CN109593862A - 一种获得中国人群男性个体年龄的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种获得中国人群男性个体年龄的方法和系统，所述方法包括提取所述男性个体的DNA；获得所述DNA的9个CpG位点的甲基化率；将所述各CpG位点的甲基化率，采用R软件，对9个CpG位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，以获得所述中国人群男性个体年龄。本发明提供的方案能准确地获得中国人群男性个体的年龄，可以利用公安实战中犯罪现场遗留的生物检材血液或血痕样本，进行个体年龄的推断，将有利于快速锁定嫌疑人范围，为案件侦破提供线索，提高案件侦破速度。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得中国人群年龄的方法和系统，尤其涉及一种获得中国人群男性个体年龄的方法和系统。
背景技术
个体年龄推断一直是法医学的重要研究课题之一，个体年龄的评估目前主要是依据对骨骼、牙齿等组织以及组织中各类物质的物理和化学特性等随年龄增长的时序性变化。由于生物体各组织器官生长发育的生理性变化及其影响因素极为复杂,不同推断年龄的方法均有其应用价值，但也都存在一定的局限性。例如，1)公安部物证中心研究运用的六大关节推断骨龄，年龄适用于12～20岁，主要断定14、16、18三个年龄点；2)中国人掌骨推断年龄法即CHN，主要由国家体委研制开发，用于运动员年龄推断，但鉴定人需经过系统培训和反复练习；3)坐骨结节、髂脊推断年龄16～23岁；4)牙齿推断年龄6月～12岁。而在许多的案件现场残留的检材只有血液或血痕，使用上述方法则无法进行个体年龄的推断。
如何提供一种方法可以用于公安实战中犯罪现场遗留的生物检材血液或血痕样本，实现对于血液或血痕来源个体年龄的推断，将有利于快速锁定嫌疑人范围，为案件侦破提供线索，提高案件侦破速度，成为研究的热点。
已有研究者提出利用血液提取DNA，测定端粒DNA长度来判断个体年龄，端粒DNA长度与年龄的相关性已被众多的实验所证实，但端粒DNA长度在同一个体的不同细胞中的差别很大，具有组织特异性；而同一组织来源的细胞在各个年龄段的端粒DNA长度随年龄缩短的程度也不均衡。因此，利用这一指标预测年龄的跨度往往在5-10岁以上。也有研究者利用mtDNA氧化损伤来判断个体的年龄，进行性的线粒体DNA氧化损伤也已被证实与衰老有密切关系，然而mtDNA片段缺失或其它突变多采用基于PCR技术的检测方法和杂交技术，同样存在技术局限和判定年龄跨度大等问题。
众所周知，DNA甲基化是表观遗传中重要的一种化学修饰，是指DNA甲基转移酶催化胞嘧啶环第5位碳原子形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。人类单倍体基因组中约有5×107个CpG，它广泛分布在转座元件、其他重复的DNA和大多数功能基因的编码区，几乎所有的甲基化胞嘧啶都发生在CpG二核苷酸。
已有大量研究发现很多位点的DNA甲基化水平的改变与年龄相关性疾病，如代谢性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的发生等密切相关。随着DNA甲基化芯片的广泛使用，从基因组水平检测甲基化与年龄的相关性的报道越来越多。Hannum等通过检测来自高加索和西班牙人种的656名无关个体的血液样本中的甲基化标记，将预测年龄误差缩小到约为4岁，还通过检测不同组织样本的DNA甲基化水平，验证了年龄与甲基化的相关性。
然而在人体生长和衰老的过程中，不同正常组织中的DNA甲基化也会随着年龄的增长而发生差异，而且具有明显的组织差异性。同时DNA甲基化不仅具有组织特异性，还具有群体特异性。Fraser Hunterd等在全基因组水平上发现不同人群之间的DNA甲基化模式存在较大差异。目前，大多研究都是以欧美人群为研究对象，针对中国人群，尤其是中国人群中男性个体的研究几乎没有。
因此，如何提供一种能通过检测中国人群男性个体基因组DNA甲基化水平来获得中国人群男性个体年龄的方法和系统成为有待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种获得中国人群男性个体年龄的方法，通过获得所述男性个体的DNA的9个CpG位点的甲基化率，结合采用R软件，对9个CpG位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，以获得所述中国人群男性个体的年龄，实现了利用血液或血痕对个体年龄的推断。
本发明还提供了一种获得中国人群男性个体年龄的系统，利用该系统中的复合扩增检测体系能快速获得所述男性个体的DNA的9个CpG位点的甲基化率，进而利用回归模型，获得所述男性个体年龄。
本发明还提供了一种复合扩增检测体系，能快速获得所述男性个体的DNA的9个CpG位点的甲基化率，为获得所述男性个体的年龄提供数据支持。
本发明提供的获得中国人群男性个体年龄的方法，包括：
1)提取所述男性个体的DNA；
2)获得所述DNA以下9个CpG位点的甲基化率，所述9个CpG位点为：CpG1，CpG2，CpG3，CpG4，CpG5，CpG6，CpG7，CpG8和CpG9；
3)利用所述9个CpG位点中的甲基化率，采用R软件，对9个CpG位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，以获得所述中国人群男性个体年龄。
在本发明的方案中，所述回归模型可以为：
Y＝29.31+31.863*CpG1′–37.797*CpG2′–17.163*CpG3′–20.293*CpG4′+32.982*CpG5′+29.76*CpG6′+33.684*CpG7′–28.528*CpG8′+33.212*CpG9′，其中CpG1′，CpG2′，CpG3′，CpG4′，CpG5′，CpG6′，CpG7′，CpG8′和CpG9′分别为所述9个CpG位点的甲基化率。
在本申请的方案中，所述R软件是本领域常规的构建回归模型的软件，本领域技术人员可以根据需要利用该软件构建其他的模型，只要能满足其对年龄推断准确性的要求即可。
在本申请具体实施方式中，采用上述回归模型进行年龄的推断，其R2＝0.92，MAD＝2.89。在上述回归模型中，R2为相关系数或多元决定系数，表示拟合度，越大表示方程拟合度越好，其也代表模型的准确性,例如回归模型的准确率为92％，可以用于解释92％的年龄变化；MAD为平均绝对偏差，表示模型中预测年龄与实际年龄的差值的绝对值的平均值，值越小代表模型越准确。
进一步经申请人研究发现，采用回归模型进行年龄的推断，通过质谱检测法获得所述回归模型中所述9个CpG位点的甲基化率，能获得更准确的年龄推断结果。
根据本申请的具体实施方式，使用上述模型能实现对中国人群男性个体，尤其是汉族男性个体年龄的推断，并能对15到75岁个体进行年龄推断，推断的年龄的平均误差在2-5岁左右。
进一步的，所述步骤2)包括采用与所述9个CpG位点一一对应的9对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤。
更进一步的，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列。
更进一步的，其中步骤2)还包括在获得扩增产物后，使用质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率的步骤。质谱检测法(例如利用EpiTYPER甲基化检测平台检测的方法)为本领域常规的用于检测甲基化水平的方法，其使用方法为本领域已知的，实施该方法对于本领域技术人员来说是可以实现的。
本发明提供的一种获得中国人群男性个体年龄的系统，包括DNA提取体系，复合扩增检测体系，数据获取体系；
所述DNA提取体系用于提取所述男性个体的DNA；
所述复合扩增检测体系用于对所述DNA的9个CpG位点进行扩增，并利用扩增产物获得CpG位点的甲基化率，所述9个CpG位点为：CpG1，CpG2，CpG3，CpG4，CpG5，CpG6，CpG7，CpG8和CpG9；
所述数据获取体系用于由所述各CpG位点的甲基化率，采用R软件，对9个CpG位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，以获得所述中国人群男性个体年龄。
进一步的，在所述系统中，所述回归模型可以为：
Y＝29.31+31.863*CpG1′–37.797*CpG2′–17.163*CpG3′–20.293*CpG4′+32.982*CpG5′+29.76*CpG6′+33.684*CpG7′–28.528*CpG8′+33.212*CpG9′，其中CpG1′，CpG2′，CpG3′，CpG4′，CpG5′，CpG6′，CpG7′，CpG8′和CpG9′分别为所述9个CpG位点的甲基化率。
在本发明的一个方案中，所述复合扩增检测体系用于采用与所述9个CpG位点一一对应的9对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物，并利用所述扩增产物使用质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率。
进一步的，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列。
本发明提供的一种复合扩增检测体系，包括所述男性个体DNA，9个CpG位点，以及扩增引物，
所述复合扩增检测体系用于利用扩增引物扩增所述男性个体的DNA的9个CpG位点以获得扩增产物，并利用所述扩增产物通过质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率；
所述9个CpG位点为：CpG1，CpG2，CpG3，CpG4，CpG5，CpG6，CpG7，CpG8和CpG9；
所述扩增引物由与所述9个CpG位点一一对应的9对扩增引物组成，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测试剂盒，其特征在于，包括所述的复合扩增检测体系。
在本发明的方案中，本发明利用所述复合扩增检测体系进行9个CpG位点的甲基化率的方法，包括：1)将提取的所述男性个体DNA作为模板；2)使用所述扩增引物对作为模板的所述男性个体DNA进行PCR扩增反应以得到扩增产物；3)利用所述扩增产物通过质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率。
进一步的，在本发明的方案中，上述3)利用所述扩增产物使用质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率。
上述9个CpG位点的组合是申请人通过查阅大量参考文献，通过对中国人群，尤其是中国人群男性个体的生活环境、种族起源等进行综合分析,通过实验检测和数据分析，在已有研究的基础上获得的能进行年龄推断的特异性的CpG位点的组合。
进一步的，在本发明的方案中，所述男性个体为来自中国汉族人群的男性个体，所述男性个体的DNA样本为源自血样的DNA样本。
本发明的所述9个CpG位点的信息如表1所示：
表1
本发明提供的优选扩增引物序列如下。9对扩增引物用EpiDesigner online tool(http://www.epidesigner.com)设计，所述9对扩增引物及其相对应的CpG位点如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；
本发明的方案具有以下优点：
1、本发明方法和系统可以在涉外、反恐案件中，尤其对于在上述案件中提取到的男性血液或血痕样本进行年龄推断，推断犯罪嫌疑人或者受害人年龄范围，为案件的侦破提供线索，缩小搜查范围，提高破案效率。
2、本申请的方法和系统，采用9个CpG位点的组合，构成能对中国人群男性个体进行有效的复合扩增的检测体系，并结合使用质谱检测方法，能快速获得所述男性个体的DNA的9个CpG位点的甲基化率，为获得所述男性个体的年龄提供数据支持。
3、由实施例数据可以看出，本申请的方法和系统应用于中国人群中65名不同年龄的无关男性个体的年龄推断，推断结果与65名个体的已知年龄非常接近，说明由本发明的方法和系统可以比较准确地获得中国人群男性个体的年龄，实现了利用血液或血痕对个体年龄的推断。
4、根据本申请的具体实施方式，本申请针对两个回归模型的方案都能实现对中国人群男性个体，尤其是汉族男性个体年龄的推断，并能对15到75岁之间个体进行年龄推断，推断的年龄的平均误差在2-5岁左右，具有良好的推断准确性。
具体实施方式
中国人群中65名不同年龄的无关男性个体的血液样本来自于中国汉族健康男性个体。
实施例1采用本发明提供的方法和系统获得中国人群男性个体年龄
以下以一个男性个体为例来说明本发明方案的实施过程。
1、提取待检测个体的DNA作为模板
使用DNA blood midi试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)分别提取上述一个男性个体的DNA溶液。
2、对提取的DNA模板进行PCR扩增反应
2.1、引物池配置
扩增引物池的配置，其中所述扩增引物组中为所述9个CpG位点一一对应的9对扩增引物，每对扩增引物能扩增待检测DNA上包括其相应的CpG位点；本实施例中，优选的，所述9个CpG位点的扩增引物组为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.2、PCR反应
本实施例使用具有96孔PCR板的Eppendorf ProS型PCR仪进行PCR反应。
(1)配置PCR反应液(5μL反应体系)
将上表中的PCR反应液添加到96孔PCR板反应孔中，在Eppendorf ProS型PCR仪上进行PCR扩增。
由于针对本申请9个CpG位点的引物的稀释包括以下步骤：所有引物加入不含核酸酶的水(Nuclease-free water)配置成100μM浓度引物，常温下溶解半小时以上保证引物完全溶解于水中，4℃保存继续溶解一天。将正反向引物配对配置成引物溶液，浓度为1μM。序号为1、2的CpG位点的引物序列是相同的；序号6、7CpG位点的引物序列一样。因此，上述PCR反应液可以根据引物序列的不同分为7组，即有7个单独的PCR体系，每个PCR反应体系按照上表进行配置。
(2)扩增程序
2.3、SAP反应：将5μl扩增产物内加入2μl SAP MIX(0.3μl SAP Enzyme，1.7μlNuclease-free water)，反应条件为：37℃20min，85℃5min，4℃保存。
取1.5g琼脂糖，100mL的1×TBE电泳缓冲液，gel red染料配置1.5％琼脂糖凝胶。每对引物随机抽检8个样本，取3ul PCR/SAP产物，Loading Buffer 1ul上样，120V电压电泳30min。
按照表格3配置T cleavage Transcription/RNase反应液。
表格3 T cleavage Transcription/RNase反应液
| 单个反应体积(μl) | |
| 不含核酸酶的水 | 3.15 |
| 5*T7聚合酶缓冲液 | 0.89 |
| T cleavage Mix | 0.24 |
| DTT,100mM | 0.22 |
| T7RNA&DNA聚合酶 | 0.44 |
| RNase A | 0.06 |
| 总体积 | 5.00 |
每个反应孔内加入5μl的T cleavage Transcription/RNase反应液及2μlSAP产物，37℃孵育3小时，4℃保存。
加入树脂，摇晃15min纯化DNA后，3200g离心5min，利用MassARRAY NanodispenserRS1000点样后，利用EpiTYPER甲基化检测平台进行甲基化水平检测。
4、所述男性个体的9个CpG位点的甲基化率结果
5、将所述各CpG位点的甲基化率利用回归模获得男性个体的年龄。
利用回归模型:Y＝29.31+31.863*CpG1′–37.797*CpG2′–17.163*CpG3′–20.293*CpG4′+32.982*CpG5′+29.76*CpG6′+33.684*CpG7′–28.528*CpG8′+33.212*CpG9′，获得该男性的年龄(Y)为19.572岁；
已知该男性的年龄为20岁，说明利用本申请方案获得的该男性年龄与其实际年龄非常接近。
实施例2
利用实施例1相同的方法和系统，采用相同的步骤对全部的65名不同年龄的无关中国人群男性个体的年龄进行推断。来检验上述系统的准确性，结果如下表所示：
由本实施例方法获得的男性个体的年龄误差范围在2-5岁左右，说明由本发明方法和系统能对15到75岁个体进行年龄推断，并具有较好的准确性，能为案件侦破提供数据支持。
序列表
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种获得中国人群男性个体年龄的方法和系统
<130> 176297GF
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggaagagag ggttttttat tttgtgggga gttt 34
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcaaaacccc ttctcctata ctcaac 56
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggaagagag ggttttttat tttgtgggga gttt 34
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcaaaacccc ttctcctata ctcaac 56
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggaagagag aggtttttgg gatattggta ttgat 35
<210> 6
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttttaaaaac attccaaatc ctttcc 56
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggaagagag gagaaagaag gtgagaaaga tagagtattt 40
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcaaaaatct atcaaaacca aaaacc 56
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggaagagag tttttggtaa gggggttttt tatta 35
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaacccctc aaaacctaac aatct 55
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggaagagag ttttttggag aagtaaggat tttttt 36
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttactatccc aaaccccttt ctctaa 56
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggaagagag ttttttggag aagtaaggat tttttt 36
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttactatccc aaaccccttt ctctaa 56
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggaagagag agggttataa gttttgtttt gatga 35
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcaacatttc tacaacttca attaacca 58
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggaagagag ggaatagagt tatttttttt taatgtgtg 39
<210> 18
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccctctccc acaaaaacct c 51
Claims (10)
1.一种获得中国人群男性个体年龄的方法，其特征在于，包括：
1)提取所述男性个体的DNA；
2)获得所述DNA以下9个CpG位点的甲基化率，所述9个CpG位点为：CpG1，CpG2，CpG3，CpG4，CpG5，CpG6，CpG7，CpG8和CpG9；
3)利用所述9个CpG位点中的甲基化率，采用R软件，对9个CpG位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，以获得所述中国人群男性个体年龄。
2.根据权利要求1所述的方法，所述回归模型为：
Y＝29.31+31.863*CpG1′–37.797*CpG2′–17.163*CpG3′–20.293*CpG4′+32.982*CpG5′+29.76*CpG6′+33.684*CpG7′–28.528*CpG8′+33.212*CpG9′，其中CpG1′，CpG2′，CpG3′，CpG4′，CpG5′，CpG6′，CpG7′，CpG8′和CpG9′分别为所述9个CpG位点的甲基化率。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)包括采用与所述9个CpG位点一一对应的9对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)还包括在获得扩增产物后，使用质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率的步骤。
6.一种获得中国人群男性个体年龄的系统，其特征在于，所述系统包括DNA提取体系，复合扩增检测体系，数据获取体系；
所述DNA提取体系用于提取所述男性个体的DNA；
所述复合扩增检测体系用于对所述DNA的9个CpG位点进行扩增，并利用扩增产物获得所述CpG位点的甲基化率，所述9个CpG位点为：CpG1，CpG2，CpG3，CpG4，CpG5，CpG6，CpG7，CpG8和CpG9；
所述数据获取体系用于由所述各CpG位点的甲基化率，采用R软件，对9个CpG位点与年龄进行回归分析，构建回归模型，以获得所述中国人群男性个体年龄。
7.根据权利要求6所述的系统，所述回归模型为：
Y＝29.31+31.863*CpG1′–37.797*CpG2′–17.163*CpG3′–20.293*CpG4′+32.982*CpG5′+29.76*CpG6′+33.684*CpG7′–28.528*CpG8′+33.212*CpG9′，其中CpG1′，CpG2′，CpG3′，CpG4′，CpG5′，CpG6′，CpG7′，CpG8′和CpG9′分别为所述9个CpG位点的甲基化率。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述复合扩增检测体系用于采用与所述9个CpG位点一一对应的9对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物，并利用所述扩增产物使用质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列。
10.一种复合扩增检测体系，其特征在于，所述体系包括所述男性个体DNA，9个CpG位点以及扩增引物，
所述复合扩增检测体系用于利用扩增引物扩增所述男性个体的DNA的9个CpG位点以获得扩增产物，并利用所述扩增产物通过质谱检测法获得所述9个CpG位点的甲基化率；
所述9个CpG位点为：CpG1，CpG2，CpG3，CpG4，CpG5，CpG6，CpG7，CpG8和CpG9；
所述扩增引物由与所述9个CpG位点一一对应的9对扩增引物组成，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列。
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