KR101860785B1 - 검역 세균인 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 총 5개의 프라이머 세트를 이용하여 검역세균인 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명을 통해 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 대한 특이적 검출이 쉽고 빠르게 수행될 수 있으므로, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스 균주의 국내로의 도입을 철저히 방지할 수 있어, 매우 유용하다.
Description
본 발명은 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 5종의 프라이머 세트를 포함하는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
식물검역은 일정한 지역에 유입·정착한 병해충이 다른 지역으로 확산하는 것을 방지하기 위하여, 대상식물의 검사, 이동금지나 제한, 병균·해충이 부착된 식물의 소독(약제살포·훈증·水沒 등)·폐기(소각·분쇄·매립 등) 등의 조치를 취하는 일을 말한다. 지구상에 있는 나라마다 고유한 동물과 식물이 있듯이 병해충의 분포상황도 지역에 따라 서로 다르다. 병해충이 일정 지역에서만 살고 있는 것은, 새로 정착할 지역의 기후·환경이 생존에 적합하지 않은 탓도 있지만, 대부분의 병해충은 살기 좋은 다른 지역이 많이 있어도 스스로 이동하기 어렵기 때문이다.
병해충의 이동은 대체로, ① 기주식물(寄主植物)과 그 생산물에 잠복하거나 묻어서 이동하는 경우, ② 포장재·용기 및 항공기·선박·자동차와 같은 수송수단에 묻어서 이동하는 경우, ③ 자체비산(自體飛散)과 매개곤충이나 조류 등의 체내에 잠복하거나 몸에 묻어서 이동하는 경우, ④ 바람·물·기류 등에 의하여 이동하는 경우 등이 있다.
그러나 최근에 와서 교통수단과 산업의 발달로 국제교역량이 급증하고 여행자의 왕래가 빈번하게 됨에 따라 많은 종류의 병해충이 인위적인 요인에 의하여 멀리까지 신속하게 이동되고 있다. 일단 외국으로부터 침입한 새로운 병해충은 기후·환경조건이 알맞고 기주식물이 풍부할 경우에는 원산지에서보다 더욱 큰 피해를 입히는 실례가 많이 있다. 따라서 새로운 병해충이 유입되었을 때 일어날 수 있는 국가적인 재앙(災殃)을 사전에 방지하여 농림업 생산의 안정화를 이룩하고 생태계(生態系)를 보호하여 자연을 아름답게 하고, 인간생활을 쾌적하게 하려는 데 식물검역의 필요성이 있다.
이와 같은 식물검역을 세계 각국이 정부 차원에서 정책적으로 점차 강화하는 근본적인 이유는 새로운 병해충의 침입을 막는 데 소요되는 경비와 불편이, 침입된 병해충을 방제(防除)하는 데 소비되는 비용이나 피해액에 비하면 매우 경제적이기 때문이다.
한편, 한국등록특허 제0905224에서는 '식물기생 선충 검역 및 세척방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '검역 세균인 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 개발하고자, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 ATCC로부터 분양받아 게놈 시퀀싱을 수행한 후, 다른 세균과 유사성이 없는 유전자 영역에서 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)에 특이적인 14개의 프라이머 세트를 디자인하였다. 상기 14개의 프라이머 세트 중에서 최종적으로 5종의 프라이머 세트가 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에서만 PCR 반응이 있고, 토양 미생물 DNA 복합체에서는 PCR 반응이 없는 점을 통해 특이성이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 최종선발된 총 5개의 프라이머 세트를 이용하여 검역세균인 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명을 통해 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 대해 특이적 검출이 쉽고 빠르게 수행될 수 있으므로, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스 균주의 국내로의 도입을 효과적으로 철저히 방지할 수 있어, 매우 유용한 발명이다.
도 1은 본 발명에서 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)에 특이적으로 반응하는 프라이머를 1차 선발하기 위해 종 특이적으로 설계된 프라이머 14쌍을 이용하여 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과이다. 오른쪽의 표의 size(bp)는 PCR 산물의 예상 크기를 나타내며, 붉은색은 예상의 PCR 산물이 생성되지 않는 7개의 프라이머 세트로 1차 선발에서 제외된 프라이머 세트를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 특이적으로 반응하는 프라이머를 2차 선발하기 위해 총 7개의 프라이머 세트를 이용하여 음성 대조구로서 미생물 다양성이 높은 산에 있는 부엽토로부터 추출한 DNA 복합체를 주형으로 PCR을 수행한 결과이다. 오른쪽의 표의 size(bp)는 PCR 산물의 예상 크기를 나타내며, 붉은색은 예상의 PCR 산물이 생성되지 않는 5개의 프라이머 세트로 2차 선발된 프라이머 세트를 나타낸 것이다.
도 3은 미생물 다양성이 높은 산에 있는 부엽토로부터 추출한 DNA 복합체를 주형으로 PCR을 수행한 결과로서, 최종 선발된 5개의 프라이머 세트가 부엽토 DNA 복합체에 대해 PCR 산물을 생성하지 않는 것을 통해 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 특이적이라는 것을 보여주는 것이다.
도 2는 본 발명에서 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 특이적으로 반응하는 프라이머를 2차 선발하기 위해 총 7개의 프라이머 세트를 이용하여 음성 대조구로서 미생물 다양성이 높은 산에 있는 부엽토로부터 추출한 DNA 복합체를 주형으로 PCR을 수행한 결과이다. 오른쪽의 표의 size(bp)는 PCR 산물의 예상 크기를 나타내며, 붉은색은 예상의 PCR 산물이 생성되지 않는 5개의 프라이머 세트로 2차 선발된 프라이머 세트를 나타낸 것이다.
도 3은 미생물 다양성이 높은 산에 있는 부엽토로부터 추출한 DNA 복합체를 주형으로 PCR을 수행한 결과로서, 최종 선발된 5개의 프라이머 세트가 부엽토 DNA 복합체에 대해 PCR 산물을 생성하지 않는 것을 통해 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 특이적이라는 것을 보여주는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 3, 4, 5, 6, 9, 10, 23, 24, 25 및 26의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3, 4, 5, 6, 9, 10, 23, 24, 25 및 26의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출기 위한 프라이머 세트이다.
서열번호 3, 4, 5, 6, 9, 10, 23, 24, 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 동시에 이용하면 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 더욱 효율적으로 진단, 예측 또는 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
분석 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 분석 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 게놈 시퀀싱, 균주 동정 및 특이 프라이머 디자인
(1) 게놈 시퀀싱 및 균주 동정
본 발명에서는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) ATCC51875를 대상으로 게놈 시퀀싱을 수행하였다. 게놈 시퀀싱은 이온 토렌트 PGM 시퀀서(ion torrent PGM Sequencer)를 사용한 NGS 시퀀싱으로 진행하였으며, 시퀀싱 결과 얻어진 게놈 절편 서열에 대해서는 이후 게놈 어셈블리 과정을 진행하기 위해 각 서열의 퀄리티를 확인하였다.
또한, 게놈 어셈블리는 시퀀싱 결과 서열을 바탕으로 유전체 길이에 가까운 스캐폴드(scaffold)를 만드는 과정으로 CLC genomics workbench v6.5, gsAssembler v2.9 어셈블 시스템을 이용하였으며, 다음의 과정을 거쳐 진행하였다. 여러 개로 복사된 유전체를 랜덤하게 자른 후 크기에 따라 분류하여 일정 길이만큼 읽어내고, 읽어낸 서열들의 최초 조각들을 어셈블하여 컨티그(contig)를 생성시키고, 더 긴 유전체 서열을 만들기 위해 스캐폴딩 프로세스를 거쳤다.
유전체 어노테이션(annotation) 과정은 유전자 예측 단계와 어노테이션 단계로 구성이 되며, 유전체 예측에는 Glimmer 3.0을 이용하고, tRNA와 rRNA 분석은 RNAmmer와 tRNAscan-SE를 이용하였다. 그리고 예측된 유전자는 BLAST를 이용해 NCBI-NR, Uniref90, COG, KEGG 데이터베이스와 비교한 후 유전자 어노테이션을 진행하였다.
(2) 특이 프라이머(primer) 디자인
각 종에 대한 특이 프라이머 디자인은 다른 종과 유사성이 없는 서열을 이용해 진행되어야 하기 때문에 유전자정보가 알려진 모든 세균간 BLAST를 통해 유사성이 없는 영역을 분석한 후 해당 영역의 서열을 추출하였다. 추출한 서열을 이용해 프라이머를 디자인하였으며, 프라이머 디자인에는 Primer3를 이용하고 프라이머 디자인을 위해 사용한 설정 값은 다음과 같다.
- 프라이머 사이즈(bp) : 18 ~ 27, optimum 20
- Tm(℃) : 57.0 ~ 63.0, optimum 60.0
- GC% : 20.0 ~ 80.0
- PCR 산물 크기(bp) : 100 ~ 1000, optimum 200
위 과정을 통해 디자인된 프라이머는 다른 세균과 유사성이 없는 영역에서 디자인된 것으로 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)에 대한 특이 프라이머로 사용될 수 있는지에 대한 검증이 필요하며, 이를 위해 디자인된 프라이머와 NCBI-NT 데이터베이스간 BLAST를 진행하였다. 디자인된 프라이머와 NCBI-NT 데이터베이스간 BLAST 결과를 이용해 디자인된 프라이머에 대한 필터링(filtering)을 진행하여 최종적으로 특이 프라이머 리스트를 구하였으며, 필터링 과정과 필터링 기준은 다음과 같다.
필터링 기준은 크게 3단계로 나누었으며, 첫째 BLAST 결과 프라이머 서열과 다른 종의 서열이 정확히 일치하는 경우, 둘째 BLAST 결과 프라이머 서열과 다른 종의 서열이 일치하는 정도(프라이머 서열의 길이)가 1인 경우, 셋째 BLAST 결과 프라이머 서열과 다른 종의 서열이 일치하는 정도(프라이머 서열의 길이)가 2인 경우이다.
필터링 과정은 3단계의 필터링 기준에 대해 각각 BLAST 결과를 확인하여 다른 종에서도 발견되는 프라이머를 제거하였으며, 제거 후 프라이머는 정방향과 역방향이 쌍으로 존재하여야 하므로 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나만 남아있는 프라이머 쌍 역시 제거하였다.
2. 토양 세균의 게놈 DNA의 추출
토양 샘플은 미생물 다양성이 높은, 즉 많은 종류의 미생물이 존재하는 산비탈의 부엽토에서 수집하였고, 400 mg 부엽토를 대상으로 Macherey-Nagel NucleoSpin soil kit(Germany)를 이용하여 gDNA를 추출하였다. NanoDrop 1000 spectrophotometer(Thermo)를 이용하여 추출된 gDNA 농도를 측정하였다.
3. 본 발명에서 디자인 프라이머를 이용한 PCR 수행 조건
BIONEER AccuPower® HotStart PCR premix tube (BIONEER, MyGenie96 Thermal black)에 표 1과 같은 PCR 혼합물을 넣고 표 2의 조건으로 PCR을 수행하였습니다.
| PCR mixture | |
| BIONEER AccuPower® HotStart PCR premix | |
| Bacteria genomic DNA (10 ng/ul) | 1 ul |
| Forward primer (10 pmoles) | 1 ul |
| Reverse primer (10 pmoles) | 1 ul |
| DW | 17 ul |
| Total volume | 20 ul |
| PCR program | ||
| 94 ℃ | 10 min | |
| 94 ℃ | 20 sec | 35 cycle |
| 55 ℃ | 30 sec | |
| 72 ℃ | 30 sec | |
| 72 ℃ | 5 min | |
실시예
1. 본 발명에서
쿠르토박테리움
플라쿰파시엔스
pv
. 플라쿰파시엔스(
Curtobacterium
flaccumfaciens
pv
.
flaccumfaciens
) 특이적
프라이머의
디자인
본 발명에서는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) ATCC51875를 대상으로 게놈 시퀀싱을 수행하였고, 특이 프라이머 디자인은 다른 종과 유사성이 없는 서열을 이용해 진행되어야 하기 때문에 유전자정보가 알려진 모든 세균간 BLAST를 통해 유사성이 없는 영역을 분석한 후 해당 영역의 서열을 추출하였다. 특히, 본 발명에서는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) ATCC51875로부터 추출한 게놈 서열을 대상으로 하여 하기 표 3과 같이 14쌍의 프라이머를 디자인하였다.
| Primer name | Sequence (서열번호) | Tm (℃) | GC (%) |
| C.flaccumfaciens-1-F | GGTCTGGAAGAGCGACTCAC(1) | 62.5 | 60 |
| C.flaccumfaciens-1-R | AAGTTCTCGATGCAGGTGCT(2) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-2-F | GTCTGGAAGAGCGACTCACC(3) | 62.5 | 60 |
| C.flaccumfaciens-2-R | AAGTTCTCGATGCAGGTGCT(4) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-3-F | GAGACTCATGTGGGTCCGTT(5) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-3-R | GTCCGTTCCTGAACAACGAT(6) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-4-F | AGACGTAGCTGCCGATCAGT(7) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-4-R | CGTCGAGTCGAACTTCATCA(8) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-5-F | AACAGGACCTCGAACACGAC(9) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-5-R | CGTCGAGTCGAACTTCATCA(10) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-6-F | CCTTCGCTGACTTTCCACTC(11) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-6-R | GGACCAACTACACTCGGCAT(12) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-7-F | GAAGTGCGTCCGAGAGTTTC(13) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-7-R | AACCGGTCTATGCACTACGG(14) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-8-F | AGATCATCGCAAGGCTCACT(15) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-8-R | CGCTCTTACTTGCCTATGCC(16) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-9-F | GCCGTCCGATAGTCGTACAT(17) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-9-R | CTGTATGCCGAGCACTTCAA(18) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-10-F | CACAAAGTGTTCGGGGAGTT(19) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-10-R | GTACCGTCGAGCGAGATAGC(20) | 62.5 | 60 |
| C.flaccumfaciens-11-F | ATTCACTACGGGTACTGGCG(21) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-11-R | CATGCTGGCTCATTCGAGTA(22) | 58.4 | 50 |
| C.flaccumfaciens-12-F | GTCGACCTCTACACGGTGGT(23) | 62.5 | 60 |
| C.flaccumfaciens-12-R | GTCCTGGTACTTCCCGTTGA(24) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-13-F | GTGACACGAGACATGGTTGG(25) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-13-R | TCACTCGTCAAGATACCCCC(26) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-14-F | ATTCACTACGGGTACTGGCG(27) | 60.5 | 55 |
| C.flaccumfaciens-14-R | CATGCTGGCTCATTCGAGTA(28) | 58.4 | 50 |
실시예 2. 본 발명에서 디자인한 프라이머로 수행한 PCR을 통해 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)의 특이적 검출 확인
본 발명에서 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)에 특이적으로 반응하는 프라이머를 1차 선발하기 위해 종 특이적으로 설계된 프라이머 14쌍을 이용하여 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다(도 1). 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 예측한 PCR 산물 크기와 실제 실험결과인 PCR 산물 크기가 일치하는 결과를 얻은 프라이머를 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 특이적으로 반응하는 프라이머로 정의하고 1차 선발한 결과, 1~5, 12 및 13의 프라이머 세트는 제대로 증폭되어 예측한 PCR 산물 크기와 일치한 것을 알 수 있었고, 프라이머 세트 6, 7, 8, 9 및 10은 증폭이 되지 않았고 프라이머 세트 11 및 14는 예측한 크기를 크게 벗어났음을 알 수 있었다. 이는 프라이머 세트 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 14가 해당세균에 특이적으로 반응하지 않음을 알 수 있으므로 1차 선발 과정에서 제외하였다.
또한, 본 발명에서 1차에서 선발된 총 7개의 프라이머 세트가 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에 특이적으로 반응하는지 분석하기 위해, 각종 미생물을 포함하고 있는 산비탈의 부엽토로부터 게놈 DNA 복합체를 추출하였고, 농도가 319.6ng/㎕인 것을 확인하였다. 상기 추출된 토양 게놈 DNA 복합체를 음성 대조구로서 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 토양 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행했을 경우 총 5종의 증폭된 단편들이 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스의 특이적 타겟 크기 또는 부근에서 증폭되는 것으로 확인되었는데(도 2), 프라이머 세트 2, 3, 5, 12 및 13에서는 토양 DNA 복합체에서 증폭이 되지 않았으며, 도 1에서와 같이 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에만 특이적 반응을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 2차 선발을 통해 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에서만 특이적으로 반응하는 총 5개의 프라이머 세트를 선발하였다. 2차 선발에서 제외된 총 2개의 프라이머 세트는 해당 프라이머에 의해 증폭된 단편이 다른 미생물에서 공통적으로 가지는 서열을 포함하고 있다는 것을 알 수 있고, 이런 프라이머는 우리가 찾고자하는 해당 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에서만 특이적으로 반응하는 프라이머라고 할 수 없기 때문에 선발과정에서 제외한 것이다.
최종적으로, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스에서 PCR 산물을 생성하면서(도 1), 동시에 토양 DNA 복합체에서 PCR 산물을 생성하지 않는 프라이머 세트 2, 3, 5, 12 및 13(도 2)을 최종 선발하였다(도 3).
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pv. flaccumfaciens, quarantine plant pathogen and uses thereof
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<170> KoPatentIn
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ggtctggaag agcgactcac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
aagttctcga tgcaggtgct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
gtctggaaga gcgactcacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
<400> 4
aagttctcga tgcaggtgct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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gagactcatg tgggtccgtt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<223> primer
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<223> primer
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<210> 19
<211> 20
<212> DNA
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gtgacacgag acatggttgg 20
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tcactcgtca agataccccc 20
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<213> Artificial Sequence
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catgctggct cattcgagta 20
Claims (6)
- 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트.
- 삭제
- 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하기 위한 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
- 분석 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스 pv. 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)를 특이적으로 검출하는 방법. - 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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| Antonie van Leeuwenhoek, Vol. 80, pp. 1-10 (2001.) |
| Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, Vol. 41, pp. 320-328 (2011.) |
| Journal of Plant Pathology, Vol. 91, pp. 249-297 (2009.)* |
| Letters in Applied Microbiology, Vol. 35, pp. 331-337 (2002.) |
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| Publication number | Publication date |
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| KR20170059090A (ko) | 2017-05-30 |
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