CN106065417A - 一种str分型系统及试剂盒 - Google Patents
一种str分型系统及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106065417A CN106065417A CN201610716314.0A CN201610716314A CN106065417A CN 106065417 A CN106065417 A CN 106065417A CN 201610716314 A CN201610716314 A CN 201610716314A CN 106065417 A CN106065417 A CN 106065417A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zna
- nucleotides
- seq
- nucleotide sequence
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于法医DNA检验分析领域,具体涉及用于微量生物样本STR分型的分型体系及试剂盒。本发明所述的一种STR分型体系,所述的STR分型体系分两组复合扩增和检测14个STR基因座。本发明将STR分型技术和ZNA引物相结合,提供了对不同人群的普遍适用性更高的STR基因座,使得1、STR分型技术更加适用于DNA微量和DNA高降解的检材,2、更加适用于多种类型的检材,3、使得分型结果的准确性更高。
Description
技术领域
本发明属于法医DNA检验分析领域,具体涉及用于微量生物样本STR分型的分型体系及试剂盒。
背景技术
自1985年英国遗传学家Alec.Jeffreys教授首次报道DNA指纹图技术应用于法医DNA分析以来,DNA分析技术已经在多起重大的刑事犯罪侦破和民事诉讼中发挥重要的作用。1987年该项技术成功应用到国内的法医物证鉴定中。二十余年来,法医DNA技术经历多位点DNA指纹图技术、扩增片段长度多态性分析技术、线粒体DNA测序技术三大技术革命,目前已发展到以荧光标记多基因座短串联重复序列(short tandem repeat,STR)复合扩增检测技术与线粒体DNA测序技术为主导的阶段。
STR是人类基因组中分布较为广泛的一类遗传标记,其核心序列一般由2~6个碱基组成,核心序列的重复单位数目不同导致同一基因座中存在不同的等位基因。STR的长度在人群中变异较大,构成了STR的遗传多态性,进而成为STR分析技术的生物学基础。STR目前在法医个人识别及亲子鉴定中得到了广泛应用,然而在实际案件侦破中,由于物理、化学以及天气等环境因素的影响,检材中DNA分子易发生降解、断裂,经常得不到完整的DNA分型甚至分型失败,这就给法医学分析带来了很大的困难。
此外,在实际的法医学检案工作中,由于环境因素等影响,使用的生物样本通常既是降解样本,同时往往也是低拷贝数((Low copy number,LCN)样本,即DNA含量少于100pg,相当于15个双倍体或30个单倍体细胞的生物样本。
为提高LCN生物样本的法医学STR分型的灵敏度和成功率,通常采用两种策略。一种是增加PCR反应的循环次数,提高STR基因座扩增成功率和产物量,而后进行DNA分析。虽然增加PCR循环数能够提高LCN样本的STR成功检出率,但存在以下风险:实验室环境和操作污染对样本STR分型的干扰作用变得更加明显;非特异产物大量积累,分型精确性大幅下降;分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、甚至丢失的现象。另一种策略是首先进行LCN样本的全基因组扩增,获取足量的DNA模板,而后进行STR分型。这种策略也存在一些实际应用的缺陷:发生等位基因丢失;针对特定类型检材的全基因组扩增技术尚不明确等。
目前常用的商品化STR复合扩增试剂盒,如ABI公司的IdentifilerTM以及Promega公司的等,均包括13个核心STR基因座。然而STR基因座的多态性在不同种族和人群中存在明显的差异,这些试剂盒中选取的STR基因座的主要是基于西方人群所选定的,在实际应用中并不一定适用于中国人群。
为解决上述问题,中国专利申请200410096613提供了一种通过复合扩增14个短串联重复序列基因座,来进行个人识别和亲子鉴定的荧光标记检验系统,该系统使用的DNA引物能够将相应基因座扩增产物控制在400个碱基(bp)的范围内,灵敏度达到0.125ng。但是由于其检测灵敏度的限制,难以实现对LCN样本的检测;其虽然是针对中国人群开发,但对于中国少数民族人群的分型效果不佳,不能满足分型对象的多样性要求;其所适用的检材类型比较有限,只是精斑、唾液斑、组织、血痕和血液,而在实际案检工作中,往往会面对各种不同类型的检材,因此该系统的应用受到限制,以上缺陷使其无法很好地满足实际案检工作的需求。
综上所述,虽然STR分型技术在法医DNA检验分析领域中有重要意义,然而目前建立起的商品化扩增系统或试剂盒多数是针对西方人群,少数适合中国人群的检测系统,一方面无法很好地满足对微量和高度降解生物样本的检测,另一方面对各类人群的普遍适用性较不佳,再一方面适用的检材类型不够多样,因此无法很好地满足实际案检工作的需求
发明内容
术语:除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明中的术语“dNTPs”指dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种单脱氧核糖核苷酸的混合物;本发明中的术语“ddH2O”指双蒸水。
由于提高PCR循环数将会导致的非特异产物大量积累,分型精确性大幅下降,分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、甚至丢失,因此在面对含有微量DNA的检材时,通过无限制地增加循环数来获得完整分型结果是不可行的。
Zip Nucleic Acids,简称ZNA,是一种新型的寡核苷酸衍生物,是通过在DNA分子的核苷酸上偶联阳离子环形结构的精胺衍生物Z unit而获得。Z unit的偶联部位既可以在DNA分子5'或者3'末端的核苷酸上,也可以位于中间部位的核苷酸上。虽然与DNA分子一样,ZNA分子也具有相同的严格配对选择性,然而目前并没有技术将ZNA分子用于遗传分型。
本发明的目的是提供一种STR分型体系和试剂盒,该体系基于ZNA引物,用于对其中DNA微量和/或高降解检材进行遗传分型,不仅适用于欧美人群,也更加适用于中国人群,适用的检材类型更加多样,具有更高的分型效能、精确性、种属特异性、和组织同一性。
本发明采取的技术方案是,一种STR分型体系,所述的STR分型体系分两组复合扩增和检测14个STR基因座,其中STR基因座D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435、D7S820、Amelogenin、D19S253、D9S2157和FGA在一组中同时进行PCR扩增和检测,基因座D1S1677、D19S433、D11S4463、CSF1PO和D13S317在另一组中同时进行PCR扩增和检测。
所述的STR分型体系中,14个STR基因座分别由四种荧光素标记,D14S1434、D9S1122、D13S317和D2S1776由VIC标记,D10S1435、D7S820和D11S4463由FAM标记,Amelogenin、D19S253和CSF1PO由TAMRA标记,D9S2157、FGA、D1S1677和D19S433由NED标记。
所述的STR分型体系中,包括扩增上述14个STR基因座的14对ZNA引物,所述的ZNA引物是以分别扩增每个基因座的一对DNA引物为基础,在其核苷酸序列中的特定位置核苷酸上偶联Z unit而获得,荧光素标记于每对ZNA引物中的一条的5’末端。
本发明中用于扩增上述14个STR基因座的14对DNA引物为:
本发明所述的扩增上述14个STR基因座的14对ZNA引物为:
用于扩增D14S1434的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:1所示的核酸序列从5’端起的第3、7、10、15、20和23个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第4、7、15和23个核苷酸中的任意2个或多个;
反向引物:SEQ ID NO:2所示的核酸序列从5’端起的第3、5、10、12和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第5、10、12和15个核苷酸中的任意2个或多个;
用于扩增D9S1122的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:3所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12、18和22个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第12、18和22个核苷酸中的任意2个或多个;
反向引物:SEQ ID NO:4所示的核酸序列从5’端起的第5、11、16和21个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D2S1776的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:5所示的核酸序列从5’端起的第4、8、10、12、16、20和24个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第4、8、12和20个核苷酸中的任意2个或多个;
反向引物:SEQ ID NO:6所示的核酸序列从5’端起的第3、6、10、12、15和20个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第3、10、12和15个核苷酸中的任意2个或多个;
用于扩增D10S1435的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:7所示的核酸序列从5’端起的第4、8、10、12、17和20个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第4、8、10和17个核苷酸中的任意2个或多个;
反向引物:SEQ ID NO:8所示的核酸序列从5’端起的第3、7、10、15、21、24和27个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第7、10、15、21和27个核苷酸中的任意2个或多个;
用于扩增D7S820的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:9所示的核酸序列从5’端起的第3、8、10、12、15和19个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第3、10和15个核苷酸中的任意2个或多个;
反向引物:SEQ ID NO:10所示的核酸序列从5’端起的第4、7、12、16、18和21个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第4、12和21个核苷酸中的任意2个或多个;
用于扩增Amelogenin的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:11所示的核酸序列从5’端起的第4、7、13、和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:12所示的核酸序列从5’端起的第3、10和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D19S253的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:13所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12和16个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:14所示的核酸序列从5’端起的第4、8、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第4、8和15个核苷酸中的任意2个或多个;
用于扩增D9S2157的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:15所示的核酸序列从5’端起的第3、7、9、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:16所示的核酸序列从5’端起的第4、8、16、19和24个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增FGA的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:17所示的核酸序列从5’端起的第5、11、16和22个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:18所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12、和19个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D1S1677的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:19所示的核酸序列从5’端起的第5、7、12、16和20个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第5、7和16个核苷酸中的任意2个或多个;
反向引物:SEQ ID NO:20所示的核酸序列从5’端起的第4、7、10、13和16个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第4、7、10和16个核苷酸中的任意2个或多个;
用于扩增D19S433的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:21所示的核酸序列从5’端起的第5、14和17个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:22所示的核酸序列从5’端起的第5、12和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D11S4463的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:23所示的核酸序列从5’端起的第5、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:24所示的核酸序列从5’端起的第6、9、14、18和23个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第6、14、18和23个核苷酸中的任意2个或多个;
用于扩增CSF1PO的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:25所示的核酸序列从5’端起的第5、14和19个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:26所示的核酸序列从5’端起的第5、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D13S317的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:27所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12、和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第3、7和15个核苷酸中的任意2个或多个;
反向引物:SEQ ID NO:28所示的核酸序列从5’端起的第5、11、16、18、22和24个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,其中偶联Z unit的位置优选为第5、11、16和22个核苷酸中的任意2个或多个。
本发明所述的STR分型体系中,还包括用于确定样品中每个基因座的等位基因的等位基因标准物。
本发明还提供了一种STR分型试剂盒,所述的STR分型试剂盒包含上述任意一种STR分型体系。
所述的STR分型体系或试剂盒中还包括DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、DNA提取试剂。
本发明所述的STR分型体系和试剂盒适用于所有包含DNA的检材,可以是但并不局限于包含DNA的血液、精斑、陈旧血痕、唾液斑、尿斑、牙齿、骨骼、软组织、鼻涕、痰液斑、呕吐物、口腔拭子、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞以及心脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、胰腺、脑、肠和胆等器官。
本发明还提供了上述STR分型体系或试剂盒在案件排查、个体识别以及尸源认定中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
目前公开的STR分型体系或试剂盒中,STR基因座选择在不同人群中相对并不均衡,本发明选择的STR基因座兼顾CODIS系统与非CODIS系统,同时适用于中国主要人群和欧美人群,也适用于中国少数民族人群。对其中非CODIS系统的STR基因座使用北、西北、西南、中南和华东汉族人群以及白族、傣族、满族、苗族、回族、纳西族、土家族、彝族、瑶族、壮族等少数民族群体样本进行多态性验证,并按照法医学DNA检验对STR基因座的要求,对上述基因座的以下法医学参数:个体识别力(DP)、非父排除率(EPP)、多态性信息含量(PIC)、预期杂合度(HE)、观察杂合度(HO)进行统计分析后,发现本发明提供的STR基因座在我国主要人群和上述少数民族人群中都具有高多态性。因此,本发明提供的STR分型体系或试剂盒不仅识别效力强,并且对不同人群的普遍适用性更强。
本发明提供的STR分型体系或试剂盒中的STR基因座的扩增产物长度小于200bp,更加适用于其中DNA高度降解的检材。
本发明提供的STR分型体系和试剂盒在PCR扩增时,当DNA模板量低至6.25pg时,仍能够获得清晰的扩增条带和完整分型结果,而使用相应DNA引物在相同扩增条件下,50pg的模板量的扩增条带就开始模糊不清。因此,本发明提供的STR分型体系和试剂盒具有相对更高的灵敏度。
本发明提供的STR分型体系和试剂盒所适用的检材类型更加多样,包括含有DNA的血液、精斑、陈旧血痕、唾液斑、尿斑、牙齿、骨骼、软组织、鼻涕、痰液斑、呕吐物、口腔拭子、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞以及心脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、胰腺、脑、肠和胆等器官,对于其他分型体系或试剂盒难以获得完整分型结果的牙齿、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞等类型的检材仍能够获得完整分型结果。因此能够更好地满足法医领域对特殊检材的分型需求。
本发明提供的STR分型体系和试剂盒具有严格的种属特异性和组织同一性,因此具有相对更高的分型准确性。
本发明设计的DNA引物或ZNA引物序列在扩增时不存在明显的竞争差异,使得扩增产物更加平衡、特异,能够获得清晰完整的分型结果,进行个体识别的准确度高。
本发明提供的STR基因座相应ZNA引物,其核苷酸序列以及Z unit的偶联部位的选择使得在复合扩增时,扩增产物更加平衡,特异性更高,从而获得完整以及更加正确的分型结果。
本发明提供的STR分型试剂盒中的STR基因座相应ZNA引物,其核苷酸序列以及Zunit的偶联部位的选择使得在复合扩增时,扩增产物更加平衡,特异性更高,从而使得分型结果更加准确。
综上所述,本发明将STR分型技术和ZNA引物相结合,提供了对不同人群的普遍适用性更高的STR基因座,使得1、STR分型技术更加适用于DNA微量和DNA高降解的检材,2、更加适用于多种类型的检材,3、使得分型结果的准确性更高。
附图说明
图1为实施例1中的基因座分型检测结果图。
图2为实验例2中的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行;所述试剂盒生物材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中ddH2O指双蒸水。
本发明中,DNA分子的Z unit偶联委托美国SA公司进行;PCR仪购自美国伯乐Bio-rad公司,型号为T100TM;ABI 3130xl遗传分析仪购自美国ABI公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs购自美国NEB公司;ROX-500DNA分子量标准购自克劳宁(北京)生物科技有限公司,货号为DSMR-100。
实施例1对5名不同志愿者进行基因座分型
1、检材采集:检材为志愿者血液,共5份。
2、模板DNA提取:采用Chelex-100法分别从5份不同志愿者的血液检材中提取模板DNA。
3、PCR扩增:
(1)、使用的ZNA引物为:
用于扩增D14S1434的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:1所示的核酸序列从5’端起的第7、15和23个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:2所示的核酸序列从5’端起的第5、10和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D9S1122的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:3所示的核酸序列从5’端起的第7和22个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:4所示的核酸序列从5’端起的第5、11和21个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D2S1776的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:5所示的核酸序列从5’端起的第4、8、12和20个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:6所示的核酸序列从5’端起的第6、10、15和20个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D10S1435的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:7所示的核酸序列从5’端起的第8和17个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:8所示的核酸序列从5’端起的第7、15、21、和27个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D7S820的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:9所示的核酸序列从5’端起的第3、10和15个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:10所示的核酸序列从5’端起的第4、12和21个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增Amelogenin的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:11所示的核酸序列从5’端起的第4和18个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:12所示的核酸序列从5’端起的第3和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D19S253的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:13所示的核酸序列从5’端起的第3、12和16个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:14所示的核酸序列从5’端起的第8和15个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D9S2157的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:15所示的核酸序列从5’端起的第3、9和18个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:16所示的核酸序列从5’端起的第8和24个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增FGA的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:17所示的核酸序列从5’端起的第5、16和22个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:18所示的核酸序列从5’端起的第7和19个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D1S1677的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:19所示的核酸序列从5’端起的第5和16个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:20所示的核酸序列从5’端起的第4、10和16个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D19S433的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:21所示的核酸序列从5’端起的第5和14个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:22所示的核酸序列从5’端起的第5和12个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D11S4463的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:23所示的核酸序列从5’端起的第5和15个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:24所示的核酸序列从5’端起的第6、14和18个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增CSF1PO的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:25所示的核酸序列从5’端起的第5、14和19个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:26所示的核酸序列从5’端起的第5、15和18个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D13S317的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:27所示的核酸序列从5’端起的第3和15个核苷酸上偶联Zunit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:28所示的核酸序列从5’端起的第5、16和22个核苷酸上偶联Z unit构成的ZNA序列。
上述14对ZNA引物其中:STR基因座D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435、D7S820、Amelogenin、D19S253、D9S2157和FGA的ZNA引物混合构成一组复合扩增ZNA引物,基因座D1S1677、D19S433、D11S4463、CSF1PO和D13S317的ZNA引物混合构成另一组复合扩增ZNA引物。
(2)、PCR扩增体系为:
采用上述两组复合扩增ZNA引物分别进行PCR扩增
10μL体系:
(3)、PCR扩增程序为:
95℃变性11min,然后94℃变性40-60s,62℃退火45-60s,72℃延伸1min,进行30个循环,最后60℃保温45min,4℃保存。
4、毛细管电泳检测:
以ROX-500作为DNA分子量内标,分别将上述两组PCR扩增产物或等位基因标准物1μL、甲酰胺9μL内标ROX-500 1μL混合后加入96孔板中,95℃变性3min,立即冰浴3min,离心后放入ABI 3130xl遗传分析仪进行电泳检测,其中1个志愿者的基因座分型检测结果如图1所示。
实验例1检材类型
1、检材采集:采集血液、精斑、陈旧血痕、唾液斑、尿斑、牙齿、骨骼、软组织、鼻涕、痰液斑、呕吐物、口腔拭子、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞以及心脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、胰腺、脑、肠和胆等器官检材。
2、模板DNA提取:同实施例1。
3、PCR扩增:同实施例1。
4、毛细管电泳检测:同实施例1。
检测结果:所有含有DNA的检材都能成功获得分型结果。
实验例2模板浓度
以D14S1434基因座为例,取实施例1中的1个志愿者的血液DNA作为模板,分别采用其ZNA引物和DNA引物,分别按照200、100、50、25、12.5、6.25pg的模板量进行PCR扩增,PCR扩增体系和扩增程序同实施例1,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图2所示。在相同扩增条件下,ZNA引物获得的扩增产物浓度明显高于DNA引物,且ZNA引物在模板量为6.25pg时仍然可以看到清晰的扩增条带,而DNA引物在相同条件下,50pg的模板量的扩增条带就开始模糊不清。其余基因座的模板浓度情况和D14S1434基因座相同。
实验例3种属特异性
采用猴、猪、狗、鸡、牛、兔、鱼的血液作为检材,按照实施例1分型方法进行检测,证明本发明所述的STR分型体系和试剂盒具有严格的种属特异性。
实验例4组织同一性
采用同一个体的心脏、肝、脾、肺、肾、肋软骨、口腔拭子、阴道拭子和皮肤等样品作为检材,按照实施例1分型方法进行检测,证明本发明所述的STR分型体系和试剂盒具有严格的组织同一性。
案例:
2013年3月,在北京某区发现了已完全白骨化的人体部分骨骸,经侦查机关认定是一起碎尸案,同时发现了可能是碎尸地点的第一现场。北京市公安局对该碎尸的肱骨及可疑现场的血痕进行了DNA检验,虽然血痕得到了STR检验结果,但肱骨未能检测到STR结果,因此无法进行同一认定。发明人受办案机关委托将上述两个检材用本发明提供的分型试剂盒进行检验,得到的分型结果完全一致,由于根据DNA检验认定了碎尸现场,为案件的最终侦破提供了重要的科学证据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种STR分型体系,其特征在于:所述的STR分型体系分两组复合扩增和检测14个STR基因座,其中STR基因座D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435、D7S820、Amelogenin、D19S253、D9S2157和FGA在一组中同时进行PCR扩增和检测,基因座D1S1677、D19S433、D11S4463、CSF1PO和D13S317在另一组中同时进行PCR扩增和检测。
2.如权利要求1所述的STR分型体系,其特征在于:所述的14个STR基因座分别由四种荧光素标记,D14S1434、D9S1122、D13S317和D2S1776由VIC标记,D10S1435、D7S820和D11S4463由FAM标记,Amelogenin、D19S253和CSF1PO由TAMRA标记,D9S2157、FGA、D1S1677和D19S433由NED标记。
3.如权利要求1所述的STR分型体系,其特征在于:所述的STR分型体系中,包括用于扩增14个STR基因座的14对ZNA引物。
4.如权利要求3所述的STR分型体系,其特征在于:所述的14对ZNA引物为:
用于扩增D14S1434的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:1所示的核酸序列从5’端起的第3、7、10、15、20和23个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,反向引物:SEQ ID NO:2所示的核酸序列从5’端起的第3、5、10、12和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D9S1122的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:3所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12、18和22个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:4所示的核酸序列从5’端起的第5、11、16和21个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D2S1776的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:5所示的核酸序列从5’端起的第4、8、10、12、16、20和24个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:6所示的核酸序列从5’端起的第3、6、10、12、15和20个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D10S1435的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:7所示的核酸序列从5’端起的第4、8、10、12、17和20个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:8所示的核酸序列从5’端起的第3、7、10、15、21、24和27个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D7S820的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:9所示的核酸序列从5’端起的第3、8、10、12、15和19个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:10所示的核酸序列从5’端起的第4、7、12、16、18和21个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增Amelogenin的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:11所示的核酸序列从5’端起的第4、7、13、和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
反向引物:SEQ ID NO:12所示的核酸序列从5’端起的第3、10和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D19S253的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:13所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12和16个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:14所示的核酸序列从5’端起的第4、8、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D9S2157的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:15所示的核酸序列从5’端起的第3、7、9、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:16所示的核酸序列从5’端起的第4、8、16、19和24个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增FGA的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:17所示的核酸序列从5’端起的第5、11、16和22个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:18所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12、和19个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D1S1677的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:19所示的核酸序列从5’端起的第5、7、12、16和20个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:20所示的核酸序列从5’端起的第4、7、10、13和16个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D19S433的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:21所示的核酸序列从5’端起的第5、14和17个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:22所示的核酸序列从5’端起的第5、12和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D11S4463的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:23所示的核酸序列从5’端起的第5、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:24所示的核酸序列从5’端起的第6、9、14、18和23个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增CSF1PO的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:25所示的核酸序列从5’端起的第5、14和19个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:26所示的核酸序列从5’端起的第5、15和18个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列;
用于扩增D13S317的一对ZNA引物为:
正向引物:SEQ ID NO:27所示的核酸序列从5’端起的第3、7、12、和15个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列,
反向引物:SEQ ID NO:28所示的核酸序列从5’端起的第5、11、16、18、22和24个核苷酸中的任意2个或多个上偶联Z unit构成的ZNA序列。
5.如权利要求1所述的STR分型体系,其特征在于:所述STR分型体系中,还包括DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs和DNA提取试剂。
6.如权利要求1所述的STR分型体系,其特征在于:所述STR分型体系中,还包括用于确定样品中每个基因座的等位基因的等位基因标准物。
7.一种STR分型试剂盒,其特征在于:所述的STR分型试剂盒包含权利要求1-6任意一项所述的STR分型体系。
8.权利要求1-6任意一项所述的STR分型体系在案件排查、个体识别以及尸源认定中的应用。
9.权利要求7所述的STR分型试剂盒在案件排查、个体识别以及尸源认定中的应用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610015062.9A CN105420400A (zh) | 2016-01-11 | 2016-01-11 | 用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物 |
CN2016100150629 | 2016-01-11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106065417A true CN106065417A (zh) | 2016-11-02 |
CN106065417B CN106065417B (zh) | 2018-08-31 |
Family
ID=55498935
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610015062.9A Pending CN105420400A (zh) | 2016-01-11 | 2016-01-11 | 用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物 |
CN201610716314.0A Active CN106065417B (zh) | 2016-01-11 | 2016-08-24 | 一种str分型系统及试剂盒 |
CN201610717316.1A Active CN106086223B (zh) | 2016-01-11 | 2016-08-24 | 一种基于zna引物的str分型试剂盒 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610015062.9A Pending CN105420400A (zh) | 2016-01-11 | 2016-01-11 | 用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610717316.1A Active CN106086223B (zh) | 2016-01-11 | 2016-08-24 | 一种基于zna引物的str分型试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (3) | CN105420400A (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108504744B (zh) * | 2018-03-14 | 2019-02-22 | 中国科学院北京基因组研究所 | 一种用于法医检测的微单倍型遗传标记及其试剂盒 |
CN111269991A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-06-12 | 广州万维泰生物科技有限公司 | 一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒 |
CN112266952B (zh) * | 2020-11-03 | 2023-11-03 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 针对疑难检材的补充str位点复合扩增试剂盒及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1724688A (zh) * | 2004-12-03 | 2006-01-25 | 公安部第二研究所 | 荧光标记短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统 |
CN101698890A (zh) * | 2009-11-26 | 2010-04-28 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统 |
CN102191311A (zh) * | 2010-03-10 | 2011-09-21 | 常州楚天生物科技有限公司 | 一种通用寡核苷酸序列库的构建及应用 |
CN102321748A (zh) * | 2011-08-11 | 2012-01-18 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种同时分析人基因组dna 22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用 |
CN103451311A (zh) * | 2013-09-24 | 2013-12-18 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用 |
-
2016
- 2016-01-11 CN CN201610015062.9A patent/CN105420400A/zh active Pending
- 2016-08-24 CN CN201610716314.0A patent/CN106065417B/zh active Active
- 2016-08-24 CN CN201610717316.1A patent/CN106086223B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1724688A (zh) * | 2004-12-03 | 2006-01-25 | 公安部第二研究所 | 荧光标记短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统 |
CN101698890A (zh) * | 2009-11-26 | 2010-04-28 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 22个基因座的荧光标记复合扩增检验系统 |
CN102191311A (zh) * | 2010-03-10 | 2011-09-21 | 常州楚天生物科技有限公司 | 一种通用寡核苷酸序列库的构建及应用 |
CN102321748A (zh) * | 2011-08-11 | 2012-01-18 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种同时分析人基因组dna 22个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用 |
CN103451311A (zh) * | 2013-09-24 | 2013-12-18 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种同时分析人基因组dna 26个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其使用方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
VALERIE MOREAU等: "Zip Nucleic Acids: new high affinity oligonucleotides as potent primers for PCR and reverse transcription", 《NUCLEIC ACID RESEARCH》 * |
夏邦勇等: "部分疑难二联体亲子鉴定浅析", 《实验与检验医学》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106086223B (zh) | 2019-06-07 |
CN106086223A (zh) | 2016-11-09 |
CN106065417B (zh) | 2018-08-31 |
CN105420400A (zh) | 2016-03-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109468384B (zh) | 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒 | |
CN103958696B (zh) | 多重核酸分析 | |
CN105934523A (zh) | 核酸的多重检测 | |
CN108026568A (zh) | 通过结合条形码标记的多核苷酸探针进行核酸分析 | |
CN105986015A (zh) | 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒 | |
US20130109023A1 (en) | Method and composition for nucleic acid amplification | |
CN110863056A (zh) | 一种人类dna精准分型的方法、试剂和应用 | |
CN109593862A (zh) | 一种获得中国人群男性个体年龄的方法和系统 | |
CN106065417B (zh) | 一种str分型系统及试剂盒 | |
CN108060237B (zh) | 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
CN110564861B (zh) | 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
CN108642208A (zh) | 一种樟属及其近缘属植物通用ssr分子标记及其开发方法和应用 | |
CN107841566A (zh) | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 | |
CN109971843B (zh) | 一种单细胞转录组的测序方法 | |
WO2011146942A1 (en) | Methods and kits to analyze microrna by nucleic acid sequencing | |
CN107988385B (zh) | 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 | |
CN106244717B (zh) | 一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统 | |
CN107849566A (zh) | 用于检测白粉病的方法和试剂盒 | |
CN108517364A (zh) | 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
CN107267600A (zh) | 一种富集brca1和brca2基因目标区域的引物、方法、试剂盒及其应用 | |
CN109072287A (zh) | Dna序列的靶标特异性rna转录方法 | |
CN105543388B (zh) | 基于21个线粒体snp位点的法医学快速检测试剂盒 | |
CN106282332B (zh) | 用于多重核酸测序的标签和引物 | |
CN110257489A (zh) | 一种基于二代测序的30个Multiple-allele SNP位点的检测技术体系 | |
CN113403367B (zh) | 一种宏基因组绝对定量的检测方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |