KR101765298B1 - 아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 초위성체(microsatellite) 프라이머 세트 및 이를 이용한 아시아매미나방 원산지 판정 방법은 검역시 검출된 아시아매미나방의 원산지를 정확히 판정함으로써 아시아매미나방의 유입경로를 정확하게 추적 가능하며, 이를 통해 아시아매미나방에 대한 검역과정에서 발생하는 유출 및 유입 국가에 대한 논란에 유용하게 이용될 수 있기 때문에 아시아매미나방에 대한 국가간 검역적 논쟁 해결 및 방제에 효과적으로 기여할 수 있다.

Description

아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도{Microsatellite primer set for discriminating origin of Asian Gypsy Moth and uses thereof}
본 발명은 아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트를 포함하는 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 아시아매미나방 원산지를 판별하기 위한 방법에 관한 것이다.
매미나방(Lymantria dispar)은 나비목(Lepidoptera)의 독나방과(Lymantridae)에 속하는 곤충으로 세계적으로 3개 아종, 유럽매미나방(Lymantria dispar dispar), 아시아매미나방(Lymantria dispar asiatica) 및 일본매미나방(Lymantria dispar japonica)이 알려져 있다. 상기 아종들은 세계적으로 유명한 산림해충으로 보고된 바 있으며, 북미, 남미 및 오세아니아 대륙 등 아종들이 분포하지 않는 지역에서는 주요 검역대상해충으로 지정하여 유입을 차단하고자 노력하고 있다. 특히, 미국 동부지역에는 1868년과 1869년도에 교잡 실험을 위해 유럽으로부터 유입된 유럽매미나방이 증식 및 분산하여 현재 약 300여 종의 식물을 가해하는 북미의 대표 산림해충으로 자리잡으면서, 연간 방제 비용이 약 1천 1백만 달러가 소모되고 있는 실정이다. 이에 따라, 현재 북미에 유입된 기록이 없는 아시아매미나방에 대한 검역 체계가 강화되면서, 아시아 루트 선박의 경우 아시아매미나방 검사 필증서를 지참하여야만 입항이 가능하도록 규제가 강화되었다. 한국에서도 국제식물검역인증원에서 매미나방의 검사를 수행하고 있지만, 한국 내 해역을 지나가는 선박에 대한 미국 내에서의 검사에서 아시아매미나방 난괴의 발견이 빈번한 상황이다.
최근 곤충류에서 초위성체 자위들(microsatellites loci)을 이용한 유전적 다양성 분석은 침입종에 대한 원산지 분석에 중점을 두고 수행되고 있는 상황이며, 특히, 산업곤충 및 해충의 유입 내지 유출에 관련하여 대두되고 있다. 초위성체는 2~5 염기의 DNA 서열이 반복되는 자위로서 일종의 VNTR(Variable Number Tandem Repeat)이며, SSRs(Simple Sequence Repeats) 또는 STRs(Short Tandem Repeats)라고 불리기도 한다. 초위성체는 진핵세포의 유전자 중 보통은 인트론(intron)에 함입되어 있으나 종종 엑손(exon)에 위치하기도 하며, 특정 단백질이나 효소를 코딩하고 있지는 않지만, 일반적으로 공우성(co-dominant)을 나타낸다. 이 때문에 초위성체를 활용한 개체군 유전학적 분석은 현재 다양한 분류군을 대상으로 수행되고 있으며, 분석 방법 역시 넓게는 개체군의 유전적 다양성 평가에서부터 좁게는 친자확인에 이르기까지 다양하게 개발되어 있는 상태이다. 초위성체 분석을 위해서는 분자 마커의 개발이 필수적인데, 최근에는 차세대 핵산 염기서열 판독법(Next Generation Sequencing)을 기반으로 마커 개발이 수행되고 있다. 이 방법은 전체 체세포 DNA에 대한 서열 판독 후 유전자 라이브러리를 기반으로 초위성체를 검색하여 마커를 제작하는 방법으로 기존에 알려진 방법에 비해 시간 및 비용적 측면에서의 소모가 비교적 적을 뿐 아니라 많은 수의 체세포 DNA 내 초위성체 영역을 탐색할 수 있기 때문에 기존의 방법보다 많은 수의 마커를 개발할 수 있다. 세계적으로 유명한 산림 및 침입해충인 매미나방(Lymantria dispar)에 대해서도 각 아종별로 초위성체에 대한 분석이 각 국가별로 활발히 진행되고 있는 상황이다. 유럽매미나방의 경우 미국에서 연구가 이루어졌으며 이를 이용하여 원산지 분석이 수행되고 있으며, 일본에서도 일본매미나방에 대한 연구가 이루어져 있는 상황이다. 아시아매미나방에 대한 연구는 일부 상기 유럽매미나방 및 일본매미나방에 대한 분석을 수행하면서 부분적으로 이루어지기는 하였으나, 아직까지 세계적으로 진행된 바가 없는 상황이다.
한편, 한국등록특허 제0829836호에는 저장미 서식해충쌀바구미, 화랑곡나방, 보리나방의 조기감별 분자마커의 개발에 대해 개시하고 있으나, 본 발명의 아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 언급된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 아시아매미나방 성충으로부터 체세포 DNA를 추출하여 이를 토대로 차세대핵산 염기서열 판독(NGS)을 실시하였으며, 그 결과, 탐색된 초위성체 영역에 대한 프라이머 세트를 고안하였다. 특수 올리고로 제작한 프라이머 세트의 PCR 효율 평가를 통해 총 10개의 아시아매미나방의 원산지 판정용 프라이머 세트를 선별하였으며, 이를 이용한 아시아매미나방의 원산지를 초위성체의 대립유전자형 빈도 차이를 통해 정밀하게 판정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트를 포함하는 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 아시아매미나방 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 초위성체(microsatellite) 프라이머 세트 및 이를 이용한 아시아매미나방 원산지 판정 방법은 검역시 검출된 아시아매미나방의 원산지를 정확히 판정함으로써 아시아매미나방의 유입경로를 정확하게 추적 가능하며, 이를 통해 아시아매미나방에 대한 검역과정에서 발생하는 유출 및 유입 국가에 대한 논란에 유용하게 이용될 수 있기 때문에 아시아매미나방에 대한 국가간 검역적 논쟁 해결 및 방제에 효과적으로 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 아시아매미나방의 원산지 판별용 10개의 프라이머 세트를 이용하여 각 지역별 개체간의 대립 유전자형의 차이를 비교한 결과이다. 1은 39767 프라이머; 2는 58587 프라이머; 3은 124259 프라이머; 4는 134079 프라이머; 5는 230995 프라이머; 6은 243906 프라이머; 7은 297455 프라이머; 8은 306436 프라이머; 9는 344041 프라이머; 10은 346977 프라이머를 이용한 결과이다.
도 2는 본 발명의 아시아매미나방의 원산지 판별용 10개의 프라이머 세트를 이용하여 각 지역 개체별 대립 유전자형 빈도를 비교하여 유사도를 분석한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명의 아시아매미나방의 원산지 판별용 10개의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시킨 산물에 대해 유전형질 분석(Genotyping)을 통하여 각 지역 개체간 대립 유전자형을 색으로 표시하여 비교한 결과로 지역 개체 간 개체 대립 유전자형의 빈도 차이를 나타낸 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 10개의 프라이머 세트를 포함하는 아시아매미나방 원산진 판별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 20의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20mer)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(20mer)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 20의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로 나타낸 염기서열은 본 발명의 바람직한 실시예로서 제시되는 아시아매미나방 원산지 판별용 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 홀수 서열은 모두 정방향(forward) 프라이머를 나타내며, 짝수서열은 역방향(reverse) 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 VIC, NED, FAM 또는 PET이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 VIC, NED, FAM 또는 PET를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 명세서에 있어서, 상기 아시아매미나방의 분포 범위는 바람직하게는 동북아시아일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 아시아매미나방 원산지를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 아시아매미나방의 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 PCR 증폭 산물을 유전자형질 분석(Genotyping)을 통해 아시아매미나방 원산지를 판별하는 단계를 포함하는, 아시아매미나방 원산지를 판별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 아시아매미나방 성충에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 상기 유전자형질 분석은 아시아매미나방의 대립유전자의 종류 및 빈도분석을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 아시아매미나방의 체세포유전자( Genomic DNA ) 서열 판독 및 초위성체 영역 탐색
아시아매미나방 성충의 가슴근육을 적출하여 마쇄한 후 뉴클레오스핀 티슈 키트(NucleoSpin Tissue Kit)를 이용하여 체세포유전자(Genomic DNA)를 추출하였다. 추출된 아시아매미나방의 체세포 DNA을 토대로 차세대핵산 염기서열 분석(Next-generation sequencing, NGS)을 실시하였다. 이때 사용된 서열분석장비 및 분석 기준은 MiSeq Sequencer(Illumina)의 1/8 플레이트를 이용하였으며, 분석 결과는 하기 표 1과 같다.
아시아매미나방의 체세포 DNA에 대한 차세대핵산 염기서열 분석결과
단편 수 단편의 평균 서열 길이 총 분석 염기 수
분석단편 15,988,036 248.58 3,974,358,483
조합단편 718,940 511 367,397,618
분석된 체세포 DNA 서열은 파일 용량 약 50mb로 구분하여 파스타(fasta) 형식의 컴퓨터 파일로 변환하였다. 파스타 형식의 파일로 저장된 체세포 DNA 서열은 초위성체 탐색 컴퓨터 프로그램을 이용하여 초위성체 영역을 탐색하였다. 이때 사용된 초위성체 탐색 컴퓨터 프로그램은 포보스(Phobos)로 반복서열 길이 2~4bp, 반복횟수 4회 이상의 조건으로 탐색하였으며, 총 1,864개의 초위성체 영역을 탐색하였다.
실시예 2. 탐색된 초위성체 영역에 대한 프라이머 세트 고안
상기 실시예 1에서 탐색된 초위성체 영역은 서열 반복 횟수 6회 이상의 영역만을 선별하여 프라이머 세트 고안 컴퓨터 프로그램을 이용해 프라이머 세트를 구성하였다. 서열 반복 횟수 6회 이상의 초위성체 영역은 총 430개로 나타났으며, 이에 대해 TM 55.5~56.5℃, GC 함량 30% 이상, 프라이머 길이(primer length) 18~22bp의 조건으로 프라이머 제작 가능성을 평가하여 총 207개의 초위성체 영역에 대한 프라이머 세트를 고안할 수 있었다. 이때 사용된 프라이머 고안 컴퓨터 프로그램은 프라이머(Primer) 3을 사용하였다.
실시예 3. 아시아매미나방 원산지 판정용 프라이머 세트 선별
상기 실시예 2에서 고안된 207개의 프라이머 세트 중 150개 프라이머 세트를 무작위로 선별하여 일반 올리고를 이용한 프라이머 세트를 제작하여 초위성체 영역의 염기서열을 각 지역에서 확보된 아시아매미나방의 주형 DNA를 대상으로 증폭하여 대립유전자형을 나타내는 29개의 프라이머 세트를 선별하였다. 선별된 29개 프라이머 세트에 대하여 FAM(fluorescein)을 부착한 특수 올리고로 제작된 프라이머 세트를 제작하였다. 이때 사용된 FAM은 증폭된 염기서열의 길이를 측정하는 형광 염색 물질이다. 특수 올리고로 제작한 프라이머 세트는 PCR 증폭 효율을 평가하기 위하여 DNA 증폭 후 전기영동을 수행하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 특수 올리고로 제작한 프라이머 세트의 PCR 효율 평가를 통해 총 10개의 아시아매미나방의 원산지 판정용 프라이머 세트를 선별하였으며, 선별된 10개의 프라이머 세트 및 관련 정보는 하기 표 2와 같다.
본 발명에 사용된 프라이머
서열번호 프라이머 세트 프라이머 세트 염기서열 초위성체
반복서열 및 횟수
1 39767-FAM AGCGCTTCCTAATTGGTTAT (GT)15
2 39767R ACGCGTGGTTATAACTTTCA
3 58587-FAM TGCAGTCGAATTTAGGCAAA (ATG)8
4 58587R TTGAACAAAGCCAATCGGAT
5 124259-FAM TTGACACTGCACCGTAAATT (AG)13
6 124259R ATATTGCGCATATGACCCAC
7 134079-FAM TGAAAGACGACTAAAGCACG (ATC)9
8 134079R GACTCTTGAGCAATTGGGTT
9 230995-FAM CCATCTGACCATTGTGCTAT (ATC)10
10 230995R TGAGGCACTATGTCCTTGAT
11 243906-FAM ACGGAACCCTAAAAATGAAC (ATC)10
12 243906R TTACCTGGAATGGTCGAATA
13 297455-FAM GTGTGCGTTCTGTGGTATG (CT)23
14 297455R GTGGACTCGCTGTAACACTC
15 306436-FAM CGTCTGCGTACTATCATATTGA (GT)13
16 306436R GTTGTACTGTTACTCCTCGC
17 344041-FAM GTGGCACGTGAACAAATATAC (ATC)9
18 344041R CTTTGCTTGTGGGTGTCATA
19 346977-FAM CTTGCTGGACTTATCTGTGG (AGTC)8
20 346977R ACGTTTTTCAGTGGGTAGGT
실시예 4. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 아시아매미나방의 원산지 판정
1) 각 지역별 아시아매미나방 개체에 대한 PCR 증폭 및 대립유전자형 분석
아시아매미나방의 각 지역 개체들에 대해 원산지 판정용 특수 올리고 프라이머 세트를 이용하여 각 개체에 대한 초위성체 영역을 PCR 증폭하였다. 상기 PCR 방법은 3 스테이지(stage) 3 스텝(step)의 조건으로 수행하였으며, 총 1시간 9분 45초가 소요되었다.
1 스테이지(stage): 체세포 DNA를 단일 서열로 분리시키기 위하여 94℃에서 5분간 열처리하였다.
2 스테이지(stage): 1 스텝(step)에서는 체세포 DNA와 프라이머를 변성시키기 위해 94℃에서 10초간 처리, 2 스텝(step)에서는 체세포 DNA에 프라이머를 접촉시키기 위해 56℃에서 10초간 처리, 3 스텝(step)에서는 DNA를 합성하기 위해 72℃에서 20초간 처리하였으며, 이는 35회 반복 수행하여 목적한 초위성체 서열을 증폭하였다.
3 스테이지(stage): 72℃에서 5분간 반응시켜 PCR 반응을 종료하였다.
상기 PCR 증폭에서는 염색물질이 첨가되지 않은 PCR 프리믹스(premix)를 이용하여 수행하는 것이 바람직하며, 증폭된 DNA 서열에 대한 오류를 교정하는 기능이 있는 하이 피델리티 택 폴리머라제(High Fidelity taq polymerase)를 이용하는 것이 바람직하다.
각 지역별 개체에 대한 PCR 산물은 지노타이퍼(Genotyper)를 이용하여 유전자형질 분석(Genotyping)을 하였다. 이때, 지노타이퍼(Genotyper)는 유전자 분석 장비인 ABI3730XL을 이용하여 분석하였다. 유전자형질 분석(Genotyping)을 통해 얻어진 각 지역 개체별 초위성체 대립유전자형은 초위성체 대립유전자형 분석 컴퓨터 프로그램을 이용하여 빈도 분석 및 개체별 유전자형을 분석하였다. 이때 초위성체 대립유전자형 빈도 분석 컴퓨터 프로그램은 파워마커(PowerMarker)이며, 개체별 유전자형 분석 프로그램은 STRUCTURE이다.
상기 각 지역 개체별 대립유전자 빈도 분석결과, 하기 표 3에 개시된 바와 같이 각 지역 개체군마다 체세포 DNA 내에 보유하고 있는 대립유전자형의 종류 및 빈도에서 차이가 있음을 알 수 있으며, 이를 종합하여 분석 지역간의 유사도 평가를 수행한 결과, 도 2에서 개시된 바와 같이 각 지역 간의 대립유전자 빈도의 차이에 따라 지역 개체군별로 분지되어 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 지역 개체군 간의 분지된 길이에 따라 대립 유전자형의 유사도를 평가할 수 있었다.
또한, 각 지역 개체간 대립 유전자형을 색으로 표시하여 비교한 결과(도 3), 지역 개체 간 개체 대립 유전자형의 빈도 차이에 있어 유사성이 높으면 색 패턴이 유사한 결과를 나타내었고, 유사성이 낮으면 전혀 다른 색 패턴을 나타내었다. 이를 통해, 미지의 표본을 대상으로 본 발명에서 개발한 아시아매미나방의 원산지 판별용 10개의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시킨 산물에 대해 유전형질 분석(Genotyping)을 수행하고, 대립 유전자형의 종류 및 빈도를 색으로 표시하여 우세하게 나타내는 색 패턴을 도 3과 비교 판별함으로써, 미지의 표본의 원산지를 판별해낼 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 10개의 아시아매미나방 원산지 판별용 초위성체 프라이머 세트를 이용하여 대립유전자형의 빈도를 나타내는 색의 분포 양상 차이를 통해 아사이아매미나방의 원산지를 특이적으로 판별할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 10개의 프라이머 세트를 이용한 각 지역 개체별 대립유전자 빈도 분석결과
프라이머 대립
유전자형		 대립유전자형 빈도
한국 1 한국 22 한국 26 한국 31 러시아 몽골
39767 129 0.0000 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
39767 143 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
39767 145 0.0750 0.0526 0.0250 0.1000 0.0333 0.2647
39767 147 0.1000 0.1316 0.0500 0.1000 0.0833 0.1176
39767 149 0.1500 0.2895 0.1250 0.2750 0.1333 0.2941
39767 151 0.2000 0.2105 0.3250 0.3500 0.4500 0.2647
39767 153 0.3000 0.2368 0.3500 0.1000 0.1167 0.0588
39767 155 0.0750 0.0263 0.0250 0.0500 0.0833 0.0000
39767 157 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0167 0.0000
39767 159 0.0250 0.0263 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000
39767 161 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0333 0.0000
39767 163 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
39767 165 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
39767 167 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
39767 175 0.0250 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000
58587 214 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0294
58587 217 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
58587 220 0.1000 0.0000 0.0000 0.2000 0.1000 0.0294
58587 223 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0167 0.0294
58587 225 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0333 0.0000
58587 226 0.6500 0.7750 0.7750 0.5750 0.5500 0.6765
58587 229 0.2000 0.0750 0.1750 0.2000 0.2000 0.2353
58587 232 0.0250 0.1250 0.0000 0.0000 0.0333 0.0000
58587 235 0.0250 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000
58587 238 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
58587 299 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0333 0.0000
124259 184 0.0000 0.0250 0.0278 0.0000 0.0000 0.0000
124259 186 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
124259 190 0.0263 0.0750 0.0556 0.0500 0.0333 0.0000
124259 192 0.0263 0.0250 0.0000 0.0000 0.0167 0.1563
124259 194 0.0526 0.0000 0.0556 0.0000 0.0333 0.0625
124259 196 0.1842 0.3750 0.2778 0.5000 0.1667 0.2500
124259 198 0.3947 0.2750 0.3889 0.3250 0.4000 0.3125
124259 200 0.1842 0.1500 0.1944 0.0750 0.2167 0.1250
124259 202 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0333 0.0000
124259 204 0.0526 0.0000 0.0000 0.0000 0.0667 0.0000
124259 206 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0333 0.0000
124259 208 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0625
124259 212 0.0263 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0313
124259 216 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000
124259 218 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
134079 159 0.0000 0.1579 0.0588 0.0000 0.0000 0.0000
134079 189 0.0000 0.0000 0.0588 0.0263 0.0167 0.0000
134079 192 0.0789 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
134079 195 0.2632 0.1053 0.1471 0.3684 0.0667 0.0714
134079 198 0.3421 0.3421 0.4118 0.2368 0.4333 0.3214
134079 201 0.0789 0.2105 0.0294 0.0000 0.2000 0.4643
134079 204 0.0263 0.1053 0.2059 0.1579 0.0667 0.0357
134079 207 0.0526 0.0526 0.0588 0.0526 0.0667 0.0000
134079 213 0.0263 0.0263 0.0000 0.0789 0.0167 0.0000
134079 216 0.0789 0.0000 0.0000 0.0526 0.0833 0.0357
134079 219 0.0000 0.0000 0.0294 0.0000 0.0000 0.0000
134079 222 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0714
134079 228 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
134079 234 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
134079 240 0.0000 0.0000 0.0000 0.0263 0.0167 0.0000
134079 270 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
230995 148 0.1750 0.1000 0.1500 0.2000 0.1500 0.0000
230995 151 0.0250 0.0000 0.0000 0.0250 0.0333 0.0000
230995 154 0.2000 0.2250 0.2500 0.2000 0.3167 0.4231
230995 157 0.2500 0.2750 0.2000 0.0500 0.2500 0.5769
230995 160 0.1250 0.0250 0.0750 0.0250 0.1000 0.0000
230995 162 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
230995 163 0.1250 0.2500 0.2500 0.1000 0.0833 0.0000
230995 166 0.0000 0.0500 0.0500 0.0250 0.0000 0.0000
230995 169 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
230995 175 0.0250 0.0250 0.0000 0.1000 0.0000 0.0000
230995 178 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
230995 184 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
230995 190 0.0250 0.0000 0.0250 0.1750 0.0167 0.0000
230995 193 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
230995 196 0.0000 0.0000 0.0000 0.1000 0.0000 0.0000
243906 196 0.0000 0.0000 0.0278 0.0000 0.0000 0.0000
243906 199 0.0000 0.0000 0.0833 0.0000 0.0000 0.0000
243906 202 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
243906 205 0.0500 0.0789 0.0000 0.0000 0.1250 0.0000
243906 208 0.2250 0.1579 0.3056 0.3500 0.0893 0.2308
243906 211 0.4250 0.3684 0.3611 0.0750 0.5893 0.7308
243906 213 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0179 0.0000
243906 214 0.2000 0.1579 0.1389 0.3750 0.0357 0.0000
243906 217 0.0000 0.1579 0.0556 0.1500 0.0179 0.0000
243906 220 0.0750 0.0789 0.0278 0.0500 0.1250 0.0385
297455 170 0.1250 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000
297455 174 0.1250 0.0250 0.0000 0.0250 0.0333 0.0000
297455 180 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
297455 186 0.2500 0.1250 0.1316 0.1000 0.2667 0.0000
297455 188 0.1750 0.2750 0.2368 0.0500 0.1833 0.4118
297455 190 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
297455 192 0.0750 0.0750 0.0789 0.0250 0.2833 0.2059
297455 194 0.0000 0.1500 0.1842 0.0250 0.0000 0.0000
297455 196 0.0000 0.0000 0.1053 0.0500 0.0000 0.0000
297455 198 0.0000 0.0250 0.0263 0.0250 0.0500 0.0000
297455 200 0.0500 0.0500 0.1316 0.1000 0.0500 0.0000
297455 202 0.0250 0.1000 0.0000 0.0000 0.0333 0.2353
297455 204 0.0250 0.0000 0.0263 0.2250 0.0167 0.0000
297455 206 0.0000 0.0250 0.0000 0.1250 0.0000 0.0000
297455 208 0.0750 0.0000 0.0263 0.0000 0.0333 0.1471
297455 210 0.0000 0.0250 0.0000 0.0750 0.0000 0.0000
297455 214 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
297455 218 0.0000 0.0000 0.0000 0.0500 0.0167 0.0000
297455 226 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000
297455 228 0.0000 0.0250 0.0000 0.0500 0.0000 0.0000
297455 230 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
297455 236 0.0000 0.0250 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000
297455 240 0.0000 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
297455 244 0.0000 0.0000 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000
297455 246 0.0000 0.0000 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000
297455 254 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
306436 276 0.0263 0.0000 0.0750 0.0000 0.0000 0.0000
306436 280 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.1000 0.0000
306436 282 0.1316 0.0263 0.0000 0.2000 0.0833 0.1000
306436 284 0.1842 0.0263 0.1000 0.1000 0.0833 0.5000
306436 286 0.1053 0.1579 0.0250 0.1750 0.1500 0.0000
306436 288 0.1053 0.0526 0.0250 0.0500 0.1167 0.0000
306436 290 0.0000 0.1053 0.1000 0.0250 0.0000 0.0000
306436 292 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0500 0.0000
306436 294 0.0000 0.0263 0.0000 0.0500 0.0333 0.0000
306436 296 0.0526 0.0789 0.0500 0.0250 0.0000 0.0000
306436 298 0.0000 0.0263 0.0000 0.1000 0.0667 0.0000
306436 300 0.0526 0.0000 0.0250 0.0000 0.0333 0.0000
306436 302 0.0526 0.0000 0.0500 0.0750 0.0167 0.2000
306436 304 0.0000 0.1053 0.1000 0.0250 0.0333 0.0000
306436 306 0.0789 0.1842 0.0500 0.0250 0.0667 0.2000
306436 308 0.0263 0.0526 0.0750 0.0250 0.0000 0.0000
306436 310 0.0263 0.1053 0.2000 0.0000 0.0000 0.0000
306436 312 0.0526 0.0263 0.1000 0.0000 0.0333 0.0000
306436 314 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
306436 316 0.0000 0.0263 0.0000 0.0250 0.0333 0.0000
306436 318 0.0526 0.0000 0.0000 0.0250 0.0167 0.0000
306436 322 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0333 0.0000
306436 324 0.0000 0.0000 0.0250 0.0250 0.0000 0.0000
306436 326 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000
306436 328 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
306436 332 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
306436 338 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0167 0.0000
344041 131 0.0263 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
344041 151 0.0263 0.0278 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000
344041 158 0.1053 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
344041 182 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0294
344041 251 0.3684 0.0833 0.3000 0.1250 0.4000 0.4412
344041 254 0.0000 0.0278 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
344041 257 0.0526 0.0556 0.0250 0.1250 0.1500 0.0000
344041 260 0.0526 0.0556 0.0000 0.1000 0.0500 0.0000
344041 263 0.0000 0.0000 0.0500 0.0250 0.0000 0.0000
344041 266 0.1842 0.5000 0.4000 0.4000 0.1500 0.1176
344041 269 0.0263 0.0556 0.0000 0.0500 0.0333 0.0000
344041 275 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
344041 278 0.0000 0.0278 0.0250 0.0000 0.0000 0.0000
344041 290 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0294
344041 293 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0588
344041 312 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0294
344041 328 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
344041 329 0.1579 0.1667 0.2000 0.1500 0.1667 0.2941
346977 165 0.0526 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
346977 169 0.1316 0.1750 0.0250 0.1750 0.0833 0.0000
346977 173 0.3421 0.2500 0.2750 0.0250 0.4000 0.2500
346977 177 0.4474 0.5500 0.6000 0.7250 0.4333 0.7500
346977 181 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
346977 189 0.0000 0.0000 0.0250 0.0250 0.0167 0.0000
346977 193 0.0263 0.0250 0.0750 0.0250 0.0333 0.0000
346977 197 0.0000 0.0000 0.0000 0.0250 0.0000 0.0000
346977 201 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0167 0.0000
상기 표 3의 39767은 표 2의 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 58587은 표 2의 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 124259는 표 2의 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 134079는 표 2의 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 230995는 표 2의 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 243906은 표 2의 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 297455는 표 2의 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 306436은 표 2의 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 344041은 표 2의 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 및 346977은 표 2의 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Microsatellite primer set for discriminating origin of Asian Gypsy Moth and uses thereof <130> PN15209 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agcgcttcct aattggttat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgcgtggtt ataactttca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgcagtcgaa tttaggcaaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttgaacaaag ccaatcggat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgacactgc accgtaaatt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atattgcgca tatgacccac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgaaagacga ctaaagcacg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gactcttgag caattgggtt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccatctgacc attgtgctat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgaggcacta tgtccttgat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acggaaccct aaaaatgaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttacctggaa tggtcgaata 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtgtgcgttc tgtggtatg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gtggactcgc tgtaacactc 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgtctgcgta ctatcatatt ga 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gttgtactgt tactcctcgc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtggcacgtg aacaaatata c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ctttgcttgt gggtgtcata 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cttgctggac ttatctgtgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acgtttttca gtgggtaggt 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트를 포함하는 한국, 몽골 또는 러시아의 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 한국, 몽골 또는 러시아의 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 한국, 몽골 또는 러시아의 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 한국, 몽골 또는 러시아의 아시아매미나방 원산지 판별을 위한 키트.
  5. 아시아매미나방의 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 PCR 증폭 산물을 유전자형질 분석(Genotyping)을 통해 아시아매미나방 원산지를 판별하는 단계를 포함하는, 한국, 몽골 또는 러시아의 아시아매미나방 원산지를 판별하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유전자형질 분석은 아시아매미나방의 대립유전자의 종류 및 빈도분석을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 한국, 몽골 또는 러시아의 아시아매미나방 원산지를 판별하기 위한 방법.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Annals of the Entomological Society of America, Vol.90, No.6, pp.768-775
Appl. Entomol. Zool. 37(2): 309-312 (2002)
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