酶分别对不同的基因组DNA样本进行酶切，能够获得多组不同类型基因组DNA样本的DNA片段，并将不同的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连接，从而获取不同类型的连接产物，将连接产物添加扩增引物，进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，将扩增片段再次置于琼脂糖凝胶中，然后经琼脂糖凝胶电泳后回收DNA片段作为测序文库，采用芯片分析系统进行最终的质量检测和测序。该方法有效解决了远交群体物种高通量基因分型个体间片段变异大、测序深度低以及基因分型准确性低的问题。

Description

一种高通量简化基因组测序文库的构建方法
技术领域
本发明涉及基因组测序技术领域，尤其涉及一种高通量简化基因组测序文库的构建方法。
背景技术
随着二代测序技术，特别是Illumina测序平台的发展和不断升级，群体遗传学研究发生了革命性的变化，利用二代测序可以获得数十万甚至是数百万的SNPs信息，越来越多重要经济动物和经济作物定位到与重要经济性状紧密关联的候选区域。当前，可用于群体遗传学研究的二代测序文库构建方法主要有全基因重测序(WGR，Whole genomeresequencing)、RAD-Seq(Restriction-site-association DNA sequencing)、GBS(Genotyping-by-Sequencing)等，然而，这些方法各自存在着不同的问题，例如，WGR需要有较高质量的参考基因组序列且建库成本高；RAD-seq虽然可用于没有参考基因组的物种，但基因组DNA用量大、流程复杂且测序质量差，有将近一半的原始数据会因为测序错误而被丢弃；GBS虽然步骤相对简单，但只能收集短的酶切片段且酶切片段偏少。随着现在生物科技的不断进步，对其的要求也越来越严格，为此，我们提出了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法。
发明内容
本发明提出了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括如下步骤：
S1：选择不同类型的基因组DNA样本，并将基因组DNA样本在10-20摄氏度的无菌环境中进行保存，并用限制性内切酶分别对不同的基因组DNA样本进行酶切，且在酶切时，需将不同样本分时段进行酶切，从而能避免不同样本发生接触，影响基因组DNA样本的原始形态；
S2：完成酶切后，能够获得多组不同类型基因组DNA样本的DNA片段，并将不同的DNA片段分别进行储存，且储存环境为2-8摄氏度，并向DNA片段内添加lamda噬菌体基因组DNA，能够将DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存12-24h，然后备用；
S3：将S2中储存后的不同类型的DNA片段取出，并在放置在15-25摄氏度的反应器皿内，并将不同的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连接，从而获取不同类型的连接产物，然后将连接产物置于纯化仪器内，并在5-15摄氏度的条件下利用水解酶对连接产物进行纯化20-40min；
S4：将S3中纯化后的连接产物添加扩增引物，进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，然后确定每组扩增产物的量，进行琼脂糖凝胶分离后，再次进行纯化，获得特定长度的扩增片段；
S5：将S4中扩增后的扩增片段再次置于琼脂糖凝胶中，然后经琼脂糖凝胶电泳后回收DNA片段作为测序文库，采用芯片分析系统进行最终的质量检测和测序。
优选的，所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’ACACTCTTTCTCTACACGAGGCTCTTCGGATAT5’，
负链：3’ACATCCGGAGAGCGGTCCAGCAGGAATGCCGAG5’。
优选的，所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’AGACTCTGTCTCTACACGAGGCTCTATGGATAT5’，
负链：3’AGATACGAAGAGCGGTCCAGCAGGAATGGCGAG5’。
优选的，在S5中的测序文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的200-300bp的DNA片段。
优选的，在上述中，需实时检测DNA片段的酸碱度，从而确定DNA片段的pH范围。
优选的，在S4中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CAACCAGGAGATGGCATATG,
引物序列P2：AATGATATGCCGACGATCGA。
本发明提出的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，有益效果在于：该高通量简化基因组测序文库的构建方法的测序文库通量高、成本低，且操作简单、灵活，检测通量高、检测成本低，产生的文库测序质量高，该方法有效解决了远交群体物种高通量基因分型个体间片段变异大、测序深度低以及基因分型准确性低的问题，在实现高通量SNP检测及标记开发、遗传图谱绘制、功能基因定位等研究中具有非常广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括如下步骤：
S1：选择不同类型的基因组DNA样本，并将基因组DNA样本在10摄氏度的无菌环境中进行保存，并用限制性内切酶分别对不同的基因组DNA样本进行酶切，且在酶切时，需将不同样本分时段进行酶切，从而能避免不同样本发生接触，影响基因组DNA样本的原始形态；
S2：完成酶切后，能够获得多组不同类型基因组DNA样本的DNA片段，并将不同的DNA片段分别进行储存，且储存环境为2摄氏度，并向DNA片段内添加lamda噬菌体基因组DNA，能够将DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存12h，然后备用；
S3：将S2中储存后的不同类型的DNA片段取出，并在放置在15摄氏度的反应器皿内，并将不同的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连接，从而获取不同类型的连接产物，然后将连接产物置于纯化仪器内，并在5摄氏度的条件下利用水解酶对连接产物进行纯化20min；
S4：将S3中纯化后的连接产物添加扩增引物，进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，然后确定每组扩增产物的量，进行琼脂糖凝胶分离后，再次进行纯化，获得特定长度的扩增片段；
S5：将S4中扩增后的扩增片段再次置于琼脂糖凝胶中，然后经琼脂糖凝胶电泳后回收DNA片段作为测序文库，采用芯片分析系统进行最终的质量检测和测序。
所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’ACACTCTTTCTCTACACGAGGCTCTTCGGATAT5’，
负链：3’ACATCCGGAGAGCGGTCCAGCAGGAATGCCGAG5’。
在S5中的测序文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的200bp的DNA片段。
在上述中，需实时检测DNA片段的酸碱度，从而确定DNA片段的pH范围。
在S4中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CAACCAGGAGATGGCATATG,
引物序列P2：AATGATATGCCGACGATCGA。
实施例2
本发明提出了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括如下步骤：
S1：选择不同类型的基因组DNA样本，并将基因组DNA样本在13摄氏度的无菌环境中进行保存，并用限制性内切酶分别对不同的基因组DNA样本进行酶切，且在酶切时，需将不同样本分时段进行酶切，从而能避免不同样本发生接触，影响基因组DNA样本的原始形态；
S2：完成酶切后，能够获得多组不同类型基因组DNA样本的DNA片段，并将不同的DNA片段分别进行储存，且储存环境为4摄氏度，并向DNA片段内添加lamda噬菌体基因组DNA，能够将DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存16h，然后备用；
S3：将S2中储存后的不同类型的DNA片段取出，并在放置在18摄氏度的反应器皿内，并将不同的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连接，从而获取不同类型的连接产物，然后将连接产物置于纯化仪器内，并8摄氏度的条件下利用水解酶对连接产物进行纯化25min；
S4：将S3中纯化后的连接产物添加扩增引物，进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，然后确定每组扩增产物的量，进行琼脂糖凝胶分离后，再次进行纯化，获得特定长度的扩增片段；
S5：将S4中扩增后的扩增片段再次置于琼脂糖凝胶中，然后经琼脂糖凝胶电泳后回收DNA片段作为测序文库，采用芯片分析系统进行最终的质量检测和测序。
所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’AGACTCTGTCTCTACACGAGGCTCTATGGATAT5’，
负链：3’AGATACGAAGAGCGGTCCAGCAGGAATGGCGAG5’。
在S5中的测序文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的230bp的DNA片段。
在上述中，需实时检测DNA片段的酸碱度，从而确定DNA片段的pH范围。
在S4中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CAACCAGGAGATGGCATATG,
引物序列P2：AATGATATGCCGACGATCGA。
实施例3
本发明提出了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括如下步骤：
S1：选择不同类型的基因组DNA样本，并将基因组DNA样本在17摄氏度的无菌环境中进行保存，并用限制性内切酶分别对不同的基因组DNA样本进行酶切，且在酶切时，需将不同样本分时段进行酶切，从而能避免不同样本发生接触，影响基因组DNA样本的原始形态；
S2：完成酶切后，能够获得多组不同类型基因组DNA样本的DNA片段，并将不同的DNA片段分别进行储存，且储存环境为6摄氏度，并向DNA片段内添加lamda噬菌体基因组DNA，能够将DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存20h，然后备用；
S3：将S2中储存后的不同类型的DNA片段取出，并在放置在22摄氏度的反应器皿内，并将不同的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连接，从而获取不同类型的连接产物，然后将连接产物置于纯化仪器内，并在12摄氏度的条件下利用水解酶对连接产物进行纯化32min；
S4：将S3中纯化后的连接产物添加扩增引物，进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，然后确定每组扩增产物的量，进行琼脂糖凝胶分离后，再次进行纯化，获得特定长度的扩增片段；
S5：将S4中扩增后的扩增片段再次置于琼脂糖凝胶中，然后经琼脂糖凝胶电泳后回收DNA片段作为测序文库，采用芯片分析系统进行最终的质量检测和测序。
所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’ACACTCTTTCTCTACACGAGGCTCTTCGGATAT5’，
负链：3’ACATCCGGAGAGCGGTCCAGCAGGAATGCCGAG5’。
在S5中的测序文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的270bp的DNA片段。
在上述中，需实时检测DNA片段的酸碱度，从而确定DNA片段的pH范围。
在S4中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CAACCAGGAGATGGCATATG,
引物序列P2：AATGATATGCCGACGATCGA。
实施例4
本发明提出了一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，包括如下步骤：
S1：选择不同类型的基因组DNA样本，并将基因组DNA样本在20摄氏度的无菌环境中进行保存，并用限制性内切酶分别对不同的基因组DNA样本进行酶切，且在酶切时，需将不同样本分时段进行酶切，从而能避免不同样本发生接触，影响基因组DNA样本的原始形态；
S2：完成酶切后，能够获得多组不同类型基因组DNA样本的DNA片段，并将不同的DNA片段分别进行储存，且储存环境为8摄氏度，并向DNA片段内添加lamda噬菌体基因组DNA，能够将DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存24h，然后备用；
S3：将S2中储存后的不同类型的DNA片段取出，并在放置在25摄氏度的反应器皿内，并将不同的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连接，从而获取不同类型的连接产物，然后将连接产物置于纯化仪器内，并在15摄氏度的条件下利用水解酶对连接产物进行纯化40min；
S4：将S3中纯化后的连接产物添加扩增引物，进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，然后确定每组扩增产物的量，进行琼脂糖凝胶分离后，再次进行纯化，获得特定长度的扩增片段；
S5：将S4中扩增后的扩增片段再次置于琼脂糖凝胶中，然后经琼脂糖凝胶电泳后回收DNA片段作为测序文库，采用芯片分析系统进行最终的质量检测和测序。
所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’AGACTCTGTCTCTACACGAGGCTCTATGGATAT5’，
负链：3’AGATACGAAGAGCGGTCCAGCAGGAATGGCGAG5’。
在S5中的测序文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的300bp的DNA片段。
在上述中，需实时检测DNA片段的酸碱度，从而确定DNA片段的pH范围。
在S4中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CAACCAGGAGATGGCATATG,
引物序列P2：AATGATATGCCGACGATCGA。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：选择不同类型的基因组DNA样本，并将基因组DNA样本在10-20摄氏度的无菌环境中进行保存，并用限制性内切酶分别对不同的基因组DNA样本进行酶切，且在酶切时，需将不同样本分时段进行酶切，从而能避免不同样本发生接触，影响基因组DNA样本的原始形态；
S2：完成酶切后，能够获得多组不同类型基因组DNA样本的DNA片段，并将不同的DNA片段分别进行储存，且储存环境为2-8摄氏度，并向DNA片段内添加lamda噬菌体基因组DNA，能够将DNA片段末端进行修复，然后再次向其中添加碱基，并将其储存12-24h，然后备用；
S3：将S2中储存后的不同类型的DNA片段取出，并在放置在15-25摄氏度的反应器皿内，并将不同的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连接，从而获取不同类型的连接产物，然后将连接产物置于纯化仪器内，并在5-15摄氏度的条件下利用水解酶对连接产物进行纯化20-40min；
S4：将S3中纯化后的连接产物添加扩增引物，进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，然后确定每组扩增产物的量，进行琼脂糖凝胶分离后，再次进行纯化，获得特定长度的扩增片段；
S5：将S4中扩增后的扩增片段再次置于琼脂糖凝胶中，然后经琼脂糖凝胶电泳后回收DNA片段作为测序文库，采用芯片分析系统进行最终的质量检测和测序。
2.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于：所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’ACACTCTTTCTCTACACGAGGCTCTTCGGATAT5’，
负链：3’ACATCCGGAGAGCGGTCCAGCAGGAATGCCGAG5’。
3.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于：所述的甲基化接头包括正链和负链，具体为：
正链：3’AGACTCTGTCTCTACACGAGGCTCTATGGATAT5’，
负链：3’AGATACGAAGAGCGGTCCAGCAGGAATGGCGAG5’。
4.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于：在S5中的测序文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的200-300bp的DNA片段。
5.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于：在上述中，需实时检测DNA片段的酸碱度，从而确定DNA片段的pH范围。
6.根据权利要求1所述的一种高通量简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于：在S4中的扩增引物序列为：
引物序列P1：CAACCAGGAGATGGCATATG,
引物序列P2：AATGATATGCCGACGATCGA。
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