CN105567843B - 用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用 - Google Patents
用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105567843B CN105567843B CN201610081432.9A CN201610081432A CN105567843B CN 105567843 B CN105567843 B CN 105567843B CN 201610081432 A CN201610081432 A CN 201610081432A CN 105567843 B CN105567843 B CN 105567843B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- sequence
- carried out
- prey
- rice field
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 14
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 14
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 23
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 10
- 108010062427 GDP-mannose 4,6-dehydratase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002312 GDPmannose 4,6-dehydratase Human genes 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 abstract description 9
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 abstract description 7
- 244000062645 predators Species 0.000 abstract description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 16
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 6
- 108090000365 Cytochrome-c oxidases Proteins 0.000 description 6
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 101150087323 COI gene Proteins 0.000 description 3
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033772 system development Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于稻田中广食性捕食天敌猎物谱的高通量测序复合标签及其应用,复合标签的序列如编号NO.1~NO.48所示。标签的应用方法包括:提取每一个样本的总DNA;对每一个样本,从48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物,对对应样本的总DNA进行扩增;对每一个样本的扩增产物进行电泳检测,对扩增产物进行纯化回收;对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量;将所有样本等量混合后建立一个基因文库;对所建基因文库进行高通量测序。本发明提高超高通量测序的样本通量,有效降低超高通量测序成本,有效富集样本中整个稻田生态系统中节肢动物种群,为探明稻田中捕食性天敌猎物多样性研究提供高通量分析途径。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域,具体涉及一种用于稻田生态系统广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用。
背景技术
稻田广食性捕食天敌与稻田有害生物防治技术研发密切相关,由于节肢动物形态分类的困难和捕食性天敌猎物检测识别技术的限制,阻碍了稻田生态系统捕食性天敌猎物谱及猎物转换机制和生防技术的深入研究,宏条形码技术的出现使此问题的解决变为可能。因此,利用节肢动物独特的线粒体基因组细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)为靶标序列(Hebert等,2003.Hebert P,et a1.,2003.Biological identifications through DNAbarcodes.Proceedings of the Royal Society,270(1512):313-321),用PCR扩增的方法从复杂样本中富集节肢动物或捕食性天敌体内残留的猎物DNA,利用所扩增序列代表种的特异性来检测捕食性天敌的猎物谱,是一种非常有效的方法。
本发明所指的节肢动物线粒体基因组细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)微型条形码区域是指稻田生境中全部节肢动物COI微条形码序列的总和,为研究节肢动物多样性、种群结构、进化关系、相互协作关系及与环境之间的关系提供了一条新的思路。
在动物分类领域,DNA barcoding采用的标记基因主要是线粒体COⅠ基因;该基因在引物对应部分比较保守,其它序列部分变异相当大,并且容易利用通用引物进行PCR扩增;同时在近缘种间,这段基因的差异也足够大,因此适合作为动物分子鉴定的标记,也是目前在动物分子生态学上应用最广泛的分子标记。线粒体DNA(mtDNA)结构简单、几乎不发生重组、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点,被公认为是研究动物系统发育的重要标记。线粒体基因组包括13个蛋白质编码基因,2个rDNA基因,22个tRNA编码基因和一个非编码区。最常见于物种鉴定研究的mtDNA基因是细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)和16SrRNA基因。由于COI基因具有相对高的种间变异和低度的种内变化,以及相当长的变化序列,又容易扩增,使得COI成为能够鉴别密切相关的物种的重要DNA条形码之一。
发明内容
本发明提供一种用于广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用,提高超高通量测序的样本通量,有效降低超高通量测序成本,有效富集样本中所含稻田节肢动物种群,为探明稻田捕食性天敌猎物谱及其猎物转换机制研究提供高通量分析途径。
该种用于稻田生态系统广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其碱基序列如下序列编号NO.1~NO.48所示。
本发明复合标签的每一条序列均由左侧8~12个碱基组成具唯一性序列和右侧23~27个源于细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)的序列所组成。其中,右侧23~27个源于COI的序列具有一定的简并性,序列中的R为A或G;S为C或G;W为A或T;Y为C或T。
表1 复合标签序列。
本发明还提供一种利用所述复合标签进行超高通量基因测序的方法,包括如下步骤:
(1)提取每一个样本的总DNA;
(2)对每一个样本,从所示48对且未被选择过的复合标签序列中选择任意一对序列作为引物,对对应样本的总DNA进行扩增;
(3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测,对扩增产物进行纯化回收;
(4)对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量;
(5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库;
(6)对所建测序文库进行高通量测序。
本发明所述稻田节肢动物细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列是指所有落在动物线粒体基因组COI基因之间的区域的总和,复合标签如表1所示;利用表1的稻田节肢动物细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列复合标签可达到在一次超高通量测序中同时对1~48个样本中的稻田节肢动物COI基因序列进行检测。
利用目前超高通量测序自身提供96种测序标签(8~12个碱基),可做96个样本,但需在超高通量测序前先对96个样本分别建96个测序库,然后等量混合成1个再同时测序,而本发明只需建1个库就能对48个样本同时测序。如果将测序自带的96个标签和本发明的48个复合标签结合使用,则同时可对96×48个样本的稻田节肢动物细胞色素C氧化酶序列进行超高通量测序。
步骤(1)中对每个样本总DNA提取采用通用提取方法。
步骤(2)中对每一个样本从表1所示48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物,其选择原则具体为:确定每一样本的编号,对每一个编号样本,从表1中选择一序列编号所对应的序列1和序列2(NO.1的序列1和序列2为一对,NO.2的序列1和序列2为一对,NO.3的序列1和序列2为一对,以此类推),确定每一个样本的一对序列;每个编号的样本可选表1中48对中的任何一对,但要求不同编号的样本之间从表1选择时不要重合,即不同编号样本不选择同一个复合标签。
步骤(2)中对对应样本的总DNA进行扩增的扩增体系为:
PCR扩增的50μL体系中含:1μL样本总DNA,25μL 2×Buffer,10μL dNTP,1μL KODFX酶,浓度为10μM引物各5μL,补水至50μL。
PCR扩增程序:94℃预变性2min;98℃变性10s,45℃退火30s,68℃延伸30s,31个循环;68℃延伸10min;产物4℃保存。
步骤(3)中对每个样本扩增产物进行纯化回收采用通用的PCR产物回收试剂盒。
步骤(4)中DNA精确定量使用Life technologies invitrogen的dsDNA HSAssay试剂盒或者分光光度计。
本发明所述高通量测序采用基于Ion Proton第二代超高通测序仪的测序平台进行。
优选地,步骤(5)中建库所用建库试剂盒为Ion Proton第二代超高通测序仪对应的Ion XpressTM Plus gDNA Fragment Library Preparation试剂盒。
步骤(6)中测序时扩增所用扩增试剂盒为Ion Proton第二代超高通测序仪对应的Ion PITM Template OT2200Kit V3试剂盒。
步骤(6)中测序时测序所用测序试剂盒为Ion Proton第二代超高通测序仪对应的Ion PITM Sequencing 200Kit V3试剂盒。
所述样本为稻田广食性捕食天敌的样本。
与现有方法相比,本发明具有如下有益效果:
稻田生态系统中存在大量的节肢动物种类,这些种类特别是广食性天敌对稻田害虫有着重要的控制作用;传统方法上,对天敌猎物谱的研究基本在于田间观察、笼罩实验、猎物蛋白特异性单克隆抗体检测和普通或定量PCR检测。本方法以稻田系统中广食性捕食天敌为研究对象,基于宏基因组学的研究思路,采用本方法所述的序列,建一个库最多可对48个样本同时进行超高通量测序,进行基于宏条形码的稻田生态系统中捕食天敌猎物谱的分析及田间生物多样性的研究,为保护天敌,促进生物防治提供基础,也为各种生态系统中捕食者猎物谱的研究提供参考方法。
附图说明
图1是实施例4中1~24号样本PCR扩增产物电泳检测结果图;
图2是实施例4中25~48号样本PCR扩增产物电泳检测结果图。
其中,M表示DNA Marker,条带从下往上大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2500bp。
具体实施方式
实施例1
稻田广食性捕食天敌样本总DNA的提取可以参照CTAB方法。主要步骤如下:
(1)水浴锅预热至65℃,CTAB裂解液预热至65℃;
(2)取适量样品,用液氮研磨样品至粉末。移到1.5mL离心管中,每管加600μL CTAB裂解液,65℃温浴1.5h左右,期间轻轻摇晃几次;
(3)加入等体积氯仿,轻轻摇匀,水平摇床摇15~20min;12000g离心10min;
(4)取上清液(不要吸到中间层)移到另一离心管中,加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶l),摇匀,水平摇床摇15~20min;12000g离心10min;
(5)取上清液(不要吸到中间层)移到另一离心管中,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶l);摇匀,水平摇床摇15~20min;12000g离心10min;
(6)取上清液移到另一离心管中,加lmL于-20℃预冷的异丙醇和0.1倍NaAc(3M,pH5.2)混匀,放入-20℃沉淀DNA 30min左右;12000g离心10min;
(7)倒掉异丙醇(倒时小心不要把DNA倒掉),直接加入1mL 75%乙醇洗涤;8000g离心5min;倒掉乙醇(倒时小心不要把DNA倒掉);
(8)室温自然风干,至无乙醇为止;加入50μL ddH2O溶解;检测DNA浓度和质量。
DNA提取液组成:100mM Tris,100mM EDTA,200mM NaCl,2%PVPP,3%CTAB,pH9.0。
实施例2
以12个样本为例实施。
(1)将12个样本从1至12编号,从表1中1至48序列中选取12个复合标签与12个样本对应,本实施例中选取的是表1中的1到12号交相关序列合成公司进行合成;再用无DNA酶的水稀释合成的序列至10μM;表1中所选序列号关联给相应的样本编号,如表2。
表2 样本与复合标签对应表。
(2)PCR扩增:取12个200μL PCR管,每管对应一个样本,并用上述样本编号对应的序列编号中的序列1和序列2为PCR扩增的引物。PCR扩增的50μL体系中含:1μL样本总DNA,25μL 2×Buffer,10μL dNTP,1μL KOD FX酶,浓度为10μM引物各1.5μL,补水至50μL。
PCR扩增程序:94℃预变性2min;98℃变性10s,45℃退火30s,68℃延伸30s,31个循环;68℃10min;产物4℃保存。
(3)吸取5μL上述PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳(1.5%,预加荧光显色剂)。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入紫外观测仪上观察电泳结果,成功的PCR反应经电泳检测可获得分子量分布在230bp至260bp间的扩增产物。
实施例3
利用通用的Beckman的Agencourt AMPure XP试剂盒纯化PCR扩增产物,步骤如下:
(1)在1倍体积的PCR反应物中加入1.8倍体积的Agencourt AMPure XP,用移液器吹打10次充分混匀,室温孵育5min。
(2)将上述混合液放在磁力架上,吸附2min或更长时间使磁珠与液体分开至液相清澈透明;去除液体,注意不要碰到磁珠(可留5μL液体);
(3)吸取200μL 70%的新鲜酒精清洗离心管(如果上一步骤中液体总体积超过200μL,加入的酒精量至少等于总体积),30秒后吸出酒精。此步骤重复三次;
(4)等酒精风干后,从磁力架上取下离心管,加入60~100μL Elution Buffer或ddH2O,用移液器吹打10次使液体均匀,室温放置2min或更长时间。
(5)将离心管放回磁力架,吸附1min,所得液体即为高纯度DNA。
将纯化后的PCR扩增产物用Life technologies invitrogen的dsDNA HSAssay试剂盒精确定量,并用水调整至体积为70μL的溶液内DNA总量为50ng。
用Ion Proton第二代超高通测序仪对应的Ion XpressTM Plus gDNA FragmentLibrary Preparation试剂盒进行建库。
用Ion Proton第二代超高通测序仪对应的Ion PITM Template OT2200Kit V3试剂盒和Ion PITM Sequencing 200Kit V3试剂盒进行序列扩增和PI芯片进行测序,并将12个复合标签序列信息输入高通量测序仪所用的测序方法中,高通量测序仪就会依据输入的序列信息,归类相应的样本数据。按照上述测序方法获得的测序结果表明,高通量测序仪能依据各样本对应的复合标签序列,将混合在一起的测序数据有效地能归类出12个样本各自的测序结果,达到了复合标签应用的目的。
对于其他任意样本数量的测序方法同实施例2和实施例3。
实施例4
对48个样本同时进行测序,将表1中48个复合标签全部使用,其余方法同实施例1到实施例3。
成功的PCR反应经电泳检测可获得分子量分布在230bp至260bp间的扩增产物,电泳结果如图1和图2所示,48个样本的PCR反应全部成功。
表3 超高通量测序结果分析。
高通量测序仪能依据各样本对应的复合标签序列,将混合在一起的测序数据有效地能归类出48个样本各自的测序结果,达到了复合标签应用的目的(表3)。
Claims (2)
1.一种用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签,其特征在于,其碱基序列如如下序列编号NO.1~NO.48所示:
2.一种利用权利要求1所述复合标签进行超高通量基因测序的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取每一个样本的总DNA;所述样本为稻田广食性捕食天敌的样本;
(2)对每一个样本,从权利要求1中所示48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物,对对应样本的总DNA进行扩增;对对应样本的总DNA进行扩增的PCR扩增体系为:
1μL样本总DNA,25μL 2×Buffer,10μL dNTP,1μL KOD FX酶,浓度为10μM上下游引物各5μL,补水至50μL;
(3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测,对扩增产物进行纯化回收;
(4)对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量;
(5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库;
(6)对所建测序文库进行高通量测序。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610081432.9A CN105567843B (zh) | 2016-02-04 | 2016-02-04 | 用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610081432.9A CN105567843B (zh) | 2016-02-04 | 2016-02-04 | 用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105567843A CN105567843A (zh) | 2016-05-11 |
CN105567843B true CN105567843B (zh) | 2019-01-11 |
Family
ID=55878459
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610081432.9A Active CN105567843B (zh) | 2016-02-04 | 2016-02-04 | 用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105567843B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110331210B (zh) * | 2019-04-29 | 2022-08-02 | 华南农业大学 | 一套用于获取馆藏甲虫标本DNA条形码的Mini-Barcoding引物及其应用 |
CN110257531A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-09-20 | 山东省花生研究所 | 一种用于检测猎物优势天敌的方法 |
CN112599200A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-02 | 中国农业大学 | 一种基于宏条形码的家畜采食组成校正模型的构建方法 |
CN112725500A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-04-30 | 兰州大学 | 一种量化放牧食草动物食物组分的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104404160A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-03-11 | 南京大学 | 一种mit引物设计方法和利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法 |
-
2016
- 2016-02-04 CN CN201610081432.9A patent/CN105567843B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104404160A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-03-11 | 南京大学 | 一种mit引物设计方法和利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Who is eating what: diet assessment using next generation sequencing;FRANCOIS POMPANON等;《Molecular Ecology》;20121231;第21卷;1931-1950 |
高通量测序及其在食物网解析中的应用进展;王雪芹等;《生态学报》;20170430;第37卷(第8期);2530-2539 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105567843A (zh) | 2016-05-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104911182B (zh) | 鱼类线粒体全基因组dna扩增 | |
CN108715902B (zh) | 梅花垂枝性状snp分子标记及其应用 | |
CN105567843B (zh) | 用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用 | |
CN105950747A (zh) | 一种稻瘟病抗性基因Pi1功能特异性分子标记及其应用 | |
Sahebi et al. | Suppression subtractive hybridization versus next-generation sequencing in plant genetic engineering: challenges and perspectives | |
CN106676099B (zh) | 构建简化基因组文库的方法及试剂盒 | |
CN106995841A (zh) | 一种转基因大豆检测用多重pcr试剂盒及检测方法 | |
CN108642208A (zh) | 一种樟属及其近缘属植物通用ssr分子标记及其开发方法和应用 | |
CN104846082B (zh) | 一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒 | |
CN105624302B (zh) | 用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其应用 | |
KR102283638B1 (ko) | 담배 품종 판별용 rapd 프라이머 | |
CN112708658B (zh) | 一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用 | |
CN106755554A (zh) | 松材线虫ssr标记引物用于松材线虫检测的用途及松材线虫的pcr检测方法 | |
Mishra et al. | A modified cDNA subtraction to identify differentially expressed genes from plants with universal application to other eukaryotes | |
KR101765298B1 (ko) | 아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
CN106282332B (zh) | 用于多重核酸测序的标签和引物 | |
CN107267503A (zh) | 核酸和检测转基因水稻b1c893及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途 | |
KR101860785B1 (ko) | 검역 세균인 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
CN110144413A (zh) | 日本血吸虫w染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用 | |
CN114561484B (zh) | 一种扩增水稻产量相关基因位点的多重pcr引物组合及其试剂盒 | |
CN105483252B (zh) | 含gus报告基因的转基因材料的pcr检测引物及检测方法 | |
CN112941151B (zh) | 一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用 | |
CN115820894B (zh) | 用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记、引物及其应用 | |
KR101860784B1 (ko) | 검역 세균인 클라비박터 미시가넨시스 아종 네브라스켄시스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
KR102634095B1 (ko) | 고추에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 및 프로브 세트 및 진단 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |