CN113403367B

CN113403367B - 一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN113403367B
Application number: CN202110744364.0A
Authority: CN
Inventors: 杨锋; 梁萌萌; 余伟师
Original assignee: Suzhou Saifu Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Suzhou Saifu Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113403367A

Abstract

本发明提供了一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用。所述检测方法中在待测样本DNA中加入微生物绝对定量用参照DNA，经过两轮扩增之后，使用测序平台测序和基因组序列比对，实现所述待检测样本中微生物含量的绝对定量。所述检测方法能够快速建立原核生物，真核生物和真菌检测体系，降低检测成本，且灵敏度较高，是一种准确、可靠的能对单位质量样本中的微生物的含量进行绝对定量方法。

Description

一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物信息学和分子生物学检测领域，具体涉及一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用，尤其涉及一种微生物绝对定量用参照DNA、宏基因组绝对定量的检测方法及其应用。

背景技术

微生物组(microbiota)影响人类和动物的疾病和免疫、地球化学养分循环和植物生产力等多个方面。研究人员通过PCR扩增特定的组，包括细菌，古细菌，真核生物或真菌，以评估亚组(例如属)的相对丰度。然而，这既没有揭示亚组的绝对丰度，也没有比较不同的扩增子家族(即衍生自一对特定的PCR引物，例如细菌16S、真核生物18S或真菌ITS的OTUs)。这就阻碍了对特定群体绝对丰度的测定，而且微生物群落丰度的域水平的变化可能无法被检测到。

在过去的十年里，扩增子DNA测序显示，微生物群影响着人类的免疫、消化、心理健康以及植物的生长发育。这些在不同领域的研究揭示了不同微生物群之间的微妙关系，就植物而言，突出了土壤微生物群落对植物健康的重要性。环境微生物群落具有丰富的多种组成成分，通常通过标记基因的PCR扩增进行研究。然而，在大多数研究中，只研究了一个微生物组中某一类别(域)，如细菌。此外，大多数微生物组研究受到使用域特异性引物产生的PCR扩增子(来自单个环境样品的扩增基因)的限制，进而导致任何两组或两组以上PCR扩增子之间的定量比较丢失。

然而，为了揭示肠道、土壤和其他环境的真正复杂性，必须确定主要微生物群之间的数量关系。目前，16s和宏基因组测序研究中，菌群的数量和结构主要通过相对丰度来表示，然而基于相对值的菌群分析方法局限性较大。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种微生物绝对定量用参照DNA的制备方法，所述制备方法包括：

以人源基因组DNA为模板，以携带微生物结合位点的扩增引物对进行扩增、纯化，得到所述微生物绝对定量用参照DNA。

本发明设计了短的嵌合合成DNA片段，其中包含对三个主要微生物区域(原核生物、真核生物和真菌)具有特异性的通用引物结合位点。因此，所述扩增引物对包括原核参照引物对、真核参照引物对和真菌参照引物对，其中，各条引物的长度为37～46bp(例如可以是37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp或46bp等)，GC含量为40～60％(例如可以是40％、42％、44％、45％、46％、48％、50％、52％、55％、56％、57％、58％或60％等)。

所述携带微生物结合位点的扩增引物对为微生物参照引物对，其序列包括如SEQID NO.1～SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1：

CCTACGGGNGGCWGCAGGCAACTACAAGAGGCTGAATGC

SEQ ID NO.2：

GACTACHVGGGTATCTAATCCGGAGAAATGAGAGGCCTGATG

SEQ ID NO.3：

AGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAAGCCCAGCACCTCTCACC

SEQ ID NO.4：

GTGCCCTTCCGTCAATTCCATTCCATTGTGCCCTGTG

SEQ ID NO.5：

GCATCGATGAAGAACGCAGCTGTCTGAAGGCTGACTGAATAATCAAC

SEQ ID NO.6：

TCCTCCGCTTATTGATATGCACAGAGCCCTCCCACAGAGG

其中，碱基N表示A、C、G或T中的任意一种；碱基W表示A或T；碱基H表示A、C或T中的任意一种；碱基V表示A、C或G中的任意一种。

在PCR期间，由于存在合成填充区，这些合成DNA分子会产生各自的预期扩增子大小。将已知数量的合成DNA spikes直接添加到环境样本中，并计算它们在测序输出中的相对丰度，可以在扩增子类别之内和之间确定特定生物群的绝对丰度。

第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的制备方法制备得到的微生物绝对定量用参照DNA。

第三方面，本发明还提供一种宏基因组绝对定量的检测方法，所述检测方法包括：

(1)合成微生物参照引物对，并使用所述微生物参照引物对以人源基因组DNA为模板扩增得到如第二方面所述的微生物绝对定量用参照DNA；

所述微生物参照引物对包括原核参照引物对、真核参照引物对和真菌参照引物对，并且所述微生物参照引物对的序列包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

(2)提取待检测样本的DNA并进行定量，加入已知量的步骤(1)所述的参照DNA序列；

(3)合成微生物鉴定引物对，并使用所述的微生物鉴定引物对扩增步骤(2)所得DNA样本，纯化；

(4)使用测序平台兼容的PCR引物对步骤(3)所得样本进行扩增，再使用测序平台测序和基因组序列比对，实现所述待检测样本中微生物含量的绝对定量。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述微生物鉴定引物对包括：原核鉴定引物对，真核鉴定引物对和真菌鉴定引物对；

优选地，步骤(3)所述微生物鉴定引物对的序列包括如SEQ ID NO.7～SEQ IDNO.12所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.7：

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACGGGNGGCWGCAG

SEQ ID NO.8：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTACHVGGGTATCTAATCC

SEQ ID NO.9：

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG

SEQ ID NO.10：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGCCCTTCCGTCAATT

SEQ ID NO.11：

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCATCGATGAAGAACGCAGC

SEQ ID NO.12：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC

所述PCR引物包括一段数个至数十个碱基长度的标签序列，来自不同样本的扩增产物可以用带不同标签序列的PCR引物进行扩增，这样不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)所述PCR引物包括如SEQ ID NO.13～SEQ IDNO.16所示的核苷酸序列。

具体如下：

UNIPCRF(SEQ ID NO.13)：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC

UDIR0001(SEQ ID NO.14)：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCGCGGGTGACTGGAGTTCAGACGTG

UDIR0002(SEQ ID NO.15)：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGTTATAAGTGACTGGAGTTCAGACGTG

UDIR0003(SEQ ID NO.16)：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCAAGTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTG

本发明中，步骤(1)所述扩增与步骤(3)所述的扩增方法相同，所述扩增程序可以为95℃～98℃2～3min；94℃～96℃15～20s，55℃～60℃3～4min，30～35个循环；4℃～10℃保存；

本发明中，步骤(4)所述扩增程序可以为96℃～98℃2～3min；94℃～96℃8～12s，55～60℃25～35min，72℃25～35s，10～15个循环；4℃～10℃保存。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述扩增与步骤(3)所述的扩增方法相同，所述扩增程序为98℃2min；96℃20s，60℃4min，32个循环；10℃保存。

优选地，步骤(4)所述扩增程序为98℃2min；96℃10s，60℃30min，72℃30s，12个循环；10℃保存。

作为本发明优选的技术方案，所述基因组序列比对的方法包括：

根据通用引物将测序获得的序列进行样本归类，再根据序列的碱基组成将其归到微生物群类之中；

通过所述微生物绝对定量用参照DNA序列计数，对单位质量样本中的微生物含量进行绝对定量。

第四方面，一种试剂盒，所述试剂盒包括如第二方面所述的微生物绝对定量用参照DNA。

所述试剂盒包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

第五方面，如第一方面所述的制备方法、如第二方面所述的微生物绝对定量用参照DNA、如第三方面所述的检测方法或如第四方面所述的试剂盒在微生物样本鉴定中的应用。

如本文所用，缩写OTU指Operational taxonmiC unit，分类单元。

需要注意的是，本发明中所述“待测样本”或“待测样品”是指需要进行单细胞分析的物质，其可以来自于个体(如人或动物，更具体地如病人的血液、胸腔积液等)，也可以是其它来源的，例如一些经处理或未经处理的实验室材料、环境样本或人工合成的测试品。应理解，对“样本”或“样品”的检测并非仅涉及诊断和治疗目的，还可涉及其它非诊断和治疗目的。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种宏基因组绝对定量的检测方法，该检测方法使用长度和GC含量合适的引物对，扩增合成得到参照DNA；随后，在已知质量的微生物环境样本中加入一定量的所述参照DNA，通过扩增子扩增以及高通量高深度测序，通过数据分析进行OTU聚类统计，对单位质量样本中的微生物含量进行绝对定量；

(2)本发明中所述宏基因组绝对定量的检测方法，能够快速建立原核生物，真核生物和真菌检测体系，降低检测成本，相比传统QPCR平台，检测成本大大降低且检测通量较高，同时，所述方法采用数字计数进行定量，因此准确性大大提高，并且，采用单分子扩增产物测序的序列鉴定以及数字计数定量方法可以大大提高检测方法的灵敏度，实现准确、可靠的单位质量样本中的微生物含量进行绝对定量方法。

附图说明

图1为本发明中所述宏基因组绝对定量的检测方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1

本实施例提供一种微生物绝对定量用参照DNA，其制备方法包括如下步骤：

(1)基于人基因组设计三对长度和GC含量合适的优化序列的扩增引物；

且三对引物的5'端分别增加鉴定原核生物、真核生物和真菌的引物结合位点的核苷酸序列，所得微生物参照序列如SEQ ID NO.1～6所示；

引物信息见表1；

表1

(2)分别稀释原核参照引物F/R混合液、真核参照引物F/R混合液、真菌参照引物F/R混合液，各引物浓度均为2μM；取100ng人基因组DNA作为模板(所述模板的质量可以是10～100ng)进行PCR反应，反应体系20μL，包含10μL 2×HIFI multi PCR master mix，2μL Pmix引物混合液，2μL模板，6μL无菌水；

扩增体系如表2所示：

表2

试剂	体积(μL)
		2×HIFI multi PCR master mix	10
Pmix引物混合液	2
		人基因组DNA	2
无菌水	6
		总体积	20

其PCR程序如下表3所示：

表3

(3)所得产物使用DNA纯化磁珠试剂盒按1.8×比例对反应产物进行纯化，使用Nanodrop所得纯化产物进行精确定量(其中精确定量的方法还可以是qubit、QPCR等方法)；得到所述微生物绝对定量用参照DNA。

实施例2

本实施例中利用实施例1提供的参照DNA对微生物环境样本进行绝对定量检测，由图1所示，所述检测方法包括以下步骤：

S1、制备微生物绝对定量用参照DNA，即实施例1中所示的步骤；

S2、提取待检测样本中的DNA并进行定量；

S3、向待检测样本DNA中加入已知量的微生物绝对定量用参照DNA；

S4、合成微生物鉴定引物对；

S5、使用微生物鉴定引物对扩增混合样本并进行纯化；

S6、合成测序平台兼容的PCR引物；

S7、使用测序平台兼容的PCR引物扩增上述纯化后的产物；

S8、使用测序平台测序并进行基因组序列比对，实现待检测样本中微生物含量的绝对定量。

本实施例中提供的检测方法具体包括如下步骤：

(1)提取待检微生物环境样本DNA并进行定量，标记样本M1；

将总DNA均分成三份，按每1μg分别加入5pg、20pg、80pg实施例1中所述的参照DNA，标记为M1-1，M1-2，M1-3；

(2)使用微生物鉴定引物对对提取的DNA进行扩增及纯化回收，微生物鉴定引物对的各条引物信息见表4；

表4

(3)分别稀释原核鉴定引物F/R混合液、真核鉴定引物F/R混合液、真菌鉴定引物F/R混合液，各引物浓度均为2μM；

分别对200ng M1-1，M1-2，M1-3作为模板进行PCR反应(模板的质量可以是100～200ng)，反应体系20μL，包含10μL 2×HIFI multi PCR master mix，2μL Pmix引物混合液，2μL模板，6μL无菌水；

扩增体系如表5所示：

表5

其PCR程序为：98℃2min；32×(96℃20s，60℃4min)；10℃保存；

所得产物使用DNA纯化磁珠试剂盒按1.8×比例对反应产物进行纯化；

(4)使用带不同标签序列的illumina测序平台兼容的PCR引物UNIPCRF、UDIR0001～0003，各引物浓度均为2μM；

本实施例中使用的PCR引物序列如下：

UNIPCRF(SEQ ID NO.13)：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC

UDIR0001(SEQ ID NO.14)：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCGCGGGTGACTGGAGTTCAGACGTG

UDIR0002(SEQ ID NO.15)：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGTTATAAGTGACTGGAGTTCAGACGTG

UDIR0003(SEQ ID NO.16)：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCAAGTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTG

取纯化产物2μL作为模板进行PCR反应，反应体系20μL，包含10μL 2×HIFI PCRmaster mix，2μL Pmix，2μL纯化产物，6μL无菌水；

其PCR程序如下表6所示：

表6

对第二轮PCR扩增产物进行高通量双端测序，测序读长可为PE300 bp；

(5)对测序数据进行分析，实现测序序列的样本归类，基因组序列比对：首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到不同微生物群类之中，通过参照DNA序列计数，对单位质量样本中的微生物含量进行绝对定量；

结果分析：三个样本聚类统计及定量结果见表7；

表7

综上所述，各参照DNA拷贝数比例关系与实际加入的参照DNA比例一致，无显著性差异，判断定量结果准确，即本发明所述的检测方法实现了宏基因组样本的绝对定量。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州赛福医学检验有限公司

<120> 一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用

<130> 20210628

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

cctacgggng gcwgcaggca actacaagag gctgaatgc 39

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactachvgg gtatctaatc cggagaaatg agaggcctga tg 42

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agttaaaaag ctcgtagttg aaagcccagc acctctcacc 40

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgcccttcc gtcaattcca ttccattgtg ccctgtg 37

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcatcgatga agaacgcagc tgtctgaagg ctgactgaat aatcaac 47

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcctccgctt attgatatgc acagagccct cccacagagg 40

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcctacgg gnggcwgcag 50

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgactachv gggtatctaa tcc 53

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagttaaa aagctcgtag ttg 53

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgccctt ccgtcaatt 49

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgcatcga tgaagaacgc agc 53

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttcctccgc ttattgatat gc 52

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45

<210> 14

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caagcagaag acggcatacg agataaccgc gggtgactgg agttcagacg tg 52

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caagcagaag acggcatacg agatggttat aagtgactgg agttcagacg tg 52

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caagcagaag acggcatacg agatccaagt ccgtgactgg agttcagacg tg 52

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括微生物绝对定量用参照DNA；

所述试剂盒包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的PCR引物对。

3.根据权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于宏基因组绝对定量。